发明领域
本发明描述了选择性地酰化肽或蛋白中的氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有两个或多个反应性的亲核官能团。
发明背景
已经批准许多肽用于医疗实践，并且这些肽可以通过重组DNA技术在合适的宿主细胞中制备，或可以通过非常确实的肽合成技术合成法制备它们。然而，天然的肽以及其类似物倾向于显示出高清除率，这在许多在长时间内需要高的肽血浆浓度的临床适应症中是无法接受的。
已经发现，肽和肽类似物的各种衍生作用可以以良好的趋势影响肽的清除率，例如，WO98/08871、WO98/08872、WO99/43708、EP 1227107和WO00/55119中所描述的内容。这种衍生作用之一是将亲脂性的酰基引入到了治疗肽中，导致合乎需要的长效作用特性(相对于非酰化的肽)。由此，频率更小地给予治疗蛋白改善了患者对处方治疗的依从性，并且还可以降低所给予的肽的数量。
为了使治疗用的肽经济上切实可行，制备肽的成本以及肽的治疗剂量是关键性的因素。在制备治疗用肽期间的主要成本是从杂质中分离靶蛋白所要求的纯化步骤，其与靶蛋白密切相关。这些纯化步骤通常利用色谱法进行，这意味着昂贵的色谱基质和溶剂，以及总产率被降低。
将酰基引入到具有一个以上的亲核原子(例如，一个以上的胺)的肽或蛋白的一个或多个位点中，会使粗品混合物中的产物-相关杂质的产物混合物增多，所述相关杂质与目标化合物极其相似，这就造成产物损失，并因此需要更困难的纯化步骤。
本发明的目标是：提供有效、稳健和经济的方法，以便通过间隔基将亲脂性基团引入到肽或蛋白中。所述间隔基可以例如由一个或多个8-氨基-3,6-二氧杂辛酸部分和谷氨酸组成。与其它已知的方法相比，该方法更具特异性、更稳健，由此导致高产率，并降低密切相关杂质的形成。达到了制备酰化肽或蛋白的成本明显减少的目的。为了使能够获得治疗的患者数量最大，以及为了利用替代性递送途径(与皮下注射相比，这种递送途径具有更低的生物利用率)例如透皮、肺或口服递送的益处，价格低廉的酰化肽是高度合乎需要的。
本发明由此提供了具有惊人的高选择性的选择性地酰化肽或蛋白中赖氨酸残基的ε-氨基的方法。
本发明概述
本发明描述了选择性地酰化肽或蛋白中的一个氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有两个或多个反应性的亲核官能团。
在一方面，该方法包括∶
a)在水介质中，使具有至少两个反应性亲核官能团的肽或蛋白与通式I的酰化剂反应
其中
n是1-6
m是1-2
w是4-20
R1是离去基团，当所述酰化剂与游离胺反应时，其可以促进在R1连接的羰基和所述胺之间形成酰胺键；
其中水介质的pH值在pH8至pH14之间；和
b)分离N-酰化的肽或蛋白；
其中，获得N-酰化的肽或蛋白，其包含至少一个游离反应性亲核官能团，该官能团没有被酰化或仅仅被部分酰化。
附图说明
图1∶用22-羧基-1-[(2,5-二氧代-1-吡咯烷基)氧基]-1,10,19,24-四氧代-3,6,12,15-四氧杂-9,18,23-三氮杂四十一烷-41-酸(化合物1)酰化[Aib8，Arg34]GLP-1(7-37)。说明了纯度对所加入酰化试剂数量和pH值的(用HPLC，在260nm处测定)的依赖性。举例说明的pH值是∶pH10.00(-●-)，pH11.25(-■-)和pH12.00(-▲-)。
发明说明
本方法提供了在肽或蛋白的目标位置固定选择性酰化的方法。通过进行本发明的酰化反应，令人惊讶地表明，可以获得选择性的酰化，并由此使得酰化反应混合物的杂质特性是更少的不合乎需要的杂质形式，在酰化过程终止之后，这能够更容易纯化和分离目标选择性酰化的产物。
此外，通过本发明，可以获得酰化方法，在该方法中，获得酰化的肽或蛋白，在酰化步骤中或酰化步骤之后，不使用苛刻的试剂。所获得的产物是由此以高产率获得的，此外，由于使用了集中的方法，与使用非集中方法相比，该方法是比较便宜的方法。
按照本发明，使用酰化试剂，其包括1至6个之间的OEG间隔基，其中OEG间隔基是下式的8-氨基-3,6-二氧杂辛酸(还可以将其命名为[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酸)部分∶
当这种OEG间隔基存在于酰化试剂中并且使用常规酰化方法时，本发明人的经验是：常常以低产率获得酰化产物。本发明提供了有效和稳定的酰化肽或蛋白的方法，该方法使用包括1至6个OEG间隔基的酰化试剂，以高产率提供产物。
酰化是给化合物添加酰基的方法。由此，本文将“酰化剂”定义为：能够提供可加到肽或蛋白上的酰基的化合物。
“选择性酰化”或“选择性”在本文中是指：与肽或蛋白的其它位置相比，酰化试剂主要在所要酰化的肽或蛋白的一个位置反应。例如，使用按照本发明酰化方法将肽或蛋白酰化所获得的产物，可以产生酰化产物，在该酰化产物中，酰化侧链仅仅与肽或蛋白的一个位置相连接，并且不是可能获得酰化的所有位置都具有无选择性的酰化。在本发明的一方面，获得选择性，可以实现肽或蛋白的酰化，这样就可以使酰化反应完成时反应混合物中有至少50％的被酰化肽或蛋白是在优选的酰化位点上被酰化的。
在一方面，当酰化反应完成时，反应混合物中有至少60％酰化肽或蛋白是在优选的酰化位点上被酰化的。在另一个方面，至少70％酰化肽或蛋白是在优选的酰化位点被酰化的。在另一个方面，至少80％酰化肽或蛋白是在优选的酰化位点被酰化的。在另一个方面，至少85％酰化肽或蛋白是在优选的酰化位点被酰化的。在另一个方面，至少90％酰化肽或蛋白是在优选的酰化位点被酰化的。在另一个方面，至少95％酰化肽或蛋白是在优选的酰化位点被酰化的。在另一个方面，至少97％酰化肽或蛋白是在优选的酰化位点被酰化的。在另一个方面，至少98％酰化肽或蛋白是在优选的酰化位点被酰化的。在另一个方面，至少99％酰化肽或蛋白是在优选的酰化位点被酰化的，在又一个方面，当酰化反应完毕时，反应混合物中大约所有的酰化肽或蛋白是在优选的酰化位点被酰化的。
在本发明的一方面，肽或蛋白上的优选酰化位点是赖氨酸残基的ε-氨基，这样就可以主要在所述赖氨酸的ε-氨基上获得选择性的酰化。
本文使用的术语“肽或蛋白”是指由至少五个通过肽键连接的构成氨基酸组成的化合物。构成性氨基酸可以得自于遗传密码编码的氨基酸，并且它们可以是天然氨基酸(不是遗传密码编码的)以及合成氨基酸。非遗传密码编码的天然氨基酸是例如γ-羧基谷氨酸，鸟氨酸，磷酸丝氨酸，D-丙氨酸和D-谷酰胺。合成氨基酸包括化学合成制备的氨基酸，即通过遗传密码编码的氨基酸的D-异构体，例如D-丙氨酸和D-亮氨酸，Aib(α-氨基异丁酸)，Abu(α-氨基丁酸)，Tle(叔丁基甘氨酸)，β-丙氨酸，3-氨甲基苯甲酸，邻氨基苯甲酸。
22个产生蛋白的(proteogenic)氨基酸是∶
丙氨酸，精氨酸，天冬酰胺，门冬氨酸，半胱氨酸，胱氨酸，谷酰胺，谷氨酸，甘氨酸，组氨酸，羟脯氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，赖氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸，丝氨酸，苏氨酸，色氨酸，酪氨酸，缬氨酸。
由此，非产生蛋白的(proteogenic)氨基酸是可以通过肽键结合进肽或蛋白中的部分，但不是产生蛋白的(proteogenic)氨基酸。实例是：γ-羧基谷氨酸，鸟氨酸，磷酸丝氨酸，D-氨基酸(例如D-丙氨酸和D-谷酰胺)，合成的非产生蛋白的(proteogenic)氨基酸，包括通过化学合成制备的氨基酸，即通过遗传密码编码的氨基酸的D-异构体，例如D-丙氨酸和D-亮氨酸，Aib(α-氨基异丁酸)，Abu(α-氨基丁酸)，鸟氨酸，Dap(2,3-二氨基丙酸)，Dab(2,4-二氨基丁酸)，Tle(叔丁基甘氨酸)，3-氨甲基苯甲酸，邻氨基苯甲酸，去氨基-组氨酸，氨基酸的β类似物，例如β-丙氨酸等等，D-组氨酸，去氨基-组氨酸，2-氨基-组氨酸，β-羟基-组氨酸，homo-组氨酸，Nα-乙酰基-组氨酸，α-氟甲基-组氨酸，α-甲基-组氨酸，3-吡啶基丙氨酸，2-吡啶丙氨酸或4-吡啶丙氨酸，(1-氨基环丙基)羧酸，(1-氨基环丁基)羧酸，(1-氨基环戊基)羧酸，(1-氨基环己基)羧酸，(1-氨基环庚基)羧酸，或(1-氨基环辛基)羧酸；
本文关于肽或蛋白使用的术语“类似物”是指修饰的肽或蛋白，其中肽或蛋白的一个或多个氨基酸残基被其它氨基酸残基取代，和/或，其中一个或多个氨基酸残基从肽或蛋白上除去，和/或，其中一个或多个氨基酸残基从肽或蛋白上除去，和/或，其中一个或多个氨基酸残基加到肽或蛋白上。氨基酸残基的这种加入或除去可以在肽或蛋白的N端进行，和/或，在肽或蛋白的C端进行。一种简单的系统常常用于描述类似物∶例如[Aib8，Arg34]GLP-1(7-37)表示GLP-1(7-37)类似物，其中天然存在的丙氨酸在8位被α-氨基异丁酸取代，和赖氨酸在34位被精氨酸取代。将没有说明旋光异构体的所有氨基酸理解为L-异构体。在本发明的方面中，已经修饰了最多17个氨基酸。在本发明的方面中，已经修饰了最多15个氨基酸。在本发明的方面中，已经修饰了最多10个氨基酸。在本发明的方面中，已经修饰了最多8个氨基酸。在本发明的方面中，已经修饰了最多7个氨基酸。在本发明的方面中，已经修饰了最多6个氨基酸。在本发明的方面中，已经修饰了最多5个氨基酸。在本发明的方面中，已经修饰了最多4个氨基酸。在本发明的方面中，已经修饰了最多3个氨基酸。在本发明的方面中，已经修饰了最多2个氨基酸。在本发明的方面中，已经修饰了1个氨基酸。
在本发明的一方面，按照本发明的衍生物的C端可以以酸或酰胺的形式终止。在一方面，本发明的衍生物的C端是酰胺。在另一个方面，本发明的衍生物的C端是酸。
应该理解，肽或蛋白应该携带至少两个反应性的亲核官能团，例如氨基，例如N端氨基和/或侧链氨基。肽或蛋白可以包括不是通过遗传密码编码的氨基酸，例如D-氨基酸，3-羟脯氨酸，Aib(α-氨基异丁酸)，鸟氨酸，Dap(2,3-二氨基丙酸)，Dab(2,4-二氨基丁酸)和戊基甘氨酸。尤其感兴趣的是赖氨酸、鸟氨酸、Dap和Dab氨基酸残基的氨基。赖氨酸残基的ε-氨基的N-酰化与该方法尤其相关。
本文中，按照下列原理进行肽或蛋白的命名∶以相对于母体肽或蛋白(例如人GLP-1或人胰岛素)的突变和修饰(酰化)形式给予命名。为了命名酰基部分，按照IUPAC命名法进行命名，在其它情况下，按照肽命名法来命名。例如，命名酰基部分∶
可以是例如“十八烷二酰基-γGlu-OEG-OEG”，或“17-羧基十七酰-γGlu-OEG-OEG”，其中OEG是氨基酸-NH(CH2)2O(CH2)2OCH2CO-的速记符号，γGlu(或gGlu)是氨基酸γ谷氨酸部分的速记符号。
在一方面，要按照本发明酰化的肽或蛋白具有至少两个可以与酰化试剂反应的反应性的亲核官能团。在另一个方面，肽或蛋白具有2和10个之间的反应性的亲核官能团，例如，2和8个之间的反应性的亲核官能团，2和6个之间的反应性的亲核官能团，2和4个之间的反应性的亲核官能团或2和3个之间的反应性的亲核官能团。在一方面，肽或蛋白具有2个反应性的亲核官能团。
在本文中，反应性亲核官能团被理解为：在给定反应条件下与酰化试剂反应形成稳定共价键的化学官能团。这种反应性的亲核官能团的例子包括但不局限于：例如酪氨酸的羟基(其中羟基可以与酰化试剂反应)，丝氨酸的羟基(其中羟基可以与酰化试剂反应)，苏氨酸的羟基(其中羟基可以与酰化试剂反应)，例如半胱氨酸的硫醇基(其中硫醇基可以与酰化试剂反应)，氨基，例如但不局限于：例如肽或蛋白的Nα-端胺，赖氨酸的氨基(其中ε-氨基可以与酰化试剂反应)，及在肽或蛋白内的其它亲核剂，例如但不局限于：精氨酸(其中胍基团可以与酰化试剂反应)和组氨酸(其中咪唑基可以与酰化试剂反应)。
在一方面，要按照本发明酰化的肽或蛋白具有至少两个游离氨基。在另一个方面，肽或蛋白具有2和10个之间的游离氨基，例如，2和8个之间的游离氨基，2和6个之间的游离氨基，2和4个之间的游离氨基或2和3个之间的游离氨基。在一方面，肽或蛋白具有2个游离氨基。
当本文使用时，术语“游离氨基”是指在给定反应条件下与酰化剂反应形成共价键的伯或仲氨基。
当与N-酰化的肽的至少一个游离氨基结合使用时，术语“部分酰化”是指：在包含所述N-酰化的肽的反应混合物中，反应混合物中的一部分肽具有至少一个不与酰化部分连接的游离氨基，肽的另一个部分具有相同的至少一个与酰化部分连接的氨基。
要被酰化的肽或蛋白可以包括一个或多个赖氨酸(Lys)氨基酸残基。在一方面，选择的酰化位置在肽或蛋白中的赖氨酸基团的ε-氨基和肽或蛋白的N端中的α-氨基之间，其中酰化主要是在一个或多个ε-氨基上获得的，而不是在肽或蛋白的N端中的α-氨基上获得的。在一方面，肽或蛋白包含一个赖氨酸(Lys)氨基酸残基和一个或多个N端α-氨基，其中在Lys氨基酸的ε-氨基上进行选择性酰化。在一个进一步的方面，肽或蛋白包含一个赖氨酸(Lys)氨基酸残基和一个N端α-氨基，其中在Lys氨基酸的ε-氨基上进行选择性酰化。
“反应混合物”在本文中被理解为：当酰化剂与肽或蛋白反应时所使用的溶剂和试剂的混合物。反应混合物应该是水溶液，即水存在于反应混合物中。
为了获得选择性酰化，将含水反应混合物的pH值调节至pH8和pH14之间。在一方面，反应介质的pH值在pH9和pH13之间。在另一个方面，pH值在pH10和pH12之间。在另一个方面，pH值在pH12和pH13之间。在另一个方面，pH值在pH10和pH13之间。在另一个方面，pH值在pH10.5和pH12.0之间，或在pH11.0和pH11.5之间，在又一个方面，pH值是大约pH11.0-11.3。在另一个方面，pH值在pH11和pH12之间，例如在pH11.5和pH12之间，或在pH11.5和pH11.8之间，或在pH11.5和pH12.5之间。在一方面，pH值大约是pH11.5。
本文使用的术语“大约”或“大致”是指合理地接近所表明的数值，例如加上或减去10％，或对PH值来说是加上或减去0.2。
按照本发明通过调节pH值，可以获得意外稳健的酰化反应。当涉及到酰化反应时，“稳健的”或“稳固的”在本文中是指：当使用按照本发明的酰化方法时，可以获得高产率和高选择性，并且当加入过量酰化剂时，对加入的酰化剂的量不敏感(参见例如图1)。
反应混合物的pH值可以利用本领域技术人员已知的方法来控制。例如，可以用简单的pH计测定pH值，可以人工地加入酸或碱，以便调节pH值，或可以使用具有反馈机理的pH计，其可以控制溶液的pH值。
适合于调节pH值的酸包括但不局限于∶盐酸，硫酸和乙酸。
适合于调节pH值的碱包括但不局限于∶叔胺碱，例如但不局限于三乙胺或二异丙基乙胺，N-甲基吗啉，碱金属氢氧化物，例如但不局限于氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾或氢氧化铯，和碱金属碳酸盐，例如但不局限于碳酸钾、碳酸钠、碳酸锂、碳酸氢钾、碳酸氢钠或碳酸氢锂。
在本发明的一方面，反应混合物包含缓冲液。在本发明的一方面，缓冲液选自∶磷酸盐缓冲液，碳酸钠缓冲液，Bicine(N,N-二(2-羟乙基)甘氨酸缓冲液)，HEPPS缓冲液(3-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]丙磺酸缓冲液)，HEPES缓冲液(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸缓冲液)，MOPS缓冲液(3-(N-吗啉基)丙磺酸缓冲液)和TEA缓冲液(三乙胺缓冲液)。
酰化试剂应该优选以固体形式加入到溶液中，或溶解在合适惰性溶剂中，而后以溶液形式加入。惰性溶剂的例子是例如但不局限于：N-甲基吡咯烷酮，二甲基甲酰胺，二甲基乙酰胺，乙腈，四氢呋喃和二甲亚砜。酰化试剂的加入量可以是例如0.5-20当量，例如1-20当量，1-5当量或1-3当量(相对于反应性亲核官能团，例如被酰化的氨基的数目)。例如，如果加入1摩尔肽或蛋白(具有1个要被酰化的氨基)，可以加入0.5摩尔至20摩尔数量的酰化剂，例如1至5摩尔。意外地发现，当使用按照本发明方法时，可以实现选择性和稳健性，即使在加入大量过剩的酰化试剂时。在一方面，加入的酰化试剂的数量为1-4当量，或者1.2-3.0当量，或者1.4-2.0当量。在一方面，酰化试剂的加入数量为大约1.75当量。当溶解在惰性溶剂中时，可以以每ml惰性溶剂至少10mg酰化试剂的浓度加入酰化试剂。在一方面，酰化试剂在惰性溶剂中的浓度在10mg/ml和1000mg/ml惰性溶剂之间。在另一个方面，该浓度在50mg/ml和250mg/ml惰性溶剂之间。在又一个方面，酰化试剂在惰性溶剂中的浓度大约为100mg/ml惰性溶剂。
在酰化过程期间，反应混合物的温度可以在-5℃和50℃之间，例如在0℃和50℃之间。在一方面，该温度在5℃和40℃之间。在另一个方面，温度在10℃和30℃之间。在又一个方面，该温度大约为20℃。在又另一个方面，温度在-5℃和10℃之间。在又另一个方面，温度在0℃和5℃之间。在又另一个方面，温度在2和5℃之间。在本发明的一方面，将反应混合物保持在室温下。
可以在搅拌或搅动下，在0分钟和480分钟之间的期间内，将酰化试剂加入到反应混合物中，例如，在10和240分钟之间的期间内。在一方面，在10和180分钟之间的期间内加入试剂。在另一个方面，在20和120分钟之间的期间内加入试剂。在又一个方面，在大约30分钟期间内加入试剂。在又一个方面，在大约60分钟期间内加入试剂。在又另一个方面，在30和60分钟之间的期间内加入试剂。
加入酰化试剂之后，可以使酰化反应混合物(任选在搅拌或搅动下)保持反应0分钟和1440分钟(即24小时)之间的时间，例如在0和720分钟之间，而后通过将pH值调节至大约7.5-8.0或更低来终止反应。在一方面，使酰化反应混合物保持15和240分钟之间。在另一个方面，使酰化混合物保持30和120分钟之间。在另一个方面，使酰化混合物保持0和15分钟之间。在又一个方面，使酰化混合物保持大约0分钟，即，加入酰化试剂之后立即终止反应。在又一个方面，使酰化混合物保持大约30分钟。在又一个方面，使酰化混合物保持大约60分钟。在又另一个方面，使酰化混合物保持30和60分钟之间。
肽或蛋白应该优选以至少5.0mg/ml的浓度存在于反应混合物中。在一方面，蛋白或肽的浓度在5.0mg/ml和250mg/ml反应混合物之间。在又一个方面，蛋白或肽的浓度在10mg/ml和100mg/ml之间。在又一个方面，蛋白或肽的浓度在10mg/ml和75mg/ml之间。在又一个方面，蛋白或肽的浓度在10mg/ml和50mg/ml之间。在又一个方面，蛋白或肽的浓度在10mg/ml和30mg/ml之间。在又一个方面，蛋白或肽的浓度在15mg/ml和25mg/ml之间。在又一个方面，蛋白或肽的浓度在10.0mg/ml和20.0mg/ml之间。在另一个方面，蛋白或肽的浓度大致为12.5mg/ml。在另一个方面，蛋白或肽的浓度大致为20mg/ml。
反应混合物可以包括其它组份和/或溶剂。反应混合物中可以存在例如惰性溶剂，例如极性非质子溶剂，包括但不限于：N-甲基吡咯烷酮，二甲基甲酰胺，二甲基乙酰胺，乙腈，四氢呋喃和二甲亚砜。在一方面，惰性溶剂的存在数量为反应混合物总量的0-25％v/v。在另一个方面，惰性溶剂的存在数量为0-10％v/v或0-5％v/v。在另一个方面，惰性溶剂的存在数量为4-20％v/v或4-10％v/v。在又一个方面，惰性溶剂的存在数量为4-5％v/v。在一方面，存在惰性溶剂，并且是N-甲基吡咯烷酮。
在一方面，反应混合物进一步包含化合物和/或盐，其在肽或蛋白和酰化试剂溶解在反应介质中之前，存在于要被酰化的肽或蛋白中，或存在于酰化试剂中。例如，由于例如作为肽或蛋白质合成的结果而通过离子键存在于肽或蛋白中的盐或其它化合物，可以存在于按照本发明方法的反应混合物中。这种化合物和/或盐的例子包括但不局限于∶三氟乙酸(TFA)，乙酸，盐酸(HCl)，枸橼酸，亚磷酸，磺酸，钠盐，钾盐和锂盐。
在本发明的一方面，要被引入到肽或蛋白中，例如，肽或蛋白的Lys残基的ε-氨基的酰基，包括白蛋白结合的残基，即，在体内条件下与白蛋白结合的残基(当连接肽或蛋白时)。
在一方面，白蛋白结合残基是亲脂性的残基。在进一步方面，亲脂性的残基通过连接基与肽或蛋白相连接。
在本发明的进一步方面，白蛋白结合残基在生理pH值下带负电荷。在本发明的另一个方面，白蛋白结合残基包括可以被带负电荷的基团。一个优选的可以被带负电荷的基团是羧基。
在一方面，白蛋白结合残基是α,ω-脂肪族二酸残基。
在本发明的进一步方面，亲脂性残基的α,ω-脂肪族二酸残基具有6至40个碳原子，8至26个碳原子或8至22个碳原子。
在本发明的另一个方面，白蛋白结合残基是直链或支链烷烃α,ω-二羧酸的酰基。在进一步方面，白蛋白结合残基是直链或支链烷烃α,ω-二羧酸的酰基，该酸包括氨基酸部分，例如，γ-Glu部分。在进一步方面，白蛋白结合残基是直链或支链烷烃α,ω-二羧酸的酰基，该酸包括两个氨基酸部分，例如，γ-Glu部分和8-氨基-3,6-二氧杂辛酸(OEG)部分。在进一步方面，白蛋白结合残基是直链或支链烷烃α,ω-二羧酸的酰基，该酸包括多个氨基酸部分，例如，一个γ-Glu部分和连续的多个8-氨基-3,6-二氧杂辛酸(OEG)部分。
在按照本发明的方法中，使具有至少两个反应性亲核官能团的肽或蛋白与通式I的酰化剂反应
其中
n是1-6，或者1-3，1-2，或者2
m是1-2，或者2
w是4-20，或者10-20，或者14-18，或者16
R1是离去基团，当所述酰化剂与游离胺反应时，其可以促进在连接于R1的羰基和所述胺之间形成酰胺键。
酰化剂可以是纯对映体形式，其中手性氨基酸部分的立体构型是D或L型(或使用R/S术语时∶R或S型)，或可以是对映体的混合物形式(D和L/R和S)。在本发明的一方面，酰化剂是对映体的混合物形式。在一方面，酰化剂是纯对映体形式。在一方面，酰化剂的手性氨基酸部分是D型。在一方面，酰化剂的手性氨基酸部分是L型。
式I中的R1可以是当酰化剂与游离胺反应时能够起到离去基团作用、因而就可以在R1连接的羰基和胺之间形成酰胺键的任何基团。例如，R1与R1相连接的羰基一起可以表示酸酐，羧酸卤化物或酯。
在一方面，式I中的R1与R1相连接的羰基一起表示酯，例如活化的酯或活化的N-羟基酰亚胺酯(imide ester)。这些酯中的每一个构成本发明的替代性方面。
活化的酯和活化的N-羟基酰亚胺酯(imide ester)作为在氨基、硫基和羟基的酰化中使用的官能团在有机化学(特别是肽化学)领域为大家所熟知。在本发明的上下文中，术语“活化的酯或活化的N-羟基酰亚胺酯”是指羧基的酯官能化形式，其适合于将胺、优选伯胺酰化。由此应该理解，伯胺的酰化选择性优选对于羟基和硫基进行酰化。尤其优选活化的N-羟基酰亚胺酯。
术语“活化的”酰化剂是指使用常规技术活化的酰化剂，例如，如下面所描述：“Amide bond formation and peptide coupling”(Tetrahedron 61(46),10827-10852,2005)。
活化酰化剂的例子包括但不局限于：酰基氯，酰基溴，酰基氟，对称酸酐，混合酸酐，使用常见的碳二亚胺(例如但不局限于：二异丙基碳二亚胺(DIPCDI)，N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)，1-乙基-3-(3'-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC))活化的羧酸。此外包括的是(但不限于)使用上述碳二亚胺和添加剂(例如但不局限于：N-羟基琥珀酰亚胺(HOSu)，N-羟基苯并三唑(HOBt)，1-羟基-7-氮杂苯并三唑，6-氯-N-羟基苯并三唑(HOAt)，3-羟基-3,4-二氢-4-氧代-1,2,3-苯并三嗪(DhbtOH)或对硝基苯酚(PNP))的羧酸。还包括的是(但不限于)被下列脲阳离子盐或膦盐活化的羧酸：例如但不局限于：O-苯并三唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)，O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸盐(TBTU)，2-(6-氯-1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基铵六氟磷酸盐(HCTU)，2-(6-氯-1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基铵四氟硼酸盐(TCTU)，2-(1H-7-氮杂苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐(HATU)，2-(3,4-二氢-4-氧代-1,2,3-苯并三嗪-3-基)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HDBTU)，2-琥珀酰亚胺基-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐(HSTU)，N,N,N',N'-四甲基-O-(琥珀酰亚胺基)脲四氟硼酸盐(TSTU)，2-(内-5-降冰片烯-2,3-二甲酰亚胺(dicarboxymido))-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐(HNTU)，1-苯并三唑氧基三-(二甲基氨基)磷六氟磷酸盐(BOP)或苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷六氟磷酸盐(PYBOP)。其它活化酯包括但不局限于下列的酯：N-羟基琥珀酰亚胺(NHS酯)，对硝基苯酚(PNP酯)，N-羟基-5-降冰片烯-2,3-二甲酰亚胺(HONB-酯)，N-五氟苯酚酯(PfP-酯)，2,4-二硝基苯基酯，4-硝基苯基酯，3-羟基-3,4-二氢-4-氧代-1,2,3-苯并三嗪(HODhbt)，羰基二咪唑(CDI)或N-乙基-5-苯基异唑-3'-磺酸盐(NEPIS)，优选N-羟基琥珀酰亚胺酯、对硝基苯酚或HOBt酯或其衍生物，使用例如下列参考文献中所描述的反应条件∶Organic Synthesis on solid Phase(Florencio Zaragoza Wiley-VCH Verlag GmbH,D-69469Weinheim,2000),Novabiochem Catalog(Merck Biosciences 2006/2007)和Fmoc SolidPhase Peptide Synthesis(Edited by W.C.Chan and P.D.White,Oxford University Press,2000,ISBN 0-19-963724-5)。
相对于要被酰化的肽或蛋白的氨基数量，以稍微不足的数量、相等数量或稍微过量的数量使用式I的酰化剂。相对于按照该方法要酰化的反应性亲核官能团(例如氨基)的数量，该比例可以例如是1:0.5，典型地是1:1至1:20，具有相等数量或过量的酰化剂，或者相对于按照该方法酰化的反应性亲核官能团(例如氨基)的数量，该比例是1:1.1至1:5。可以以固体形式将酰化剂加入到反应混合物中，或可以以溶液形式加入到反应混合物中。当以溶液形式加入酰化剂时，将其溶解在惰性溶剂中，其中术语“惰性”是指对酰化剂是惰性的。通过加入酸可以提高(即稳定化)酰化剂的稳定性。
在该方法的一方面，以固体形式将酰化剂加入到反应混合物中。
在该方法的一方面，用作步骤a)的起始原料的所述肽或蛋白具有至少80％，至少90％，至少93％，至少95％，或至少97％(利用HPLC测定)的肽或蛋白纯度。
作为典型实例，使用肽或蛋白和式I的酰化剂(1:1至1:5摩尔比)进行步骤(a)的反应。典型地，在-10-30℃(例如0-30℃)将肽或蛋白预先溶解在水中，并使用碱金属氢氧化物(例如氢氧化钠或氢氧化钾)或叔胺碱(例如三乙基胺或N,N-二异丙基乙胺)将pH值调节至目标pH值水平。可以使用酸(例如盐酸，磺酸或乙酸)进一步调节PH值，但温度优选在上述范围之内。或者，将肽或蛋白预先直接溶解在包含合适数量的相关酸或碱的水溶液中。随后以固体或溶液形式加入酰化剂。典型地，使反应进行完全(可以用HPLC监控)，典型地可以从立刻和至多24小时之内完成反应，例如0.2-6小时，而后加入酸，例如盐酸、磺酸或乙酸，达到pH6.5-9.0，例如pH7.5-8.0。典型地用离子交换色谱，HPLC，分离并纯化产物，和/或在等电pH值下进行沉淀。
本发明尤其适合于酰化适于治疗例如糖尿病的肽或蛋白(例如，胰高血糖素样肽和胰岛素)。
在一方面，要被酰化的肽或蛋白是胰高血糖素样肽。
本文使用的术语“胰高血糖素样肽”是指肽的胰高血糖素家族、exendins和其类似物。肽的胰高血糖素家族是通过胰高血糖素前原基因编码的，并且包括具有高度同源性的三种小肽，即胰高血糖素(1-29)，GLP-1(1-37)和GLP-2(1-33)。Exendins是在蜥蜴中表达的肽，类似于GLP-1，是促胰岛素分泌(insulinotropic)肽。exendins的例子是exendin-3和exendin-4。
本领域技术人员已经知道术语GLP-1、GLP-2、exendin-3和exendin-4。例如，本文使用的“GLP-1化合物”或“GLP-1肽”是指人GLP-1(7-37)、其促胰岛素分泌(insulinotropic)类似物和其促胰岛素分泌(insulinotropic)衍生物。GLP-1类似物的非限制性例子是：GLP-1(7-36)酰胺，Arg34-GLP-1(7-37)，Aib8Arg34-GLP-1(7-37)，Gly8-GLP-1(7-37)，Val8-GLP-1(7-36)-酰胺和Val8Asp22-GLP-1(7-37)。GLP-1衍生物的非限制性例子是：去氨基-His7，Arg26，Lys34(Nε-(γ-Glu(Nα-十六酰)))-GLP-1(7-37)，去氨基-His7，Arg26，Lys34(Nε-辛酰)-GLP-1(7-37)，Arg26,34，Lys38(Nε-(ω-羧基十五酰))-GLP-1(7-38)，Arg26,34，Lys36(Nε-(γ-Glu(Nα-十六酰)))-GLP-1(7-36)和Arg34，Lys26(Nε-(γ-Glu(Nα-十六酰)))-GLP-1(7-37)。
在一方面，按照本发明的胰高血糖素样肽是二肽基氨肽酶IV保护的胰高血糖素样肽。在另一个方面，按照本发明的GLP-1类似物是二肽基氨肽酶IV保护的GLP-1类似物。
本文使用的术语“二肽基氨肽酶IV保护的”是指比天然化合物(例如GLP-1(7-37))更耐受二肽基氨肽酶IV(DPP-IV)的胰高血糖素样肽(例如GLP-1类似物)。通过例如天然化合物的突变和/或衍生，可以获得这种保护。GLP-1化合物对由二肽基氨肽酶IV引起的降解的抗性是通过下列降解试验测定的∶
在37℃，在100μL的0.1M三乙胺-HCl缓冲液(pH7.4)中，用1μL纯化二肽基氨肽酶IV(相当于5mU的酶活性)培养GLP-1化合物的(5nmol)等分样品10-180分钟。通过加入5μL的10％三氟乙酸来终止酶反应，肽降解产物使用HPLC分析进行分离和定量。进行这种分析的一个方法是∶按照Siegel等人Regul.Pept.1999；79:93-102和Mentlein等人Eur.J.Biochem.1993；214:829-35，将混合物施加到Vydac C18大孔径(30nm孔，5μm颗粒)250x 4.6mm柱上，以1ml/min的流速洗脱，用乙腈/0.1％三氟乙酸混合物进行线性阶式梯度(0％乙腈，3min；0-24％乙腈，17min；24-48％乙腈，1min)。可以通过220nm(肽键)或280nm(芳香族氨基酸)处它们的吸光度来监控肽和它们的降解产物，并且通过将它们的峰面积(与标准样品的面积相关联)进行积分来定量。估算在培养期间的GLP-1化合物被二肽基氨肽酶IV水解的比例，培养期间会导致小于10％的GLP-1化合物被水解。
关于胰高血糖素样肽，本文使用的术语“促胰岛素分泌(insulinotropic)”是指在对血浆葡萄糖水平增加的响应过程中刺激胰岛素分泌的能力。促胰岛素分泌(insulinotropic)的胰高血糖素样肽是GLP-1受体的激动剂。可以利用本领域已知的体外或体内试验来测定化合物的促胰岛素分泌(insulinotropic)性能。下列体外试验可以用于测定化合物(例如，胰高血糖素样肽)的促胰岛素分泌(insulinotropic)特性。在下面试验中，优选的促胰岛素分泌(insulinotropic)化合物显示出小于5nM的EC50值，更优选小于500pM的EC50值。
在DMEM介质中培育表达克隆人GLP-1受体的幼仓鼠肾脏(BHK)细胞(BHK 467-12A)，DMEM介质中加入100IU/mL青霉素、100μL/mL链霉素、10％胎儿小牛血清和1mg/mL遗传霉素G-418(Life Technologies)。通过在缓冲液(10mM Tris-HCl，30mM NaCl和1mM二硫苏糖醇，pH7.4，另外包含5mg/mL亮肽素(Sigma)，5mg/L抑胃肽(Sigma)，100mg/L杆菌肽(Sigma)和16mg/L抑肽酶(Calbiochem-Novabiochem，La Jolla，CA))中均化来制备质膜。在41％W/v蔗糖层上面将组织均浆离心。在缓冲液中稀释两个层之间的白色区域，并离心。在-80℃保存质膜，直到使用为止。
通过测定cAMP(作为对促胰岛素分泌(insulinotropic)肽或促胰岛素分泌(insulinotropic)化合物的刺激的响应)，进行功能性受体试验。在96孔微孔板中进行培养，总体积140mL，具有下列最终浓度∶50mM Tris-HCl，1mM EGTA，1.5mM MgSO4，1.7mM ATP，20mMGTP，2mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)，0.01％w/v Tween-20，pH7.4。将化合物在缓冲液中溶解并稀释。每个实验都新制备GTP∶将2.5μg膜加入到每个孔中，并在室温下、在暗处将该混合物培养90分钟，同时摇动。通过加入25mL 0.5M HCl来终止反应。利用闪烁近似测定法(RPA 542，Amersham，UK)测定形成的cAMP。给化合物绘制剂量-反应曲线，并使用GraphPad Prism软件计算EC50值。
本文使用的术语“促胰岛素分泌(insulinotropic)化合物的前体药物”是指给予患者之后能够转变为促胰岛素分泌(insulinotropic)化合物的化学修饰的化合物。这种前体药物典型地是促胰岛素分泌(insulinotropic)化合物的氨基酸延伸形式或酯。
本文使用的术语“exendin-4化合物”定义为：exendin-4(1-39)、其促胰岛素分泌(insulinotropic)片段、其促胰岛素分泌(insulinotropic)类似物和其促胰岛素分泌(insulinotropic)衍生物。exendin-4的促胰岛素分泌(insulinotropic)片段是促胰岛素分泌(insulinotropic)肽，其整个序列可以在exendin-4的序列中得到，并且已缺失至少一个端部氨基酸。exendin-4(1-39)的促胰岛素分泌(insulinotropic)片段的例子是exendin-4(1-38)和exendin-4(1-31)。可以利用本领域众所周知的体外或体内试验来测定化合物的促胰岛素分泌(insulinotropic)性能。例如，可以将化合物给予动物，并监控随时间变化的胰岛素浓度。exendin-4(1-39)的促胰岛素分泌(insulinotropic)类似物指的是相应的分子，在这种分子中，一个或多个氨基酸残基与其它氨基酸残基交换，和/或，已从其上除去一个或多个氨基酸残基，和/或，为其加上一个或多个氨基酸残基，条件是，所述类似物是促胰岛素分泌(insulinotropic)化合物，或是促胰岛素分泌(insulinotropic)化合物的前体药物。exendin-4(1-39)的促胰岛素分泌(insulinotropic)类似物的例子是Ser2Asp3-exendin-4(1-39)，在其中，分别用丝氨酸和门冬氨酸替换2和3位的氨基酸残基(这种特定类似物在本领域还称为exendin-3)。exendin-4(1-39)和其类似物的促胰岛素分泌(insulinotropic)衍生物是本领域技术人员所考虑的这些肽的衍生物，即，具有至少一个不存在于母体肽分子中的取代基，条件是，所述衍生物是促胰岛素分泌(insulinotropic)化合物或是促胰岛素分泌(insulinotropic)化合物的前体药物。取代基的例子是酰胺，碳水化合物，烷基，酯和亲脂性的取代基。exendin-4(1-39)和其类似物的促胰岛素分泌(insulinotropic)衍生物的例子是Tyr31-exendin-4(1-31)-酰胺。
本文使用的术语“稳定的exendin-4化合物”是指化学修饰的exendin-4(1-39)，即，显示出至少10小时的体内血浆消除半衰期(在人中，通过常规方法测定)的类似物或衍生物。
本文使用的术语“二肽基氨肽酶IV保护的exendin-4化合物”是指比exendin-4更耐受血浆肽酶二肽基氨肽酶IV(DPP-IV)的exendin-4化合物(利用二肽基氨肽酶IV保护的GLP-1化合物的定义下面所描述的试验来测定)。
GLP-1类似物可以是这样的类似物，其中天然存在的在GLP-1(7-37)的34位的Lys已被Arg取代。
此外，本发明包括促胰岛素分泌(insulinotropic)肽的前体或中间体的衍生物。
在本发明的一方面，胰高血糖素样肽是促胰岛素分泌(insulinotropic)肽。在进一步方面，促胰岛素分泌(insulinotropic)的胰高血糖素样肽选自GLP-1，GLP-2，exendin-4，exendin-3和其类似物和衍生物。
基于蛋白的构造稳定性的药物对于保持生物活性和对于使不可逆转的结构损失(由于变性和纤维化)最小化是重要的。尤其是，由于复杂的重折叠型式，大的促胰岛素分泌(insulinotropic)肽和蛋白在构型变化方面是不稳定的。此外，具有已知纤维化历史的促胰岛素分泌肽，例如GLP-1，尤其对三级结构的去稳定作用敏感(即，形成融球态)。
在一方面，按照本发明的胰高血糖素样肽的构成性氨基酸可以选自遗传密码编码的氨基酸，并且它们可以是天然氨基酸(不是遗传密码编码的)以及合成氨基酸。非遗传密码编码的天然氨基酸是例如羟脯氨酸，γ-羧基谷氨酸，鸟氨酸，磷酸丝氨酸，D-丙氨酸和D-谷酰胺。合成氨基酸包括通过化学合成制备的氨基酸，即遗传密码编码的氨基酸的D-异构体，例如D-丙氨酸和D-亮氨酸，Aib(α-氨基异丁酸)，Abu(α-氨基丁酸)，Tle(叔丁基甘氨酸)，β-丙氨酸，3-氨甲基苯甲酸，邻氨基苯甲酸。
在本发明的一方面，按照本发明要酰化的胰高血糖素样肽是GLP-1肽。在另一个方面，GLP-1肽选自∶
[去氨基His7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)酰胺，
[去氨基His7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)，
[去氨基His7,Arg34]GLP-1-(7-37)，
[Aib8,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)酰胺，
[去氨基His7,Glu22Arg26,Arg 34,Phe(m-CF3)28]GLP-1-(7-37)酰胺，
[去氨基His7,Glu22,Arg26,Arg34]GLP-1-(7-37)-Lys，
[去氨基His7,Glu22,Arg26,Arg34]GLP-1-(7-37)-Lys，
[去氨基His7,Arg26,Arg34,]GLP-1-(7-37)-Lys，
[去氨基His7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)酰胺，
[去氨基His7,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)酰胺，
[去氨基His7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)，
[去氨基His7,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)，
[去氨基His7,Glu22,Arg26,Glu30,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)，
[Aib8,Lys20,Arg26,Glu30,Thr(O-benzyl)33,]GLP-1-(7-37)酰胺，
[Aib8,Glu22,Arg26,Lys30]GLP-1-(7-37),[Aib8,Glu22,Arg26,Lys 31]GLP-1-(7-37)，
[Aib8,Lys20,Arg26,2-萘丙氨酸28,Glu30,]GLP-1(7-37)酰胺，
[Aib8,Glu22,Arg26,Arg34,]GLP-1-(7-37)-Lys，
[Aib8,Lys20,Arg 26,2-萘丙氨酸12,Glu30,]GLP-1-(7-37)酰胺，
[Aib8,Glu22,Arg26,Lys31,Arg34]GLP-1-(7-37)，
[Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37)，
[Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37)-酰胺，
[Aib8,Lys18,Arg26,Arg34]GLP-1(7-37)，
[Aib8,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)酰胺，
[Aib8,Lys 26]GLP-1(7-37)酰胺，
[Aib8,Arg34]GLP-1-(7-34)，
[Aib8,Arg34]GLP-1-(7-35)，
[Aib8,Lys33,Arg34]GLP-1-(7-34)，
[Aib8,Arg34]GLP-1-(7-36)酰胺，
[Aib8,Lys26,Arg34]GLP-1-(7-36)酰胺，
[Aib8,Glu22,Arg26,Arg34]GLP-1-(7-37)Lys，
[Aib8,Lys20,Glu22,Arg26,Glu30,Pro37]GLP-1-(7-37)酰胺，
[Aib8,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)酰胺，
[去氨基His7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)酰胺，
[去氨基His7,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)酰胺，
[Aib8,Glu22,Arg26,Glu30,Pro37]GLP-1-(7-37)Lys，
[Aib8,Aib35]GLP-1-(7-37)，
Arg34GLP-1-(7-37)，
[Aib8,Glu22,Arg26,Glu30,Pro37]GLP-1-((7-37)Lys，和
[Aib8,Arg26,Arg34]GLP-1-(7-37)。
在一方面，酰化的胰高血糖素样肽是利用本发明方法获得的。在另一个方面，利用本发明方法获得的酰化的胰高血糖素样肽是酰化的GLP-1肽。在又一个方面，酰化的GLP-1肽选自∶
N-ε26-[2-(2-(2-(2-[2-(2-[4-(15-羧基十五酰氨基)-4(S)-羧基丁酰基氨基)乙氧基)乙氧基]乙酰基)氨基)乙氧基)乙氧基)-乙酰基][Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37)肽，
N-ε26-[2-(2-(2-(2-[2-(2-[4-(16-羧基十六酰氨基)-4(S)-羧基丁酰基氨基)乙氧基)乙氧基]乙酰基)氨基)乙氧基)乙氧基)-乙酰基][Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37)肽，
N-ε26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-羧基十七酰氨基)-4(S)-羧基丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)-乙酰基][Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37)肽，
N-ε26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(18-羧基十八酰氨基)-4(S)-羧基丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)-乙酰基][Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37)肽，
N-ε26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(19-羧基十九酰氨基)-4(S)-羧基丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)-乙酰基][Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37)肽，
N-ε26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(20-羧基二十酰氨基)-4(S)-羧基丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)-乙酰基][Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37)肽，
N-ε26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(20-羧基二十一酰(-carboxuneeicosanoyl)氨基)-4(S)-羧基丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)-乙酰基][Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37)肽，
N-ε26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-羧基十七酰氨基)-4(R)-羧基丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)-乙酰基][Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37)肽，
N-ε26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-羧基十七酰氨基)-4(S)-羧基丙氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)-乙酰基][Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37)肽，
N-ε37-{2-(2-(2-(2-[2-(2-(4-(十六酰氨基)-4-羧基丁酰基氨基)乙氧基)乙氧基]乙酰基)乙氧基)乙氧基)乙酰基)}-[去氨基His7,Glu22,Arg26,Glu30,Arg34,Lys37](GLP-1-(7-37)酰胺，
N-ε37-{2-(2-(2-(2-[2-(2-(4-(十六酰氨基)-4-羧基丁酰基氨基)乙氧基)乙氧基]乙酰基)乙氧基)乙氧基)乙酰基)}-[去氨基His7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys 37](GLP-1-(7-37)酰胺，
N-ε37-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-十八酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基)[去氨基His7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)酰胺，
N-ε36-(2-(2-(2-((2-[2-(2-(17-羧基十七酰氨基)乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基)[Aib8,Glu22,Arg26,Glu30,Lys36]GLP-1-(7-37)Glu-酰胺，
N-ε37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(19-羧基十九酰氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基][去氨基His7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)，和
N-ε31-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[4-羧基-4-(17-羧基-十七酰氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基][Aib8,Glu22,Arg26,Lys31]GLP-1-(7-37)。
N-ε26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[4-羧基-4-(17-羧基-十七酰-氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)-乙酰基][Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37)肽GLP-1-(7-37)肽，
N-ε26-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基十七酰氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基]Aib8,Arg34]GLP-1(7-37)肽。
本发明还尤其适于胰岛素和其类似物的酰化。
在本发明的一方面，按照本发明要酰化的胰岛素是人胰岛素或人胰岛素类似物。按照本发明的人胰岛素类似物是这样的人胰岛素，与人胰岛素相比，其中一个或多个氨基酸已经被其它氨基酸残基替代，被插入，被从胰岛素中删除和/或被添加。在一方面，相对于人胰岛素的氨基酸序列，1和5个、1和4个、1和3个或1和2个之间的氨基酸已经被替代、插入、删除和/或添加。
按照本发明的胰岛素类似物的例子是这种胰岛素类似物：其中B链的28位中的Pro具有Asp、Lys、Leu、Val或Ala突变，和/或，在B29位的Lys具有Pro、Glu或Asp突变。此外，B3位的Asn可以具有Thr、Lys、Gln、Glu或Asp突变。A21位的氨基酸残基可以具有Gly突变。B1位的氨基酸可以具有Glu突变。B16位的氨基酸可以具有Glu或His突变。胰岛素类似物的进一步例子是：缺失性类似物，例如人胰岛素中的B30氨基酸缺失的类似物(des(B30)人胰岛素)，人胰岛素中的B1氨基酸缺失的胰岛素类似物(des(B1)人胰岛素)，des(B28-B30)人胰岛素和des(B27)人胰岛素。其中A链和/或B链具有N端延长的胰岛素类似物和其中A链和/或B链具有C端延长的胰岛素类似物，例如，两个精氨酸残基加到B链的C端，也是胰岛素类似物的例子。进一步实例是包含所提及突变的组合的胰岛素类似物。胰岛素类似物，其中在A14位的氨基酸是Asn、Gln、Glu、Arg、Asp、Gly和His，在B25位的氨基酸是His，并且其任选进一步包含一个或多个额外的突变，是胰岛素类似物的进一步的例子。人胰岛素的胰岛素类似物，其中在A21位的氨基酸残基是Gly，且其中该胰岛素类似物在C端进一步用两个精氨酸残基延长，也是胰岛素类似物的例子。
在一方面，胰岛素选自下面一组∶
人胰岛素，
DesB30人胰岛素，
AspB28人胰岛素，
AspB28,desB30人胰岛素，
LysB3,GluB29人胰岛素，
LysB28,ProB29人胰岛素，
GlyA21,ArgB31,ArgB32人胰岛素，
GluA14,HisB25人胰岛素，
HisA14,HisB25人胰岛素，
GluA14,HisB25,desB30人胰岛素，
HisA14,HisB25,desB30人胰岛素，
GluA14,HisB25,desB27,desB28,desB29,desB30人胰岛素，
GluA14,HisB25,GluB27,desB30人胰岛素，
GluA14,HisB16,HisB25,desB30人胰岛素，
HisA14,HisB16,HisB25,desB30人胰岛素，
HisA8,GluA14,HisB25,GluB27,desB30人胰岛素，
GluA14,HisB25,desB27,desB30人胰岛素，
GluA14,GlyA21,HisB25,desB30人胰岛素，
GluA14,HisB25,LysB27,desB28,desB29,desB30人胰岛素，
HisA8,GluA14,GluB1,GluB16,HisB25,GluB27,desB30人胰岛素，和
HisA8,GluA14,GluB16,HisB25,desB30人胰岛素。
在一方面，酰化的胰岛素肽是利用本发明方法获得的。在另一个方面，利用本发明方法获得的酰化的胰岛素肽选自下面一组∶
A14E,B25H,B29K(Nε十八烷二酰基-gGlu-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基))，desB30人胰岛素(替代名称∶A14E,B25H,B29K(Nε十八烷二酰基-gGlu-OEG-OEG)，desB30人胰岛素)，
A14E,B16H,B25H,B29K(Nε二十烷二酰基-gGlu-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基))，desB30人胰岛素(替代名称∶A14E,B16H,B25H,B29K(Nε二十烷二酰基-gGlu-OEG-OEG)，desB30人胰岛素)，
A14E,B25H,B29K((Nε二十烷二酰基-gGlu-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基))，desB27,desB30人胰岛素(替代名称∶A14E,B25H,B29K(Nε二十烷二酰基-gGlu-OEG-OEG),desB27,desB30人胰岛素)，
A14E,B25H,B27K(Nε十八烷二酰基-gGlu-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基))，desB28,desB29,desB30人胰岛素(替代名称∶A14E,B25H,B27K(Nε十八烷二酰基-gGlu-OEG-OEG),desB28,desB29,desB30人胰岛素)，
A14E,B25H,B27E,B29K(Nε二十烷二酰基-gGlu-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基))，desB30人胰岛素(替代名称∶A14E,B25H,B27E,B29K(Nε二十烷二酰基-gGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素)，
A14E,B25H,desB27,B29K(Nε十八烷二酰基-gGlu-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基))，desB30人胰岛素(替代名称∶A14E,B25H,desB27,B29K(Nε十八烷二酰基-gGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素)，
A14E,B25H,B29K((Nε二十烷二酰基-gGlu-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基))，desB30人胰岛素(替代名称∶A14E,B25H,B29K((Nε二十烷二酰基-gGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素)，
A14E,B16H,B25H,B29K(Nε十八烷二酰基-gGlu-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基))，desB30人胰岛素(替代名称∶A14E,B16H,B25H,B29K(Nε十八烷二酰基-gGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素)，和
A14E,A21G,B25H,B29K(Nε十八烷二酰基-gGlu-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基))，desB30人胰岛素(替代名称∶A14E,A21G,B25H,B29K(Nε十八烷二酰基-gGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素)。
肽和蛋白的制备方法在本领域为大家所熟知。肽或蛋白可以例如通过传统的肽合成方法制备，例如，使用t-Boc或Fmoc化学过程或其它沿用已久的技术的固相肽合成，参见例如Greene and Wuts,“Protective Groups in Organic Synthesis”,John Wiley&Sons,1999,“Organic Synthesis on solid Phase”,Florencio Zaragoza Wiley-VCH Verlag GmbH,D-69469Weinheim,2000,“Novabiochem Catalog”,Merck Biosciences 2006/2007和“FmocSolid Phase Peptide Synthesis”,Edited by W.C.Chan and P.D.White,Oxford University Press,2000,ISBN 0-19-963724-5。肽或蛋白也可以利用下列方法制备：包括，在合适的营养培养基中，在能够使肽或蛋白进行表达的条件下，将包含编码肽或蛋白并且能够表达肽或蛋白的DNA序列的宿主细胞进行培养。对于包含非天然氨基酸残基的肽或蛋白，应该修饰重组细胞，这样就可以使非天然的氨基酸结合进该肽或蛋白中，例如，通过使用tRNA突变体。
下面是本发明所进一步包括的方面的非限制性列表∶
1.选择性地酰化肽或蛋白中的一个氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有两个或多个反应性的亲核官能团，该方法包括∶
a)在水介质中，使具有至少两个反应性亲核官能团的肽或蛋白与通式I的酰化剂反应
其中
n是1-6
m是1-2
w是4-20
R1是离去基团，当所述酰化剂与游离胺反应时，其可以促进在R1连接的羰基和所述胺之间形成酰胺键。
其中水介质的pH值在pH8至pH14之间；和
b)分离N-酰化的肽或蛋白，
其中，获得N-酰化的肽或蛋白，其包含至少一个没有被酰化或仅仅被部分酰化的反应性亲核官能团。
2.按照方面1的选择性地酰化肽或蛋白中的一个氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有两个或多个反应性亲核官能团，其中所述反应性亲核官能团选自∶羟基，硫醇基和氨基。
3.按照方面1或2的选择性地酰化肽或蛋白中的一个氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有两个或多个反应性亲核官能团，其中所述反应性亲核官能团是氨基。
4.按照方面1-3的任一项的选择性酰化肽或蛋白中的一个氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有两个或多个反应性亲核官能团，其中获得N-酰化的肽或蛋白，其中酰化作用发生在赖氨酸的ε-位，并且肽或蛋白的至少一个游离氨基没有被酰化。
5.按照方面1-4的任一项的选择性地酰化肽或蛋白中的一个氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有两个或多个反应性亲核官能团，其中式I中的R1与R1相连接的羰基一起表示酯。
6.按照方面1-4的任一项的选择性地酰化肽或蛋白中的一个氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有两个或多个反应性亲核官能团，其中式I中的R1与R1相连接的羰基一起表示活化的酯。
7.按照方面1-4的任一项的选择性地酰化肽或蛋白中的一个氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有两个或多个反应性亲核官能团，其中式I中的R1与R1相连接的羰基一起表示活化的N-羟基酰亚胺酯。
8.按照前述方面任一项的选择性地酰化肽或蛋白中的一个氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有两个或多个反应性亲核官能团，其中n是1-5，或者1-2、1-3或1-4，或者2。
9.按照前述方面任一项的选择性地酰化肽或蛋白中的一个氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有两个或多个反应性亲核官能团，其中m是1-2，或者2。
10.按照前述方面任一项的选择性地酰化肽或蛋白中的一个氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有两个或多个反应性亲核官能团，其中w是4-20，或者10-20，或者14-18，或者14，或者16，或者18。
11.按照前述方面任一项的选择性地酰化肽或蛋白中的一个氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有两个或多个反应性亲核官能团，其中含水的反应混合物的pH值在pH9和pH13之间。
12.按照前述方面任一项的选择性地酰化肽或蛋白中的一个氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有两个或多个反应性亲核官能团，其中含水的反应混合物的pH值在pH10和pH12之间。
13.按照前述方面任一项的选择性地酰化肽或蛋白中的一个氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有两个或多个反应性亲核官能团，其中含水的反应混合物的pH值在pH10.5和pH11.5之间。
14.按照前述方面任一项的选择性地酰化肽或蛋白中的一个氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有两个或多个反应性亲核官能团，其中含水的反应混合物的pH值在pH11和pH12之间。
15.按照前述方面任一项的选择性地酰化肽或蛋白中的一个氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有两个或多个反应性亲核官能团，其中含水的反应混合物的pH值在pH11.5和pH12之间。
16.按照前述方面任一项的选择性地酰化肽或蛋白中的一个氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有两个或多个反应性亲核官能团，其中含水的反应混合物的pH值大约为pH11.5。
17.按照前述方面任一项的选择性地酰化肽或蛋白中的一个氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有两个或多个反应性亲核官能团，其中含水的反应混合物的pH值在pH11和pH12之间，例如，在pH11.0和11.5之间，或在pH11.0和11.3之间。
18.按照前述方面任一项的选择性地酰化肽或蛋白中的一个氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有两个或多个反应性亲核官能团，其中含水的反应混合物的pH值大约为pH11.3。
19.按照前述方面任一项的选择性地酰化肽或蛋白中的一个氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有两个或多个反应性亲核官能团，其中在酰化过程期间的反应混合物的温度在-5℃和50℃之间，例如在0℃和50℃之间。
20.按照前述方面任一项的选择性地酰化肽或蛋白中的一个氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有两个或多个反应性亲核官能团，其中在酰化过程期间的反应混合物的温度在10℃和30℃之间，例如，大约20℃或室温。
21.按照前述方面任一项的选择性地酰化肽或蛋白中的一个氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有两个或多个反应性亲核官能团，其中在酰化过程期间的反应混合物的温度在0℃和5℃之间，例如，在2和5℃之间。
22.按照前述方面任一项的选择性地酰化肽或蛋白中的一个氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有两个或多个反应性亲核官能团，其中在搅拌或搅动下、在0分钟和480分钟之间的期间内将酰化试剂加入到反应混合物中。
23.按照前述方面任一项的选择性地酰化肽或蛋白中的一个氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有两个或多个反应性亲核官能团，其中在30和60分钟之间的期间内加入所述试剂。
24.按照前述方面任一项的选择性地酰化肽或蛋白中的一个氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有两个或多个反应性亲核官能团，其中在加入酰化试剂之后，使酰化混合物在0和24小时之间保持反应。
25.按照前述方面任一项的选择性地酰化肽或蛋白中的一个氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有两个或多个反应性亲核官能团，其中在加入酰化试剂之后，立即通过将pH值调节至pH6.5-9.0来终止反应，例如，调节至例如pH7.5-8.0。
26.按照前述方面任一项的选择性地酰化肽或蛋白中的一个氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有两个或多个反应性亲核官能团，其中在加入酰化试剂之后，使酰化混合物在30和60分钟之间保持反应。
27.按照前述方面任一项的选择性地酰化肽或蛋白中的一个氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有两个或多个反应性亲核官能团，其中肽或蛋白以至少5.0mg/ml的浓度存在于反应混合物中。
28.按照前述方面任一项的选择性地酰化肽或蛋白中的一个氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有两个或多个反应性亲核官能团，其中肽或蛋白的浓度在10.0mg/ml和20.0mg/ml之间。
29.按照前述方面任一项的选择性地酰化肽或蛋白中的一个氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有两个或多个反应性亲核官能团，其中肽或蛋白的浓度是大约12.5mg/ml。
30.按照前述方面任一项的选择性地酰化肽或蛋白中的一个氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有两个或多个反应性亲核官能团，其中肽或蛋白的浓度是大约20mg/ml。
31.按照前述方面任一项的选择性地酰化肽或蛋白中的一个氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有两个或多个反应性亲核官能团，其中反应混合物包含缓冲液。
32.按照方面31的选择性地酰化肽或蛋白中的一个氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有两个或多个反应性亲核官能团，其中反应混合物包含选自下列的缓冲液：磷酸盐缓冲液，碳酸钠缓冲液，Bicine缓冲液(N,N-二(2-羟乙基)甘氨酸缓冲液)，HEPPS缓冲液(3-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]丙磺酸缓冲液)，HEPES缓冲液(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸缓冲液)，MOPS缓冲液(3-(N-吗啉基)丙磺酸缓冲液)或TEA缓冲液(三乙胺缓冲液)。
33.按照前述方面任一项的选择性地酰化肽或蛋白中的一个氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有两个或多个反应性亲核官能团，其中反应混合物包含缓冲液，其是磷酸盐缓冲液。
34.按照前述方面任一项的选择性地酰化肽或蛋白中的一个氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有两个或多个反应性亲核官能团，其中以固体形式将酰化试剂加入到溶液中。
35.按照前述方面任一项的选择性地酰化肽或蛋白中的一个氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有两个或多个反应性亲核官能团，其中以溶液形式加入酰化试剂，该溶液包含溶解在惰性溶剂中的酰化试剂。
36.按照前述方面任一项的选择性地酰化肽或蛋白中的一个氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有两个或多个反应性亲核官能团，其中惰性溶剂选自N-甲基吡咯烷酮、N,N-二甲基甲酰胺和乙腈。
37.按照前述方面任一项的选择性地酰化肽或蛋白中的一个氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有两个或多个反应性亲核官能团，其中以10mg/ml和250mg/ml之间的浓度将酰化试剂加入到反应混合物中。
38.按照前述方面任一项的选择性地酰化肽或蛋白中的一个氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有两个或多个反应性亲核官能团，其中步骤(a)的反应是使用1:1至1:5摩尔比的蛋白和式I的酰化剂来进行的。
39.按照前述方面任一项的选择性地酰化肽或蛋白中的一个氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有两个或多个反应性亲核官能团，其中将肽或蛋白预先溶解在-10至30℃的水溶液中，并使用碱金属氢氧化物、碱金属碳酸盐或叔胺碱将pH值调节至目标水平，而后加入酰化剂。
40.按照前述方面任一项的选择性地酰化肽或蛋白中的一个氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有两个或多个反应性亲核官能团，其中要被酰化的肽或蛋白是适合于治疗糖尿病的肽或蛋白。
41.按照前述方面任一项的选择性地酰化肽或蛋白中的一个氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有两个或多个反应性亲核官能团，其中要被酰化的肽或蛋白是适合于治疗肥胖症的肽或蛋白。
42.按照前述方面任一项的选择性地酰化肽或蛋白中的一个氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有两个或多个反应性亲核官能团，其中要被酰化的肽或蛋白是胰高血糖素样肽或胰岛素。
43.按照方面42的选择性地酰化肽或蛋白中的一个氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有两个或多个反应性亲核官能团，其中要被酰化的肽或蛋白是胰高血糖素样肽。
44.按照方面43的选择性地酰化肽或蛋白中的一个氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有两个或多个反应性亲核官能团，其中胰高血糖素样肽是二肽基氨肽酶IV保护的胰高血糖素样肽。
45.按照方面43或44的任一项的选择性地酰化肽或蛋白中的一个氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有两个或多个反应性亲核官能团，其中胰高血糖素样肽选自胰高血糖素肽，GLP-1肽，GLP-2肽，exendin-3肽和exendin-4肽。
46.按照方面45的选择性地酰化肽或蛋白中的一个氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有两个或多个反应性亲核官能团，其中胰高血糖素样肽是GLP-1肽。
47.按照方面46的选择性地酰化肽或蛋白中的一个氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有两个或多个反应性亲核官能团，其中GLP-1肽选自∶
GLP-1(7-37),GLP-1(7-36)酰胺，Gly8-GLP-1(7-37)，Val8-GLP-1(7-36)-酰胺和[Val8Asp22]-GLP-1(7-37)，
[去氨基His7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)酰胺，
[去氨基His7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)，
[去氨基His7,Arg34]GLP-1-(7-37),[Aib8,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)酰胺，
[去氨基His7,Glu22Arg26,Arg 34,Phe(m-CF3)28]GLP-1-(7-37)酰胺，
[去氨基His7,Glu22,Arg26,Arg34]GLP-1-(7-37)-Lys，
[去氨基His7,Glu22,Arg26,Arg34]GLP-1-(7-37)-Lys，
[去氨基His7,Arg26,Arg34,]GLP-1-(7-37)-Lys，
[去氨基His7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)酰胺，
[去氨基His7,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)酰胺，
[去氨基His7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)，
[去氨基His7,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)，
[去氨基His7,Glu22,Arg26,Glu30,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)，[Aib8,Lys20,Arg26,Glu30,Thr(O-苄基)33,]GLP-1-(7-37)酰胺，[Aib8,Glu22,Arg26,Lys30]GLP-1-(7-37)，[Aib8,Glu22,Arg26,Lys31]GLP-1-(7-37)，[Aib8,Lys20,Arg26,2-萘丙氨酸28,Glu30,]GLP-1(7-37)酰胺，[Aib8,Glu22,Arg26,Arg34,]GLP-1-(7-37)-Lys，[Aib8,Lys20,Arg 26,2-萘丙氨酸12,Glu30,]GLP-1-(7-37)酰胺，[Aib8,Glu22,Arg26,Lys31,Arg34]GLP-1-(7-37)，[Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37)，[Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37)-酰胺，[Aib8,Lys18,Arg26,Arg34]GLP-1(7-37)，[Aib8,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)酰胺，[Aib8,Lys 26]GLP-1(7-37)酰胺，[Aib8,Arg34]GLP-1-(7-34)，[Aib8,Arg34]GLP-1-(7-35)，[Aib8,Lys33,Arg34]GLP-1-(7-34)，[Aib8,Arg34]GLP-1-(7-36)酰胺，[Aib8,Lys26,Arg34]GLP-1-(7-36)酰胺，[Aib8,Glu22,Arg26,Arg34]GLP-1-(7-37)Lys，[Aib8,Lys20,Glu22,Arg26,Glu30,Pro37]GLP-1-(7-37)酰胺，[Aib8,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)酰胺，
[去氨基His7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)酰胺，
[去氨基His7,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)酰胺，[Aib8,Glu22,Arg26,Glu30,Pro37]GLP-1-(7-37)Lys，[Aib8,Aib35]GLP-1-(7-37)，Arg34GLP-1-(7-37)，[Aib8,Glu22,Arg26,Glu30,Pro37]GLP-1-((7-37)Lys和[Aib8,Arg26,Arg34]GLP-1-(7-37)。
48.按照方面42的选择性地酰化肽或蛋白中的一个氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有两个或多个反应性亲核官能团，其中要被酰化的肽或蛋白是胰岛素。
49.按照方面48的选择性地酰化肽或蛋白中的一个氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有两个或多个反应性亲核官能团，其中胰岛素是人胰岛素或人胰岛素类似物，其中人胰岛素类似物是这样的人胰岛素：与人胰岛素相比，1和5个之间的氨基酸已经被其它氨基酸残基替代、被插入、从胰岛素上删除和/或被添加。
50.按照方面49的选择性地酰化肽或蛋白中的一个氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有两个或多个反应性亲核官能团，其中胰岛素选自∶
人胰岛素,DesB30人胰岛素，AspB28人胰岛素，AspB28,desB30人胰岛素，LysB3,GluB29人胰岛素，LysB28,ProB29人胰岛素，GlyA21,ArgB31,ArgB32人胰岛素，GluA14,HisB25人胰岛素，HisA14,HisB25人胰岛素，GluA14,HisB25,desB30人胰岛素，HisA14,HisB25,desB30人胰岛素，GluA14,HisB25,desB27,desB28,desB29,desB30人胰岛素，GluA14,HisB25,GluB27,desB30人胰岛素，GluA14,HisB16,HisB25,desB30人胰岛素，HisA14,HisB16,HisB25,desB30人胰岛素，HisA8,GluA14,HisB25,GluB27,desB30人胰岛素，HisA8,GluA14,GluB1,GluB16,HisB25,GluB27,desB30人胰岛素，和HisA8,GluA14,GluB16,HisB25,desB30人胰岛素。
51.按照前述方面任一项的选择性地酰化肽或蛋白中的一个氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有两个或多个反应性亲核官能团，其中获得N-酰化的肽或蛋白，其包含至少一个没有被酰化的游离氨基。
52.按照前述方面任一项的选择性地酰化肽或蛋白中的一个氨基的方法，其中要被酰化的肽或蛋白具有两个游离氨基，并且仅仅一个氨基被酰化。
实施例
实施例1∶1,18-十八烷二酸单苄基酯的制备
将1,18-十八烷二酸(75g，0.24mol)、对甲苯磺酸一水合物(2.27g，11.9mmol)和苯甲醇(20.7g，0.19mol)的甲苯(2.75L)溶液回流加热3小时。在回流期间，通过共沸蒸馏除去水。加入硅藻土(25g)，并将混合物冷却至40℃，额外搅拌1小时。通过硅胶塞过滤来纯化混合物，使用甲苯作为流动相。收集包含1,18-十八烷二酸一苄基酯的馏份，并在75℃真空蒸馏，以减少体积。将溶液冷却至50℃，加入庚烷，并将混合物冷却至35℃。一旦结晶，用15分钟时间额外加入庚烷，并最终将混合物冷却至10℃，额外保持1小时。过滤收集产物，用庚烷洗涤，真空干燥。1,18-十八烷二酸一苄基酯的产率是34g(35％)。
实施例2∶18-[(2,5-二氧代-1-吡咯烷基)氧基]-18-氧代十八烷酸苄基酯的制备
将1,18-十八烷二酸一苄基酯(120g，0.3mol)、N-羟基琥珀酰亚胺(41g，0.36mol)和N,N-二环己基碳二亚胺(74g，0.36mol)溶解在NMP(1200mL)中，并加热到60℃，保持2.5小时。将反应混合物冷却至25℃，过滤除去沉淀，并用水(4.7L)洗涤。用2-丙醇(1250mL)将粗品沉淀重结晶，得到18-[(2,5-二氧代-1-吡咯烷基)氧基]-18-氧代十八烷酸苄基酯。产率138g(92％)。
实施例3∶18-({(1S)-1-[(苄氧基)羰基]-4-[(2,5-二氧代-1-吡咯烷基)氧基]-4-氧代丁基}氨基)-18-氧代十八烷酸苄基酯的制备
将18-[(2,5-二氧代-1-吡咯烷基)氧基]-18-氧代十八烷酸苄基酯(30g，60mmol)和L-谷氨酸α-苄基酯(15g，62.8mmol)溶解在NMP中，并在50℃加热4小时。在25℃，加入水(700ml)、KHSO4(100ml，0.5M水溶液)和乙酸乙酯(220ml)。用KHSO4(水溶液，150ml，0.17M)洗涤有机相两次，真空蒸发。将该混合物再溶解在NMP(225ml)中，加入N-羟基琥珀酰亚胺(11g，95.7mmol)和N,N-二环己基碳二亚胺(16g，77.7mmol)，并将溶液搅拌16小时。过滤除去沉淀，并用水(1L)洗涤。用2-丙醇将粗品沉淀重结晶，得到18-[(2,5-二氧代-1-吡咯烷基)氧基]-18-氧代十八烷酸苄基酯。产率32.7g(76％)。
实施例4∶(22S)-22-羧基-1-[(2,5-二氧代-1-吡咯烷基)氧基]-1,10,19,24-四氧代-3,6,12,15-四氧杂-9,18,23-三氮杂四十一烷-41-酸(化合物1)的制备
将18-[(2,5-二氧代-1-吡咯烷基)氧基]-18-氧代十八烷酸苄基酯(100g，138.7mmol)和17-氨基-10-氧代-3,6,12,15-四氧杂-9-氮杂十七烷-1-酸(44.9g，145.6mmol)悬浮在乙腈(1L)中。加入三乙胺(20.8ml，150mmol)，并将混合物搅拌16小时。加入水(3L)、KHSO4(0.5M水溶液，1L)和乙酸乙酯(1L)。真空蒸发有机相，并与甲苯(2x300ml)共同蒸发两次。加入N-羟基琥珀酰亚胺(17.6g，153mmol)、1-乙基-3-(3'-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(31.9g，166.5mmol)和2-丙醇(1L)，并将溶液搅拌16小时。加入二氯甲烷(1L)、水(3L)和KHSO4(0.5M水溶液，1L)。收集有机相，用MgSO4干燥，过滤，真空蒸发，并与甲苯(2x300ml)共同蒸发两次。加入2-丙醇(1300ml)和Pd/C(14g)，并将混合物氢化2小时。将混合物加热至39℃，过滤。将溶液冷却，并过滤收集沉淀。产率100g(87％)。
实施例5∶分析HPLC
下列HPLC梯度用于分析所获得的酰化产物
缓冲液A∶1800ml Milli-Q水，200ml乙腈和2ml H3PO4
缓冲液B∶1800ml乙腈，200ml Milli-Q水和2ml H3PO4
柱∶Jupiter 4μProteo 90A kolonne fra Phenomenex。
表5.1给出梯度
表5.1
实施例6∶用22-羧基-1-[(2,5-二氧代-1-吡咯烷基)氧基]-1,10,19,24-四氧代-3,6,12,15-四氧杂-9,18,23-三氮杂四十一烷-41-酸(化合物1)酰化[Aib8，Arg34]GLP-1(7-37)
常规实验∶在配备磁性搅拌棒的圆底烧瓶中加入肽中间体[Aib8，Arg34]GLP-1(7-37)肽和MilliQ水，形成具有表6.1所给出的浓度的悬浮液。将该圆底烧瓶浸入装有水的大容器(2L)中，通过Julabo HL-4加热循环器将其调节至20度的固定温度。用2个独立的IUPAC标准缓冲液(pH9.18和12.45)校准Radiometer PHM290恒pH控制器，并且与Radiometer ABU901自动滴定仪(2ml)(配备NaOH水溶液(0.1M))连接。将电极浸到混合物中(典型地，pH＝2.5)。加入4M NaOH，达到固定的pH给定值(参见表6.1的pH值详细说明)。用1H-NMR(带有内标)评估酰化剂(化合物1)，而后使用。给注射泵安装注射器，其中包含10％w/w酰化剂的NMP溶液(相对于肽中间体，大约3eq)，并用60分钟连续地逐滴加入到肽中间体的溶液中(即，大约1eq酰化剂/20分钟)。用PHM290控制器将pH值固定到给定值。经过合适间隔获取多个IPC，并用HPLC(260nm，实施例5)分析，表6.1中给出了％面积。
表6.1
*在20℃测定pH值。
实施例7∶用22-羧基-1-[(2,5-二氧代-1-吡咯烷基)氧基]-1,10,19,24-四氧代-3,6,12,15-四氧杂-9,18,23-三氮杂四十一烷-41-酸(化合物2)酰化[Aib8，Arg34]GLP-1(7-37)
将[Aib8，Arg34]GLP-1(7-37)肽(10.0g，2.94mmol)悬浮在水中，达到浓度大约15g/L，用NaOH(1M水溶液)将pH值调节至11.25，并加入水，使最终肽浓度为大约12.5g/L。将酰化剂22-羧基-1-[(2,5-二氧代-1-吡咯烷基)氧基]-1,10,19,24-四氧代-3,6,12,15-四氧杂-9,18,23-三氮杂四十一烷-41-酸(化合物1，3.7g，4.41mmol)溶解在NMP(10％w/v)中，并逐步加入到水溶液中。在反应期间，通过连续加入NaOH(1M水溶液)，使pH值在11.1和11.3之间保持不变。在反应期间，取出样品，并用RP HPLC(按照实施例5的梯度)分析。加入酰化剂过程结束之后，额外搅拌反应混合物60分钟，而后通过加入硫酸(1M水溶液)将pH值调节至大约7.5。HPLC(260nm，实施例5)，面积％：92.6％，产率(用带标准品的试验滴定法)：91.5％。
实施例8∶用22-羧基-1-[(2,5-二氧代-1-吡咯烷基)氧基]-1,10,19,24-四氧代-3,6,12,15-四氧杂-9,18,23-三氮杂四十一烷-41-酸(化合物1)酰化[Aib8，Arg34]GLP-1(7-37)
实验∶向配备磁性搅拌棒的圆底烧瓶中加入肽中间体[Aib8，Arg34]GLP-1(7-37)肽(234mg，0.069mmol)和MilliQ水(18.3ml)，形成悬浮液。用2个独立的IUPAC标准缓冲液(pH9.18和12.45)将pH计校准，并浸入到溶液中。加入Et3N，直到pH10为止。用1H-NMR(带有内标)评估化合物1，而后使用。给注射泵安装注射器，其中包含10％w/w酰化剂(化合物1，120mg，0.144mmol)的NMP溶液，并将该溶液连续地逐滴加入到肽中间体溶液中。在加入期间，使pH值保持在9.8和10.4之间。用AcOH将pH值调节至7.2，并用HPLC(260nm)分析，下表给出了％面积。
实施例9∶1,16-十六烷二酸一苄基酯的制备
将十六烷二酸(20.0g，69.8mmol)和DowexR悬浮在正辛烷中，并加热至回流。加入甲酸苄酯(22.0g，162mmol)。6小时之后，额外加入甲酸苄酯(22.0g，162mmol)。继续加热50小时。在80℃过滤反应混合物。将滤液冷却至20℃，并过滤收集沉淀。将粗品(20.2g)悬浮在二氯甲烷(220ml)中，在20℃保持4小时。过滤悬浮液，并在20-30℃将滤液真空至干燥。用2-丙醇(140ml)将得到的固体(13.9g)重结晶。
将产物过滤分离，在30-40℃减压干燥至恒重。产率∶10.2g(39％)白色物质。
实施例10∶(S)-2-(15-苄氧羰基-十五酰氨基)-戊二酸5-苄基酯1-(2,5-二氧代-吡咯烷-1-基)酯的制备
在35-40℃，将1,16-十六烷二酸一苄基酯(20.0g，53.1mmol)溶解在丙酮中。加入N-羟基琥珀酰亚胺(6.42g，55.8mmol)。向得到的溶液中加入二环己基碳二亚胺(DCC)(12.1g，58.4mmol)。在35℃，将反应混合物搅拌3-4小时。向得到的悬浮液中加入三乙胺(7.40ml，53.1mmol)和L-谷氨酸α-苄基酯(12.6g/53.1mmol)。在35-40℃，将反应混合物搅拌8-16小时。将反应混合物冷却至20-25℃。加入甲磺酸(3.45ml，53.1mmol)和DCC(12.1g，53.1mmol)。在20-25℃，将反应混合物搅拌8-16小时。过滤反应混合物，并将滤液真空干燥。在水(100ml)和甲苯(200ml)之间分配残余物。通过蒸出水来干燥甲苯相。将硅胶(20g)加入到残余物中。将悬浮液在20-25℃搅拌30分钟，随后过滤。通过减压蒸发，将滤液的体积减少到大约100-120ml。在15-30分钟期间内加入正庚烷(150ml)。将得到的悬浮液搅拌2小时。将产物过滤分离，在20-25℃减压干燥至恒重。产率21g(58％)白色物质。
实施例11∶(22S)-22-羧基-1-[(2,5-二氧代-1-吡咯烷基)氧基]-1,10,19,24-四氧代-3,6,12,15-四氧杂-9,18,23-三氮杂三十九烷-39-酸(化合物2)的制备
将(S)-2-(15-苄氧羰基-十五酰氨基)-戊二酸5-苄基酯1-(2,5-二氧代-吡咯烷-1-基)酯(4g，5.77mmol)和17-氨基-10-氧代-3,6,12,15-四氧杂-9-氮杂十七烷-1-酸(1.8g，5.95mmol)悬浮在NMP(20ml)中，并将该混合物搅拌16小时。加入N-羟基琥珀酰亚胺(0.94g，8.12mmol)和N,N-二环己基碳二亚胺(2.15，10mmol)，并将得到的溶液搅拌大约16小时。加入水(150ml)和乙酸乙酯(30ml)，收集有机相，用MgSO4干燥，真空蒸发。将该半固体再溶解在丙酮中，加入Pd/C(0.5g)，并将该混合物氢化2小时。过滤该混合物，并真空蒸发。产率3.69g(88％)。
实施例12∶用化合物2选择性地酰化[Aib8，Arg34]GLP-1(7-37)
如实施例6所述，按照常规酰化方法中所描述的方法进行酰化。
使用的条件是∶
实施例13∶酰化剂化合物3-5的固相合成。
使用下述步骤，在固相上合成化合物3-5∶
加载∶在配备中心机械teflon涂层的搅拌器的固相肽反应器中，将2-氯三苯甲基氯树脂在DCM中溶胀。加入Fmoc-8-氨基-3,6-二烷酸(1eq)和DIPEA(1.1eq)的DCM溶液，并将得到的混合物在室温搅拌16小时。排出树脂，用DCM:MeOH:DIPEA(80:15:5)的混合物封盖树脂上未反应的位点，并随后用DCM和NMP洗涤。
伸长∶
1)脱保护过程∶将树脂上的Fmoc-基团脱保护；用哌啶/NMP(20％溶液)处理树脂，并用NMP洗涤。
2)随后的偶合过程∶将氨基酸或18-({(1S)-1-[(苄氧基)羰基]-4-[(2,5-二氧代-1-吡咯烷基)氧基]-4-氧代丁基}氨基)-18-氧代十八烷酸苄基酯(2eq，与原始树脂载量相比)溶解在NMP中。用N-羟基苯并三唑(HOBt)和N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIPCDI)将氨基酸预活化15-30分钟，或将氨基酸的琥珀酰亚胺酯或18-({(1S)-1-[(苄氧基)羰基]-4-[(2,5-二氧代-1-吡咯烷基)氧基]-4-氧代丁基}氨基)-18-氧代十八烷酸苄基酯溶解在NMP中，而后加入到树脂中。任选，30至60分钟之后，加入DIPEA，并在室温下将该混合物搅拌1小时至16小时之间。如果游离胺的试验是阴性(Kaiser试验)，偶合循环完成，用NMP洗涤树脂，并准备移到连续的循环步骤中。
裂解过程∶用DCM:MeOH(1:1)、DCM洗涤树脂，并用DCM:TIPS:TFA(95.5:2.5:2)的混合物处理10分钟，将裂解混合物排到DIPEA中，获得pH>7的溶液。重复该裂解处理。用枸橼酸(10％水溶液，3X)、盐水(1X)洗涤粗品溶液，用MgSO4干燥，真空蒸发。将油状残余物与甲苯共同蒸发两次。
活化∶将得到的残余物和N-羟基琥珀酰亚胺(1.1eq)溶解在EtOAc中。加入N,N'-二环己基碳二亚胺(1.3eq)，并将混合物搅拌大约16小时。过滤该混合物，并真空蒸发。
叔丁基酯的脱保护∶将半固体溶解在TFA和DCM中，搅拌2小时，随后真空蒸发，并与甲苯共同蒸发两次，而后用2-丙醇重结晶。
苄基酯的脱保护∶将半固体溶解在2-丙醇中，加入Pd/C，并将得到的混合物氢化2小时，加热到45℃，过滤，冷却至5℃。过滤收集得到的晶体。
实施例14∶化合物3的制备∶19-((S)-1-羧基-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-二氧代-吡咯烷-1-基氧基羰基甲氧基)乙氧基]乙基氨基甲酰基}甲氧基)乙氧基]乙基氨基甲酰基}丙基氨基甲酰基)十九烷酸
按照实施例13所描述的一般方法，在固相上制备该化合物，使用1,20-二十烷二酸一叔丁基酯、N-(9-芴甲氧羰基)-L-谷胺酸α-叔丁基酯和8-(9-芴甲氧羰基-氨基)-3,6-二氧杂辛酸。
实施例15∶用化合物3选择性地酰化[Aib8，Arg34]GLP-1(7-37)肽
如实施例6所述，按照常规酰化方法中所描述的方法进行酰化。
使用的条件是∶
实施例16∶制备化合物4：17-((S)-1-羧基-3-{2-[2-(2,5-二氧代-吡咯烷-1-基氧基羰基甲氧基)-乙氧基]-乙基氨基甲酰基}-丙基氨基甲酰基)-十七酸
按照实施例13所描述的一般方法，在固体载体上制备该化合物，使用18-({(1S)-1-[(苄氧基)羰基]-4-[(2,5-二氧代-1-吡咯烷基)氧基]-4-氧代丁基}氨基)-18-氧代十八烷酸苄基酯和8-(9-芴甲氧羰基-氨基)-3,6-二氧杂辛酸。
实施例17∶用化合物4选择性地酰化[Aib8，Arg34]GLP-1(7-37)肽
如实施例6所述，按照常规酰化方法中所描述的方法进行酰化。
使用的条件是∶
实施例18∶制备化合物5：17-((S)-1-羧基-3-{2-[2-({2-[2-({2-[2-(2,5-二氧代-吡咯烷-1-基氧基羰基甲氧基)-乙氧基]-乙基氨基甲酰基}-甲氧基)-乙氧基]-乙基氨基甲酰基}-甲氧基)-乙氧基]-乙基氨基甲酰基}-丙基氨基甲酰基)-十七烷酸
按照实施例13所描述的一般方法，在固体载体上制备该化合物，使用18-({(1S)-1-[(苄氧基)羰基]-4-[(2,5-二氧代-1-吡咯烷基)氧基]-4-氧代丁基}氨基)-18-氧代十八烷酸苄基酯和8-(9-芴甲氧羰基-氨基)-3,6-二氧杂辛酸。
实施例19∶用化合物5选择性地酰化[Aib8，Arg34]GLP-1(7-37)肽
如实施例6所述，按照常规酰化方法中所描述的方法进行酰化。
使用的条件是∶
实施例20∶化合物6的制备
如实施例14所述，制备该化合物。
实施例21∶用化合物6选择性地酰化[Aib8，Arg34]GLP-1(7-37)
如实施例6所述，按照常规酰化方法中所描述的方法进行酰化。
使用的条件是∶
实施例22∶(S)-2-(15-羧基-十五酰氨基)-戊二酸5-(2,5-二氧代-吡咯烷-1-基)酯的制备
将(S)-2-(15-苄氧羰基-十五酰氨基)-戊二酸5-苄基酯1-(2,5-二氧代-吡咯烷-1-基)酯(5.0g，7.3mmol)溶解在包含三氟乙酸(95μl)的丙酮(95ml)中。加入10％钯/碳(0.50g)。在搅拌下，在30-35℃，加入氢气。当氢的消耗终止时，过滤反应混合物。将滤液冷却至20℃，在15-30分钟期间内加入正庚烷(140ml)。将得到的悬浮液冷却至0-5℃，保持2-3小时。将产物过滤分离，在20-25℃减压干燥至恒重。产率3g(84％)白色物质。
通过质子NMR(Bruker 600MHz)分析产物，使用丙酮-d6作为溶剂。
用1D光谱进行质子NMR归属(内标是TMS，在δ0.0ppm)∶
实施例23∶用(S)-2-(15-羧基十五酰氨基)戊二酸5-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)酯酰化人胰岛素的B29位赖氨酸中的desB30ε-氨基
将4g的desB30人胰岛素悬浮在64g净化水中。加入1.85ml三乙基胺(TEA)，以便溶解desB30人胰岛素，并将pH值提高至11.4-12.0。将溶液冷却至2-5℃。
将448mg的l-2-(15-羧基-十五酰氨基)-戊二酸5-(2,5-二氧代-吡咯烷-1-基)酯溶解在用10μl 5％硫酸稳定的3.5g NMP(N-甲基-2-吡咯烷酮)中。
将desB30人胰岛素溶液搅拌，并用20分钟时间加入(S)-2-(15-羧基-十五酰氨基)戊二酸5-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)酯溶液，同时保持低温。
加入(S)-2-(15-羧基-十五酰氨基)戊二酸5-(2,5-二氧代-吡咯烷-1-基)酯之后，用2.5重量的由下列组成的溶液稀释反应混合物∶三-羟甲基氨基甲烷(20mmol/kg)，乙酸铵(30mmol/kg)，乙醇42.5％w/w，其余的为净化水，pH7.5。
稀释之后，通过慢慢地加入1M乙酸将pH值调节至7.5，同时搅拌。
HPLC分析证明，形成72.11％LysB29(Nε-十六烷二酰基-γ-谷氨酰)des(B30)人胰岛素，14.22％残余物为desB30人胰岛素。
实施例24∶用15-[3-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基氧基羰基)-丙基氨基甲酰基]十五酸酰化人胰岛素B29位赖氨酸中的desB30ε-氨基
将35g的desB30人胰岛素悬浮在539g冷却的14mM EDTA中。将该溶液冷却至2-5℃。加入15.6g 4M NaOH和21.9g三乙基胺(TEA)，以便溶解desB30人胰岛素，并将pH值提高至12.7。
将4.1g的15-[3-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基氧基羰基)-丙基氨基甲酰基]十五酸溶解在用10μl 5％硫酸稳定的82.1g NMP(N-甲基-2-吡咯烷酮)中。
将该desB30人胰岛素溶液搅拌，并用20分钟时间加入15-[3-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基氧基羰基)-丙基氨基甲酰基]十五酸溶液，同时保持低温。
加入15-(3-羧基丙基氨基甲酰基)十五酸苄基酯之后，用2.5重量的由下列组成的溶液稀释反应混合物∶三-羟甲基氨基甲烷(20mmol/kg)，乙酸铵(30mmol/kg)，乙醇42.5％w/w，其余的为净化水，pH7.0。
稀释之后，通过慢慢地加入1M乙酸将pH值调节至7.6，同时搅拌，并使温度升高至室温。
HPLC分析证明，形成68.1％LysB29(Nε-十六烷二酰基-γ-谷氨酰)des(B30)人胰岛素。
实施例25∶分析HPLC
将150X 4.6mm I.D.柱填充辛基二甲基甲硅烷基取代的硅胶(具有大约的孔径，大约3.5μm的粒径)，并在40℃、用由下列组成的混合物平衡(流速1ml/min)：1)20mMNaH2PO4.H2O和100mmol Na2SO4的缓冲液，用NaOH调节至pH5.9(在缓冲水溶液中)，和2)包含42.8％w/w乙腈的乙腈溶剂，以便产生25％(w/w)乙腈。
当分析时，大约20分钟之后，LysB29(Nε-十六烷二酰基-γ-谷氨酰)des(B30)人胰岛素从柱中排出。当分析时，大约6分钟之后，desB30人胰岛素从柱中排出。
实施例26∶液相方法制备19-((S)-1-羧基-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-二氧代-吡咯烷-1-基氧基羰基甲氧基)乙氧基]乙基氨基甲酰基}甲氧基)乙氧基]乙基氨基甲酰基}丙基氨基甲酰基)十九烷酸(替代名称∶二十烷二酰基-gGlu-OEG-OEG-OSu)。
LCMS方法(LCMS)∶
从Waters Alliance HT HPLC系统中洗脱之后，用Waters Micromass ZQ质谱仪鉴定样品的质谱。
洗脱液∶
A：0.1％三氟乙酸，在水中
B：0.1％三氟乙酸，在乙腈中
柱∶Phenomenex,Jupiter C450X 4.60mm,id:5μm
梯度∶10％-90％B，用7.5min，1.0ml/min
柱∶Phenomenex,Jupiter 5μC450x 4.60mm
LC方法∶10-90％B 10min:A:0.1％CH3CN B:CH3CN:
0-7.5min:10-90％B
7.5-8.5min:90-10％B
8.5-9.5min 10％B
流速:1ml/min
9.5-10.00min 10％B
流速:0.1ml/min
二十烷二酸叔丁基酯N-羟基琥珀酰亚胺酯∶
将二十烷二酸单-叔丁基酯(5g，12.54mmol)和TSTU(4.53g，15.05mmol)在THF(50ml)中混合，加入DIPEA(2.62ml)，并将得到的浑浊混合物在室温搅拌2小时，然后加入DMF(30mL)，产生澄清溶液，将其进一步搅拌过夜。将得到的混合物蒸发几乎至干，并将残余物与冷乙腈混合，产生沉淀。将其过滤并真空干燥过夜，得到6.01g(97％)二十烷二酸叔丁基酯N-羟基琥珀酰亚胺酯。
MS(电喷雾)∶m/z:440(M-56(tBu)).
(S)-2-(19-叔丁氧羰基十九酰氨基)戊二酸1-叔丁基酯
将二十烷二酸叔丁基酯2,5-二氧代-吡咯烷-1-基酯(6.01g，12.124mmol)溶解在THF(150ml)中，并与H-Glu-OtBu(2.71g，13.33mmol)在DMF/水(1/1，40mL)中的浆液混合。这会产生胶状的溶液，将其加热，得到澄清溶液，将其在室温下搅拌3小时。然后蒸发该溶液，加入100mL水，并将该混合物加热至60℃，产生溶液，其冷却后结晶。用乙腈将沉淀重结晶，并将晶体真空干燥。产率6.82g(96％)。
MS((电喷雾)∶m/z 584(M+1).
(S)-2-(19-叔丁氧羰基十九酰氨基)戊二酸1-叔丁基酯5-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)酯
将(S)-2-(19-叔丁氧羰基十九酰氨基)戊二酸1-叔丁基酯(6.52g，11.17mmol)溶解在THF(100ml)中，加入DIPEA(2.14ml)，而后加入TSTU(3.70g，12.29mmol)的乙腈(25ml)溶液。将该混合物在室温搅拌过夜，然后蒸发，产生淡褐色的残余物，将其用乙腈重结晶。在5℃冷却过夜后，形成粉末。将其溶解在THF中，用MgSO4干燥，过滤，蒸干，得到6.17g(81％)标题化合物。
MS((电喷雾)∶m/z:681(M+1).
19-{(S)-1-叔丁氧羰基-3-[2-(2-{[2-(2-羧基甲氧基乙氧基)乙基氨基甲酰基]甲氧基}乙氧基)乙基氨基甲酰基]丙基氨基甲酰基}十九烷酸叔丁基酯(替代名称∶tBu-二十烷二酰基-gGlu(OtBu)-OEG-OEG-OH)
向2-(19-叔丁氧羰基十九酰氨基)戊二酸1-叔丁基酯5-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)酯(2.50g)和[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基}乙氧基)乙氧基]乙酸(替代名称∶H-OEG-OEG-OH)(1.47g)的乙醇(40ml)溶液中加入DIPEA(1.26ml)。将该混合物在室温下搅拌过夜，而后真空浓缩。向残余物中加入0.1N HCl水溶液(150ml)和乙酸乙酯(200ml)。分离各层，用乙酸乙酯(100ml)提取水层。用水和盐水洗涤合并的有机层，干燥(硫酸镁)，真空浓缩，得到油，其静置时结晶。产率96％(3.1g)。LCMS∶理论质量∶874.2。实测值∶874.49。
19-((S)-1-叔丁氧羰基-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-二氧代-吡咯烷-1-基氧基羰基甲氧基)乙氧基]乙基氨基甲酰基}甲氧基)乙氧基]乙基氨基甲酰基}丙基氨基甲酰基)十九烷酸叔丁基酯(替代名称∶tBu-二十烷二酰基-gGlu(OtBu)-OEG-OEG-OSu)
向19-{(S)-1-叔丁氧羰基-3-[2-(2-{[2-(2-羧基甲氧基乙氧基)乙基氨基甲酰基]甲氧基}乙氧基)乙基氨基甲酰基]丙基氨基甲酰基}十九烷酸叔丁基酯(3.1g)的乙腈(50ml)溶液中加入TSTU(1.39g)和DIPEA(0.91ml)。将该混合物在室温下搅拌过夜，而后真空浓缩。向残余物中加入0.1N HCl水溶液(100ml)和乙酸乙酯(200ml)。分离各层，用乙酸乙酯(50ml)提取水层。用水和盐水洗涤合并的有机层，干燥(硫酸镁)，真空浓缩，得到油。产率99％(3.4g)。
LCMS∶理论质量∶971.2，实测值∶971.8。
19-((S)-1-羧基-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-二氧代-吡咯烷-1-基氧基羰基甲氧基)乙氧基]乙基氨基甲酰基}甲氧基)乙氧基]乙基氨基甲酰基}丙基氨基甲酰基)十九烷酸(替代名称∶二十烷二酰基-gGlu-OEG-OEG-OSu)
将19-((S)-1-叔丁氧羰基-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-二氧代-吡咯烷-1-基氧基羰基甲氧基)-乙氧基]乙基氨基甲酰基}甲氧基)乙氧基]乙基氨基甲酰基}丙基氨基甲酰基)十九烷酸叔丁基酯(3.4g)在TFA(75ml)中搅拌45分钟，而后真空浓缩。将残余物与甲苯共同浓缩3次，得到固体。将残余物在2-丙醇中结晶，过滤，得到白色晶体化合物。产率80％(2.4g)。LCMS∶理论质量∶859.03，实测值∶859.44。
或者，可以如下制备酰化试剂：使用固相方法，制备中间体19-((S)-1-叔丁氧羰基-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-二氧代-吡咯烷-1-基氧基羰基甲氧基)乙氧基]乙基氨基甲酰基}甲氧基)乙氧基]乙基氨基甲酰基}丙基氨基甲酰基)十九烷酸叔丁基酯(替代名称∶tBu-二十烷二酰基-gGlu(OtBu)-OEG-OEG-OH)，如WO 2009/022005所述，而后活化为N-羟基琥珀酰亚胺酯，并进行TFA裂解(上面最后二个步骤)。
实施例27∶使用试剂19-((S)-1-羧基-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-二氧代-吡咯烷-1-基氧基羰基甲氧基)乙氧基]乙基氨基甲酰基}甲氧基)乙氧基]乙基氨基甲酰基}丙基氨基甲酰基)十九烷酸(替代名称∶二十烷二酰基-gGlu-OEG-OEG-OSu)酰化A14E，B25H，desB27，desB30人胰岛素A14E，B25H，B29K((N(eps)二十烷二酰基-gGlu-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基))，desB27，desB30人胰岛素(替代名称∶A14E，B25H，B29K(Nε二十烷二酰基-gGlu-OEG-OEG)，desB27，desB30人胰岛素)的制备
将1g(0.18mmol)A14E，B25H，desB27，desB30人胰岛素溶解在碳酸钠水溶液(100mM，35mL)中。用1N NaOH将pH值从10.29调节至10.45。加入溶解在NMP(3.3mL)中的19-((S)-1-羧基-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-二氧代-吡咯烷-1-基氧基羰基甲氧基)乙氧基]乙基氨基甲酰基}甲氧基)乙氧基]乙基氨基甲酰基}丙基氨基甲酰基)十九烷酸(替代名称∶二十烷二酰基-gGlu-OEG-OEG-OSu)(190mg，0.22mmol)。将混合物在室温下搅拌50分钟。加入水(50mL)，并用1N盐酸将pH值调节至4.4。离心分离沉淀，将上清液倾析。
沉淀产物的HPLC-MS显示：26.9％的胰岛素没有变化，61.7％单酰化的目标产物(B29-酰化的)和11％二酰化的产物。使用这种HPLC-MS方法，没有痕量的A1-单酰化的产物(在B29酰化的产物之前洗脱)∶
随后将沉淀溶解在包含1％TFA的水和乙腈中，通过RP HPLC纯化(柱∶Phenomenex，Gemini，5μ，C18，110A，250x30mm)。收集纯馏份，并冷冻干燥。将冷冻干燥粉末溶解在水中，使用0.1N NaOH将pH值调节至8.0。冷冻干燥，得到标题胰岛素。
产物的HPLC-MS显示：仅仅有单酰化的目标产物(B29-酰化的)，纯度100％。
实施例28∶在pH11.5和室温下，使用试剂17-((S)-1-羧基-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-二氧代-吡咯烷-1-基氧基羰基甲氧基)乙氧基]乙基氨基甲酰基}甲氧基)乙氧基]乙基氨基甲酰基}丙基氨基甲酰基)十七酸(替代名称∶十八烷酸二酰基-gGlu-OEG-OEG-OSu)酰化A14E，B25H，desB30人胰岛素
A14E，B25H，B29K((Nε十八烷二酰基-gGlu-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基))，desB30人胰岛素(替代名称∶A14E，B25H，B29K(Nε十八烷二酰基-gGlu-OEG-OEG)，desB30人胰岛素)的制备
在室温下，将A14E，B25H，desB30人胰岛素溶解在水中，达到20g/l的浓度。加入固体磷酸钠，浓度达到15mM，并用NaOH将pH值调节至11.5。将酰化试剂(十八烷二酰基-gGlu-OEG-OEG-OSu)溶解在NMP中，达到0.2g/ml的浓度，并在搅动下逐步加入到胰岛素溶液中。在反应期间，通过连续地加入NaOH使pH值保持11.5不变。在反应期间，取出样品，并通过RP-HPLC进行分析。结果如下表28.1所示。
表28.1∶B29MA和A1MA分别是在B29K位和A1的N端氨基单酰化的速记符号。同样，二酰化的和的缩写是DA。
实施例29∶在2℃，在pH11.25、11.50和11.75下，使用试剂17-((S)-1-羧基-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-二氧代-吡咯烷-1-基氧基羰基甲氧基)乙氧基]乙基氨基甲酰基}甲氧基)乙氧基]乙基氨基甲酰基}丙基氨基甲酰基)十七酸(替代名称∶十八烷二酰基-gGlu-OEG-OEG-OSu)酰化A14E，B25H，desB30人胰岛素
A14E，B25H，B29K((Nε十八烷二酰基-gGlu-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基))，desB30人胰岛素(替代名称∶A14E，B25H，B29K(Nε十八烷二酰基-gGlu-OEG-OEG)，desB30人胰岛素)的制备
在2℃，在3个不同的实验中，将A14E，B25H，desB30人胰岛素溶解在水中，达到20g/l的浓度，并用NaOH分别将pH值调节至11.25、11.50和11.75。将酰化试剂(十八烷二酰基-gGlu-OEG-OEG-OSu)溶解在NMP中，达到0.2g/ml的浓度，并在搅动下逐步加入到胰岛素溶液中。在反应期间，通过连续地加入NaOH使pH值在各自相应的pH值下保持不变。在反应期间，取出样品，并通过RP-HPLC进行分析。结果分别如下表29.1、29.2和29.3所示。
表29.1∶pH11.25酰化
表29.2∶pH11.50酰化
表29.3∶pH11.75酰化
实施例30∶在pH11.5和室温下，使用试剂17-((S)-1-羧基-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-二氧代-吡咯烷-1-基氧基羰基甲氧基)乙氧基]乙基氨基甲酰基}甲氧基)乙氧基]乙基氨基甲酰基}丙基氨基甲酰基)十七酸(替代名称∶十八烷二酰基-gGlu-OEG-OEG-OSu)酰化A14E，B16H，B25H，desB30人胰岛素
A14E，B16H，B25H，B29K((Nε十八烷二酰基-gGlu-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基))，desB30人胰岛素(替代名称∶A14E，B16H，B25H，B29K(Nε十八烷二酰基-gGlu-OEG-OEG)，desB30人胰岛素)的制备
在室温下，将A14E，B16H，B25H，desB30人胰岛素溶解在水中，达到20g/l的浓度。加入固体磷酸钠和EDTA，分别达到15mM和4mM的浓度。用NaOH将pH值调节至11.5。将酰化试剂(十八烷二酰基-gGlu-OEG-OEG-OSu)溶解在NMP中，达到0.2g/ml的浓度，并在搅动下逐步加入到胰岛素溶液中。在反应期间，通过连续地加入NaOH使pH值保持11.5不变。在反应期间，取出样品，并通过RP-HPLC进行分析。结果如下表30.1所示。
表30.1∶
实施例31∶在pH11.5和室温下，使用试剂19-((S)-1-羧基-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-二氧代-吡咯烷-1-基氧基羰基甲氧基)乙氧基]乙基氨基甲酰基}甲氧基)乙氧基]乙基氨基甲酰基}丙基氨基甲酰基)十九烷酸(替代名称∶二十烷二酰基-gGlu-OEG-OEG-OSu)酰化A14E，B25H，desB30人胰岛素
A14E，B25H，B29K((Nε二十烷二酰基-gGlu-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基))，desB30人胰岛素(替代名称∶A14E，B25H，B29K(Nε二十烷二酰基-gGlu-OEG-OEG)，desB30人胰岛素)的制备
在室温下，将A14E，B25H，desB30人胰岛素溶解在水中，达到20g/l的浓度。加入固体磷酸钠和EDTA，分别达到15mM和4mM的浓度。用NaOH将pH值调节至11.5。将酰化试剂(二十烷二酰基-γGLU-OEG-OEG)溶解在NMP中，达到0.2g/ml的浓度，并在搅动下逐步加入到胰岛素溶液中。在反应期间，通过连续地加入NaOH使pH值保持11.5不变。在反应期间，取出样品，并通过RP-HPLC进行分析。结果如下表31.1所示。
表31.1∶