基于血清exosomalmicroRNAs的结直肠癌转移检测的引物和试剂盒的制作方法

文档序号:11838334阅读:来源:国知局

技术特征:

1.检测miR-483-5p与miR-451a组合的试剂在制备基于血清exosomal microRNAs检测结直肠癌转移试剂中的应用,其中miR-483-5p、miR-451a的碱基序列分别如SEQ ID:1,SEQ ID:2。

2.一种基于血清exosomal microRNAs检测结直肠癌转移的引物,包括miR-483-5p的逆转录引物的序列如SEQ ID:3,miR-483-5p的上游引物序列如SEQ ID:4,miR-483-5p的下游引物序列如SEQ ID:5,miR-451a的逆转录引物的序列如SEQ ID:6,miR-451a的上游引物序列如SEQ ID:7,miR-451a的下游引物序列如SEQ ID:8。

3.一种基于血清exosomal microRNAs检测结直肠癌转移的试剂盒,其特征是:包括miR-483-5p的逆转录引物的序列如SEQ ID:3,miR-483-5p的上游引物序列如SEQ ID:4,miR-483-5p的下游引物序列如SEQ ID:5,miR-451a的逆转录引物的序列如SEQ ID:6,miR-451a的上游引物序列如SEQ ID:7,miR-451a的下游引物序列如SEQ ID:8,内参基因miR-191-5p逆转录引物序列如SEQ ID:9、内参基因miR-191-5p上游引物序列如SEQ ID:10、内参基因miR-191-5p下游引物序列如SEQ ID:11、内参基因U6逆转录引物序列如SEQ ID:12、内参基因U6上游引物序列如SEQ ID:13、内参基因U6下游引物序列如SEQ ID:14和PCR反应液。

4.如权利要求3所述的试剂盒,其特征是:所述PCR反应液由Syber Green Ⅰ荧光染料、DNA聚合酶、dNTPs、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、氯化钾、氯化镁和水组成。

5.如权利要求3所述的试剂盒,其特征是:各物质的浓度如下:miR-483-5p的逆转录引物:10nM,miR-483-5p的上游引物:10nM,miR-483-5p的下游引物:10nM;miR-451a的逆转录引物:10nM,miR-451a的上游引物:10nM,miR-451a的下游引物:10nM;内参基因miR-191-5p逆转录引物:10nM,内参基因miR-191-5p上游引物:10nM,内参基因miR-191-5p下游引物:10nM;内参基因U6逆转录引物:10nM,内参基因U6上游引物:10nM,内参基因U6下游引物:10nM。

6.如权利要求4所述的试剂盒,其特征是:各物质的浓度如下:1×Syber Green Ⅰ荧光染料、DNA聚合酶:100U/mL;dNTPs:0.2mM;氯化镁:6mM;三羟甲基氨基甲烷盐酸盐:16.5mM;氯化钾:89.3mM。

7.权利要求2所述的基于血清exosomal microRNAs检测结直肠癌转移的引物或权利要求3-6任一所述的基于血清exosomal microRNAs检测结直肠癌转移的试剂盒在定性或定量检测血清exosomal microRNAs表达量中的应用。

8.一种检测miR-483-5p、miR-451a表达量的方法,其特征是:步骤如下:

(1)提取血清样本中的exosomes;

(2)分离exosomes中的总RNA:

(3)RT-qPCR扩增:将步骤(2)分离的RNA进行反转录成cDNA,取cDNA为模板,加入权利要求2所述的引物和权利要求4或6所述的PCR反应液,进行PCR反应,检测样本阈值Cq;同时提取人结直肠癌细胞株SW480RNAs,逆转录成cDNA作为校对样本,在每个PCR反应板中进行检测,记录Cq值;内参基因miR-191-5p、U6的RT-qPCR扩增;

(4)制作标准曲线:步骤(3)检测完成后,拷贝数以10为底取对数作为横坐标,Cq值为纵坐标作图,绘制标准曲线,计算斜率Slope,然后根据公式E=10(-1/Slope)-1,计算扩增效率E;

(5)计算:选中样本和校对样本检测孔,应用实时荧光定量PCR仪的随机软件得出样本阈值Cq(T)和校对样本阈值Cq(C),根据公式Q=(E+1)-△Cq,△Cq=[Cq(T)-Cq(C)],得出基因的校正起始拷贝数Q;将miR-483-5p、miR-451a的Q值与内参基因的Q值的几何平均数相比,得到miR-483-5p、miR-451a的相对表达量。

9.如权利要求8所述的方法,其特征是:所述步骤(1)的具体步骤为:取250μl血清加入63μl ExoQuickTMExosomePrecipitation Solution试剂,震荡混匀,于室温下孵育30min,4℃,1500g,离心30min,弃上清,用25μl PBS重悬直至沉淀。

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