本发明涉及消化系统肿瘤的检测试剂，具体涉及人胃肠肿瘤中CNTN1基因的检测试剂。
背景技术：
：消化系统肿瘤中主要是恶性胃癌和结直肠癌，在所有消化系统恶性肿瘤死亡病例中，约有一半的患者死于胃癌，结直肠癌近年来的发病率有明显上升趋势。现用于诊断消化系统中恶性肿瘤的方法主要包括消化内镜检查，影像学检查，生化和免疫学检查及基因诊断。免疫学检查中胃癌的标记物主要有CA199、CEA、CA242、CA125、AFP、NES等，结直肠癌的标记物主要有CA19-9、CEA、P53、K-ras等。基因诊断是近年来兴起的检测技术，具有快速、特异和灵敏的优点，如授权公告号为CN102787174的发明专利，就公开了针对与胃肠肿瘤相关折抑癌基因CPG表观突变的检测试剂，其中用25对引物测序CPG基因的启动子区，基因启动子区域高甲基化可导致抑癌基因表达沉默，致使肿瘤的发生，从而确认胃肠肿瘤。但该发明专利需要对胃肠肿瘤DNA进行25对引物的PCR检测，检测时间长，检测过程复杂，延缓了病患的确诊和救治时间。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是提供一种人胃肠肿瘤中CNTN1基因的检测试剂，该检测试剂具有检测灵活快速，简单方便，针对性强的优点。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：人胃肠肿瘤中CNTN1基因的检测试剂，该检测试剂为一对特异性引物，该对特异性引物核苷酸序列如下：上游引物的核苷酸序列为：5’-AGAATTTTTGTAATTCGAAGGGTAC-3’，下游引物的核苷酸序列为：5’-ATAAAAATAATTCCCGTAAACAACG-3’。与现有技术相比，本发明的优点在于人胃肠肿瘤中CNTN1基因的检测试剂，该检测试剂为一对特异性引物，其上游引物的核苷酸序列为：AGAATTTTTGTAATTCGAAGGGTAC，下游引物的核苷酸序列为：ATAAAAATAATTCCCGTAAACAACG；该检测试剂针对人胃肠肿瘤中CNTN1基因，CNTN1基因虽然目前认为是与细胞衰老有关，但我们发现在胃肠肿瘤中，癌变组织与癌旁组织之间CNTN1基因在荧光定量甲基化检测中CNTN1基因甲基化程度不同，癌变组织CNTN1基因甲基化程度明显高于癌旁组织，该检测试剂具有检测灵活快速，简单方便，针对性强，准确可靠、效率高，经济节约的优点，有利于结直肠癌和胃癌的早期发现和及时治疗。具体实施方式以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。实施例1人胃肠肿瘤中CNTN1基因的检测试剂，该检测试剂为一对特异性引物，其上游引物的核苷酸序列为：5’-AGAATTTTTGTAATTCGAAGGGTAC-3’，下游引物的核苷酸序列为：5’-ATAAAAATAATTCCCGTAAACAACG-3’。是针对CNTN1基因的启动子区域设计的荧光定量甲基化特异性扩增上游引物和荧光定量甲基化特异性扩增下游引物，经过我们大量筛选施验确认得到，引物由上海生功生物工程股份有限公司合成。实施例2利用实施例1的一对引物进行病例检测，具体检测过程如下：1、DNA提取：我们从宁波第三人民医院采集5例胃癌石蜡样本和对应的癌旁组织石蜡样本，用QIAampDNAFFPETissueKit（购于Qiagen,Hilden，德国）DNA提取试剂盒提取DNA样本，我们从宁波第三人民医院采集5例结直肠癌石蜡样本和对应的癌旁组织石蜡样本，同样提取，得到DNA样本，DNA样本要求DNA的吸光度(A)的比值（A260/A280）约为1.80。2、DNA样本甲基化：采用EZDNA甲基化试剂盒（购于Zymo公司，美国）对样本DNA进行亚硫酸氢盐转化，用重亚硫酸盐处理DNA样品后，可使发生甲基化的胞嘧啶(C)碱基保持不变，而使未发生甲基化的C转变成了尿嘧啶(U)，然后通过荧光定量进行PCR反应，测序CNTN1基因甲基化率。3、PCR反应：取DNA样本1.6ul加入到10ulSYBRGreen混合液（购于Roche公司，美国）中，再加入6.8ul无DNA和RNA酶水，并加入上述一对CNTN1基因的特异性扩增引物，进行荧光定量PCR甲基化扩增；所采用的荧光定量甲基化程序为：首先95℃10min的变性；接着95℃20s，60℃30s，72℃30s，共45个循环的退火反应；反应完成后是95℃1min，59℃30s，95℃30s进入熔解曲线分析，判断产物的特异性。4、完毕后，利用2-△CT方法分析各样本CNTN1基因甲基化程度，其中△CT=CTCNTN1-CTACTB-CT阳性对照，ACTB（管家基因，购于上海生功生物工程股份有限公司）、阳性对照（甲基化标准品DNA，购于Zymo公司）的检测同步骤2、3，采用SPSS16.0对数据进行整理分析，我们发现：结直肠癌变组织与癌旁组织之间，胃癌癌变组织与癌旁组织之间的DNA甲基化水平均存在显著差异如表1。表1：癌变组织基因与癌旁组织基因甲基化率比较表姓名病症癌变组织基因甲基化率癌旁组织基因甲基化率王文龙胃癌0.2588160.062935刘金贵胃癌0.3120830.056328刘菜芽胃癌0.4931160.081334仇元良胃癌0.2973020.007652冯雪浓胃癌0.1134400.038741叶茂山结肠癌0.3400000.040000胡启孝结肠癌0.7000000.040000张婉青结肠癌0.6700000.060000王品玉结肠癌0.7400000.070000鲁冬叶结肠癌0.5400000.040000从表1中可以看出，在胃癌和结直肠癌病症患者中，通过CNTN1基因的检测试剂检测，其癌变组织的甲基化率明显高于癌旁组织。<110>宁波大学医学院附属医院<120>人胃肠肿瘤中CNTN1基因的检测试剂<160>2<170>PatentInversion3.1<210>1<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>扩增胃肠肿瘤中CNTN1基因的上游引物序列<400>1AGAATTTTTGTAATTCGAAGGGTAC25<210>2<211>25<212>DNA<213>扩增胃肠肿瘤中CNTN1基因的下游引物序列<400>2ATAAAAATAATTCCCGTAAACAACG25当前第1页1 2 3