一种EPS形成相关基因检测实验方法与流程

本发明属于生物化学技术领域，具体地说，涉及一种EPS形成相关基因检测实验方法。

背景技术：

基因(Gene，Mendelian factor)是指携带有遗传信息的DNA或RNA序列(即基因是具有遗传效应的DNA或RNA片段)，也称为遗传因子，是控制性状的基本遗传单位。基因通过指导蛋白质的合成来表达自己所携带的遗传信息，从而控制生物个体的性状表现。

基因检测是通过血液、其他体液或细胞对DNA进行检测的技术，是取被检测者脱落的口腔黏膜细胞或其他组织细胞，扩增其基因信息后，通过特定设备对被检测者细胞中的DNA分子信息作检测，预知身体患疾病的风险，分析它所含有的各种基因情况，从而使人们能了解自己的基因信息，从而通过改善自己的生活环境和生活习惯，避免或延缓疾病的发生。

基因检测可以诊断疾病，也可以用于疾病风险的预测。疾病诊断是用基因检测技术检测引起遗传性疾病的突变基因。目前应用最广泛的基因检测是新生儿遗传性疾病的检测、遗传疾病的诊断和某些常见病的辅助诊断。目前有1000多种遗传性疾病可以通过基因检测技术做出诊断。目前还没有一种EPS形成相关基因检测实验方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种EPS形成相关基因检测实验方法。

其具体技术方案为：

一种EPS形成相关基因检测实验方法，包括以下步骤：

步骤1、刚果红平板法定性生物膜形成菌株

从-80℃冰箱中取出菌株，复苏于LB平板上，37℃，培养20h，然后挑取一个单菌落复壮于LB平板上，37℃，培养20h，再从中挑取一个单菌落接种于刚果红平板中，37℃，培养18h，然后置于室温下72h，观察菌落生长情况；

步骤2金黄色葡萄球菌在玻璃材料上静置成膜

2.1活化

取-80℃冻存菌株，LB平板划线，37℃倒置过夜培养，第二天挑单克隆37℃LB液体培养基摇床培养过夜；

2.2扩大培养

将过夜培养的金黄色葡萄球菌以1∶1000的比例加入新的100mL LB培养基中，37℃摇床培养，每隔30min测一次OD₆₀₀，待OD₆₀₀值达到1.0，用无菌的LB液体培养基将菌稀释到OD 0.6；

2.3静置成膜

取6孔板，每孔放一个无菌的盖玻片，每孔添加3mL菌液，37℃静置培养过夜；

步骤3、总RNA提取

3.1收菌

用1.5mLRNA free的EP管，8000rpm 5min收菌，弃上清，1×TE洗菌体一次；

3.2菌体裂解

每管加0.5mL Trizol，匀悬菌体，每管再加入Triton X-100(终浓度0.2％)，用移液枪吹匀，100℃25min，迅速转移至冰浴；

3.3 RNA抽提

加等体积的氯仿，盖紧离心管盖，用力震荡，直至充分乳化，溶液呈乳白色状后再室温静置5min，12000r/min 4℃10min离心；此时裂解液分为三层，即：无色的上清液，中间的白色蛋白层及带有颜色的下层有机相；吸取无色上清液转移至另一新的1.5mL RNA free的EP管中(切勿吸出白色中间层)；

3.4沉淀RNA

每管加1/10体积3M醋酸钠(pH 2)和2倍体积预冷无水乙醇，-20℃放置20min，12000r/min 4℃10min离心；

3.5漂洗

小心彻底弃去上清(去上清后，再短暂离心一次水将剩余的水收集到管底后去除)，加入75％的乙醇1mL，轻轻上下颠倒洗涤离心管，至沉淀块漂浮后，12000rmp 4℃离心10min，小心弃去乙醇；用无水乙醇再洗一次(去上清后，再短暂离心一次水将剩余的水收集到管底后去除)；

3.6干燥样品

室温晾干2-5min；

3.7溶解RNA样品

加入适量DEPC水溶解沉淀，用移液枪轻轻吹打沉淀后，放冰上溶解30min左右；

3.8浓度检测

取2μL总RNA溶液，加入198μL纯水，紫外分光光度计检测浓度及纯度；

测得RNA浓度后，取1μg进行逆转录，多余RNA放于-80℃冰箱备用

步骤4总RNA反转录

按照下列体系加入到无RNA酶的PCR管中

70℃反应5min，冰上冷却2min，瞬时离心；

再按照下列体系一次加入

5×buffer 4μL

RNAsin 0.5μL

M-MLV 1μL

25℃10min，42℃50min，95℃5min；

加入30μL DEPC水，取2μL做为模板

步骤5、PCR扩增基因片段

51引物设计

根据NCBI中基因序列，设计基因引物片段：

送上海生工合成；

52取灭菌的PCR薄壁管，按如下顺序依次加入如下试剂：

53PCR参数如下：

步骤6、聚丙烯酰胺凝胶电泳检测

6.1溶液配制

6.1.1 10×TBE缓冲液

108g Tris碱

55g硼酸

40mL 0.5mol/L EDTA，pH8.0

加水至1L

用时以无菌水稀释；

6.1.2 30％丙烯酰胺凝胶溶液

29g丙烯酰胺+甲叉双丙烯酰胺1g加水至100mL，37℃溶解，置于棕色瓶中4℃保存；

6.1.3 10％过硫酸铵(APS)

1mgAPS加9mL水，4℃保存一周；现用现配；

6.1.4银染色溶液的组成：

固定液：10％乙醇

氧化液：1％硝酸

染色液：0.1％硝酸银

显色液：2％碳酸钠：无水碳酸钠6g，硫代硫酸钠0.3mg，溶于300mL纯水中，用时加入37％甲醛0.4mL；

终止液：4％醋酸

6.2聚丙烯酰胺凝胶的制备、点样与电泳

6.2.1电泳装置的准备：

将聚丙烯酰胺垂直电泳槽中的凝胶玻璃板充分洗净；

晾干后小心装入制胶固定架

隔条玻璃片在内、短玻片在外固定于制胶支架上；

6.2.2聚丙烯酰胺凝胶的制备(8％PAGE)：

6.2.3灌胶、点样

将胶混匀后快速加入玻璃板夹层中，插入梳子，注意不要产生气泡；

待胶凝固后(1h以上)，拔掉梳子，用水冲洗加样孔，然后用吸水纸吸去水分(目的是防止电泳后条带不整齐；因为梳齿所残留的丙烯酰胺在加样孔聚合产生不规则表面，引起DNA带变形)；

将凝胶固定在电泳槽里，短玻片靠近槽内固定架；

点样，加DNA Marker；

6.2.4电泳

向胶槽中加入电泳缓冲液(0.5×TBE)，250V电泳至溴酚蓝加样缓冲液适当位置时(约2h)停止电泳；

6.2.5回收垂直电泳槽中的电泳缓冲液，卸下玻璃板；将其置于染色缸内，用拨胶铲小心地将短玻片撬起，平稳拿开并放回原处；有时凝胶扔附着在隔条玻璃板上，可用拨胶铲沿隔条小心切割使之分离；

6.3聚丙烯酰胺凝胶中DNA的染色(银染法)

6.3.1漂洗：

将染缸中的凝胶，用蒸馏水冲洗一次；

6.3.2固定：

加入10％乙醇固定10min，弃去固定液，水洗3min；

6.3.3氧化：

加入1％硝酸，氧化3min，弃去氧化液；用水漂洗2次，每次10s；

6.3.4染色：

加入0.1％AgNO3，放在脱色摇床上，15-30min后，将硝酸银倒掉，用水冲洗15s；

6.3.5显色：

用2％NaCO3显色，待条带清晰后将溶液倒掉，然后加入4％乙酸溶液终止显色；乙酸可回收待用；

6.3.6胶浸泡水中至拍照或扫描；

步骤7、Real-time PCR检测SluxS和icaD基因表达

采用2步法，以16sDNA为内参

7.1体系：

7.2程序：

引物的设计采用Primer5，目的基因引物及产物大小如下：

统计学分析采用的是相对定量，采用RQ＝2^-△△CT进行计算相对表达量；数据分析用的是EXCLE，作图用的是Graphpad prism 5软件；

取表达量最高的两对引物，做普通PCR，扩增产物送上海生工测序；

步骤8、Western Blot检测SluxS和icaD基因表达

总蛋白提取

8.1将40mL菌液在12000g，4℃下离心15min收集菌体，沉淀用PBS悬浮洗涤2遍，沉淀加入1mL裂解液悬浮菌体；

8.2超声粉碎，采用300w，10s超声/10s间隔，超声20min，反复冻融超声3次至菌液变清或者变色；

8.3 1000g离心去掉大碎片；

8.4测定蛋白质浓度：采用碧云天BAC蛋白浓度测定试剂盒；

8.5样品中加入loading buffer，100℃ 5min，分装放于-80℃保存；

SDS-PAGE：

8.7上样：12％电泳胶，将蛋白样品与SDS蛋白上样缓冲液混合后于100℃处理5min，每条泳道上样100μg细胞总蛋白；

8.8电泳：电泳时浓缩胶电压为70V；当溴酚蓝品进入分离胶时，电压为110V；根据预染Marker和目的蛋白的分子量大小的相对位置判断最佳跑胶时间；

转膜：

8.9将PVDF膜放到甲醇中浸泡2min；

8.10将转膜夹打开，在代表负极的黑色面铺上一块转膜液湿润的海绵垫，再添加2层转膜液湿润的滤纸，将SDS-PAGE胶小心地铺在滤纸上，表面再覆盖大小合适的PVDF膜；然后再覆盖两层湿润滤纸，再垫上湿润的海绵垫，将红色的正极板合上，夹好，插入转膜槽相应的位置；

8.11转膜过程在冰水混合浴中进行，采用100V，时间根据蛋白分子量而定；

8.12 TBST洗膜，5min×3次；

8.13封闭：一般抗体采用5％脱脂奶粉+TBST封闭；封闭时间为室温下一个小时，在摇床上进行；

8.14一抗孵育：在一个1.5ml的EP管中加入1mL的封闭液(5％脱脂奶粉+TBST)，再加入适量的一抗(Bcl2L2为1∶100；MCL1为1∶100；actin为1∶2000)，置于4℃冰箱中过夜；

8.15洗膜：将过夜杂交的膜从塑料袋中取出，投入含有足量体积TBST的洗膜盒中，于摇床上清洗，每次10min，连续3次；

8.16二抗孵育：处理步骤类似一抗杂交步骤，不同之处在于二抗杂交可在常温下，1h内完成；二抗比例控制在羊抗鼠1∶4000；羊抗兔1∶2000；

8.17洗膜：和步骤8.15相同；

显影：

将膜平放于干燥的平面上，将新鲜配置好的ECL Reagent滴加到有铅笔记号标注的膜面上，反应5分钟后用滤纸在膜的边缘尽量吸去多余的ECL Reagent，将膜平放到压片暗合中，在其上面放一张剪角标记的胶片，进行压片，5min后，取出在显影液里显影15s，水洗净后，进行定影。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明的方法操作简便、结果准确，WB检测结果与RT-PCR检测结果的趋势基本一致。

附图说明

图1是聚丙烯酰胺凝胶电泳检测银染结果；

图2是聚丙烯酰胺凝胶电泳检测灰度分析结果；

图3是琼脂糖凝胶电泳结果；

图4是琼脂糖凝胶电泳灰度分析结果；

图5是SluxS扩增结果，图5a至图5e分别为6h、12h、24h、36h、48h；

图6是icaD扩增结果，图6a至图6e分别为6h、12h、24h、36h、48h；

图7是WB检测6h检测结果；

图8是WB检测12h检测结果；

图9是WB检测24h检测结果；

图10是WB检测36h检测结果；

图11是WB检测48h检测结果；

图12是WB检测灰度分析SluxS结果，图12a至图12e分别为6h、12h、24h、36h、48h；

图13是WB检测灰度分析icaD结果，图13a至图13e分别为6h、12h、24h、36h、48h；

图14是Sluxs的测序结果；

图15是icaD的测序结果。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。

刚果红平板法定性生物膜形成菌株菌落变黑，菌落周围培养基褪色，为BF形成阳性菌株。

总RNA提取检测结果如表1所示：

表1

1.9＜OD260/OD280＜2.0，标明RNA中无DNA和蛋白污染。

聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果如图1所示，银染结果显示，sigB、sluxB、icaD、sarH2和16sDNA均扩增出比较明显的条带。对电泳结果选择主带用ImageJ进行灰度分析，各扩增条带对16sDNA的灰度比值如表2所示：

表2

灰度分析结果如图2所示。

琼脂糖凝胶电泳结果如图3所示，凝胶成像仪拍照结果显示，sluxB、icaD和16sDNA均扩增出单一的条带，用ImageJ进行灰度分析，各扩增条带对16sDNA的灰度比值如表3所示：

表3

灰度分析结果如图4所示。将Sluxs和icaD的PCR结果送上海生工测序，测序结果在NCBI中BLAST，结果如图14、图15所示。

将Sluxs和icaD的PCR结果送上海生工测序，测序结果在NCBI中BLAST，结果如下：图5是SluxS扩增结果，图5a至图5e分别为6h、12h、24h、36h、48h；

图6是icaD扩增结果，图6a至图6e分别为6h、12h、24h、36h、48h；

图7是WB检测6h检测结果；

图8是WB检测12h检测结果；

图9是WB检测24h检测结果；

图10是WB检测36h检测结果；

图11是WB检测48h检测结果；

对各组进行灰度分析，得到以下结果，如图12、图13所示。

WB检测结果与RT-PCR检测结果的趋势基本一致。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。