本发明涉及一种多肽的合成方法，具体涉及一种N-磷酰化多肽的制备方法。
背景技术：
含磷化合物及氨基酸在生命过程中均发挥重要作用，磷酰化过程对细胞的一些功能发挥至关重要。随着现代分子生物学和生物化学的发展,越来越多的实验事实表明,蛋白质磷酸化和去磷酸化几乎调节着生命活动的所有过程,包括细胞的增殖、发育和分化、神经活动、肌肉收缩、新陈代谢、肿瘤发生等,尤其是在细胞应答外界刺激时,蛋白质可逆磷酸化是目前所知道的最主要的信号传递方式。研究磷肽及其类似物对阐明蛋白质可逆磷酸化过程中发挥重要作用的蛋白激酶和磷酸酯酶的作用机制具有极为重要的作用。同时磷肽及其类似物比磷酸化蛋白容易合成,从而对将基础研究成果发展成为用于预防和治疗人类各种疾病的有效药物,具有重大的现实意义。由于磷肽的重要研究价值,磷肽的合成得到许多化学家的重视。从20世纪80年代末就已开始了磷肽的合成研究。
磷酰肽包括O-磷酰肽和N-磷酰肽。O-磷酰肽主要是指肽链中的酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸残基的侧链羟基被磷酸化生成磷酸酯的共价修饰多肽。N-磷酰肽主要是指肽链中氨基被磷酸化生成磷酰胺的共价修饰多肽。到现在为止有很多文献报道合成O-磷酰肽。然而N-磷酰肽的合成由于其不稳定而比较困难合成，合成方法比较少见。
技术实现要素：
本发明克服上述难题，采用固相合成的特殊工艺制备获得了N-磷酰肽，所获得的N-磷酰肽纯度高，本发明的制备方法操作简单、成本低、步骤少且收率有所提高。
具体地，本发明一个方面提供了一种N-磷酰化多肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1)准备固相合成用树脂；
步骤2)用固相合成方法偶联Fmoc-AA-OH至固相合成树脂，加入脱保护剂A脱除Fmoc-保护后裸露氨基，并以此方法偶联多个氨基酸，获得NH2-An-固相合成用树脂；
步骤3)在NH2-An-固相合成用树脂的末端氨基上偶联氯磷酸二酯；
步骤4)用裂解液脱除步骤3)所得化合物的固相合成用树脂后获得磷酸二酯-NH-An-OH；
步骤5)脱除二酯保护基；
任选地，在步骤4)后纯化所得肽链和/或在步骤5)后纯化所得肽链；
所述AA为氨基酸，所述An为由n个氨基酸组成的肽链，其中n≥2，且n为整数。
进一步地，所述固相合成用树脂为氨基树脂、wang树脂或2-Cl树脂等树脂，优选地，树脂替代度为0.1-1.0mmol/g，更优选地为0.2-0.8mmol/g，最优选为0.2-0.5mmol/g。
进一步地，所述步骤2)为将待偶联氨基酸和偶联剂在溶剂中溶解并活化后，一起加入到固相反应柱中，直至用检测方法检测到反应终止为止，加入脱保护剂脱除Fmoc-保护后裸露氨基，并用溶剂洗涤树脂至检测到完全脱除Fmoc为止，并以此方法偶联多个氨基酸，获得Fmoc-An-固相合成用树脂；
其中，偶联剂为DIPCDI和化合物A的组合物或DIPEA、化合物A以及化合物B的组合物，其中化合物A为HOBt或HOAt，化合物B为PyBOP、PyAOP、HATU、HBTU或TBTU，优选地，偶联剂为DIPCDI和化合物A的组合物，更有选地以摩尔比计为DIPCDI:化合物A＝1.2:1.1，DIPEA:化合物A:化合物B＝2.0:1.1:1.0；
脱保护剂A为哌啶和DMF的混合溶液、DBU和DMF的混合溶液，优选地为，以体积计，哌啶:DMF＝1:4的混合溶液。
进一步地，本发明所述步骤2)的反应在固相反应柱中进行，反应在常压、高压或低压下进行，反应温度为15-25℃，优选为20℃下进行；
优选地，每种氨基酸进行偶联反应的时间为1.5-4小时，更优选为2-3小时。
进一步地，步骤3)是以氯磷酸二酯、有机碱以及有机溶剂进行偶联，
其中，有机碱选自三乙胺、NMM、DIPEA和DBU中的一种或多种，优选为DIPEA；
氯磷酸二酯选自氯磷酸二苄酯、氯磷酸二对甲氧基苯酯、氯磷酸二对甲基苯酯、氯磷酸二间甲氧基苯酯和氯磷酸二间甲基苯酯的一种或多种，优选为氯磷酸二苄酯。
进一步地，所述裂解液为TFA、H2O、EDT、PhOMe、苯甲硫醚的一种或多种的混合物。
进一步地，步骤5)脱除保护基的方法为钯碳催化氢解。
进一步地，步骤5)所述纯化步骤为反相高压液相色谱法，优选地，所述反相高压液相色谱法为以反相十八烷基硅烷为固定相，以0.1％醋酸水溶液/乙腈为流动相，收集目的峰馏分，浓缩冻干。
进一步地，步骤2)的反应在将树脂偶联之前进行溶胀；
优选地，所述洗涤和溶胀的步骤所述的试剂选自DMF、NMP、二氯甲烷的一种或多种，优选为DMF；
优选地，所述检测方法为色谱法或化学标定法，更优选使用可判定反应终点的试剂，例如茚三酮，当使用茚三酮时，若树脂显色则说明多肽中有游离的胺，即胺上无保护基。
被发明的另一方面提供了一种根据上述制备方法制得的N-磷酰化多肽，所述N-磷酰化多肽的结构如下：
本发明所述术语缩写及英文含义
HOAt为1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑
Fmoc为9-芴甲氧羰基
DIPCDI为二异丙基碳二亚胺
HOBt为1-羟基苯并三唑
HATU为2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯
HBTU为苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐
DIPEA为N,N-二异丙基乙胺
EDC·HCl为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐
PyBOP为苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基六氟磷酸盐
PyAOP为(3H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶-3-氧基)三-1-吡咯烷基鏻六氟磷酸盐.
TBTU为O-苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲四氟硼酸
DMF为N,N-二甲基甲酰胺
DCM为二氯甲烷
THF为四氢呋喃
TFE为三氟乙醇
TFA为三氟乙酸
TA为苯甲硫醚
PhOMe为苯甲醚
EDT为乙二硫醇
DMAP为4，4-二甲氨基吡啶
DBLK为20％哌啶/DMF(V/V)溶液
tBu为叔丁基
OtBu为叔丁酯
AA为氨基酸
NMM为N-甲基吗啡啉
DBU为1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯
本发明的有益效果
本发明提供了一条比较实用的合成N-磷酰肽的方法，具有操作简单、工艺简化、环境友好、经济效益高、可规模化生产。
附图说明
图1为本发明合成路线图示意图。
具体实施方式
制备N-磷酰肽1，肽序如下：
实施例1：N-磷酰肽树脂的制备
称取替代度为0.303mmol/g的Rink Amide-AM树脂20g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，DBLK脱保护6min+8min，DMF洗涤6次。称取2.45g(6mmol)Fmoc-Gly-OH和0.89g(6.6mmol)HOBt用DMF溶解，冰水浴下加入1.2mL(7.2mmol)DIPCDI活化3min后，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时，以茚三酮检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应1小时)。反应结束，用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护6min+8min，DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。称取1.9g(6mmol)Fmoc-Pro-OH和0.89g(6.6mmol)HOBt用DMF溶解，冰水浴下加入1.2mL(7.2mmol)DIPCDI活化3min后，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时，以茚三酮检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应1小时)。反应结束，用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护6min+8min，用DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。称取2.83g(6mmol)Fmoc-Ser(tBu)-OH和0.89g(6.6mmol)HOBt用DMF溶解，冰水浴下加入1.2mL(7.2mmol)DIPCDI活化3min后，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时，以茚三酮检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应1小时)。反应结束，用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护6min+8min，用DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。称取2.83g(6mmol)Fmoc-Ser(tBu)-OH和0.89g(6.6mmol)HOBt用 DMF溶解，冰水浴下加入1.2mL(7.2mmol)DIPCDI活化3min后，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时，以茚三酮检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应1小时)。反应结束，用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护6min+8min，用DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。称取2.45g(6mmol)Fmoc-Gly-OH和0.89g(6.6mmol)HOBt用DMF溶解，冰水浴下加入1.2mL(7.2mmol)DIPCDI活化3min后，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时，以茚三酮检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应1小时)。反应结束，用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护6min+8min，DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。称取3.45g(6mmol)Fmoc-Tyr(tBu)-OH和0.89g(6.6mmol)HOBt用DMF溶解，冰水浴下加入1.2mL(7.2mmol)DIPCDI活化3min后，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时，以茚三酮检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应1小时)。反应结束，用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护6min+8min，DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。称取2.83g(6mmol)Fmoc-Ser(tBu)-OH和0.89g(6.6mmol)HOBt用DMF溶解，冰水浴下加入1.2mL(7.2mmol)DIPCDI活化3min后，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时，以茚三酮检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应1小时)。用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护6min+8min，DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。称取3.45g(6mmol)Fmoc-Try(tBu)-OH和0.89g(6.6mmol)HOBt用DMF溶解，冰水浴下加入1.2mL(7.2mmol)DIPCDI活化3min后，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时，以茚三酮检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应1小时)。用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护6min+8min，DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。称取3.01g(6mmol)Fmoc-His(tBu)-OH和0.89g(6.6mmol)HOBt用DMF溶解，冰水浴下加入1.2mL(7.2mmol)DIPCDI活化3min后，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时，以茚三酮检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应1小时)。用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护6min+8min，DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。称取2.81g(6mmol)Fmoc-Glu(OtBu)-OH和0.89g(6.6mmol)HOBt用DMF溶解，冰水浴下加入1.2mL(7.2mmol)DIPCDI活化3min后，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时，以茚三酮检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应1小时)。用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护6min+8min，DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。依次取氯磷酸二苄酯5.0g(12mmol)、DIPEA20ml和DMF50ml加入到反应柱中，室温反应2小时，以茚三酮检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应1小时)。偶联结束，树脂收缩抽干，得到肽树脂22.72克，树脂增重率72.0％。
实施例2：N-磷酰粗肽的制备
将实施例2得到的肽树脂22.72克加入到500ml单口瓶中，加入预先配置好的TFA：H2O：EDT：PhOMe：苯甲硫醚＝90：5：2：2：1(V:V)280ml，室温反应2小时，过滤树脂，收集滤液。用少量TFA洗涤树脂，合并滤液。将滤液缓慢加入2800ml冰乙醚中沉淀，离心，冰乙醚洗涤5次，减压干燥得到粗肽7.58克，HPLC纯度81.6％。
实施例3：含保护基的精肽制备
将实施例2得到的粗肽7.58克用高效液相纯化制备。以反相十八烷基硅烷为固定相，以0.1％醋酸水溶液/乙腈为流动相，收集目的峰馏分，浓缩冻干，得纯品5.0g，纯度大于99％。
实施例4：N-磷酰肽粗肽的制备
将实施例3得到的精肽5.0克加入到500ml单口瓶中，加入5％钯碳0.3克，甲醇200ml加压氢解，得粗肽2.0克，收率60％。
实施例5：纯化制备N-磷酰肽精肽
将实施例4得到的粗肽2.0克用高效液相纯化，得精肽1.0g，收率50％，纯度95％。
制备N-磷酰肽2，肽序如下：
实施例6：N-磷酰肽树脂的制备
称取替代度为0.320mmol/g的Rink Amide-AM树脂20g，加入到固相反应
柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，DBLK脱保护6min+8min，DMF洗涤6次。称取3.05g(6mmol)Fmoc-Glu(OtBu)-OH和0.89g(6.6mmol)HOBt用DMF溶解，冰水浴下加入1.2mL(7.2mmol)DIPCDI活化3min后，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时，以茚三酮检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应1小时)。反应结束，用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护6min+8min，DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。称取2.9g(6mmol)Fmoc-Tyr(tBu)-OH和0.89g(6.6mmol)HOBt用DMF溶解，冰水浴下加入1.2mL(7.2mmol)DIPCDI活化3min后，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时，以茚三酮检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应1小时)。反应结束，用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护6min+8min，用DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。称取2.45g(6mmol)Fmoc-Gly-OH和0.89g(6.6mmol)HOBt用DMF溶解，冰水浴下加入1.2mL(7.2mmol)DIPCDI活化3min后，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时，以茚三酮检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应1小时)。反应结束，用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护6min+8min，用DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。称取2.01g(6mmol)Fmoc-Pro-OH 和0.89g(6.6mmol)HOBt用DMF溶解，冰水浴下加入1.2mL(7.2mmol)DIPCDI活化3min后，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时，以茚三酮检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应1小时)。反应结束，用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护6min+8min，用DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。称取2.83g(6mmol)Fmoc-Ser(tBu)-OH和0.89g(6.6mmol)HOBt用DMF溶解，冰水浴下加入1.2mL(7.2mmol)DIPCDI活化3min后，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时，以茚三酮检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应1小时)。用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护6min+8min，DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。称取2.83g(6mmol)Fmoc-Ser(tBu)-OH和0.89g(6.6mmol)HOBt用DMF溶解，冰水浴下加入1.2mL(7.2mmol)DIPCDI活化3min后，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时，以茚三酮检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应1小时)。用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护6min+8min，DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。称取2.45g(6mmol)Fmoc-Gly-OH和0.89g(6.6mmol)HOBt用DMF溶解，冰水浴下加入1.2mL(7.2mmol)DIPCDI活化3min后，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时，以茚三酮检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应1小时)。反应结束，用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护6min+8min，DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。称取2.9g(6mmol)Fmoc-Tyr(tBu)-OH和0.89g(6.6mmol)HOBt用DMF溶解，冰水浴下加入1.2mL(7.2mmol)DIPCDI活化3min后，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时，以茚三酮检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应1小时)。反应结束，用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护6min+8min，用DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。称取2.83g(6mmol)Fmoc-Ser(tBu)-OH和0.89g(6.6mmol)HOBt用DMF溶解，冰水浴下加入1.2mL(7.2mmol)DIPCDI活化3min后，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时，以茚三酮检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应1小时)。用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护6min+8min，DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。称取2.8g(6mmol)Fmoc-Try(Trt)-OH和0.89g(6.6mmol)HOBt用DMF溶解，冰水浴下加入1.2mL(7.2mmol)DIPCDI活化3min后，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时，以茚三酮检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应1小时)。反应结束，用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护6min+8min，用DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。称取3.45g(6mmol)Fmoc-Tyr(tBu)-OH和0.89g(6.6mmol)HOBt用DMF溶解，冰水浴下加入1.2mL(7.2mmol)DIPCDI活化3min后，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时，以茚三酮检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应1小时)。反应结束，用DMF洗涤树脂3次，加入 DBLK脱保护6min+8min，DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。称取3.01g(6mmol)Fmoc-His(tBu)-OH和0.89g(6.6mmol)HOBt用DMF溶解，冰水浴下加入1.2mL(7.2mmol)DIPCDI活化3min后，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时，以茚三酮检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应1小时)。用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护6min+8min，DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。称取2.81g(6mmol)Fmoc-Glu(OtBu)-OH和0.89g(6.6mmol)HOBt用DMF溶解，冰水浴下加入1.2mL(7.2mmol)DIPCDI活化3min后，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时，以茚三酮检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应1小时)。用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护6min+8min，DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。依次取氯磷酸二对甲氧基苯酯5.0g(12mmol)、DIPEA20ml和DMF50ml加入到反应柱中，室温反应2小时，以茚三酮检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应1小时)。偶联结束，树脂收缩抽干，得到肽树脂23.92克，树脂增重率70.0％。
实施例7：N-磷酰粗肽的制备
将实施例6得到的肽树脂23.92克加入到500ml单口瓶中，加入预先配置好的TFA：H2O：EDT：PhOMe：苯甲硫醚＝90：2：2：4：2(V:V)300ml，室温反应2小时，过滤树脂，收集滤液。用少量TFA洗涤树脂，合并滤液。将滤液缓慢加入3000ml冰乙醚中沉淀。离心，冰乙醚洗涤5次，减压干燥得到粗肽8.38克，HPLC纯度83.6％。
实施例8：含保护基的精肽制备
将实施例7得到的粗肽8.38克用高效液相纯化制备。以反相十八烷基硅烷为固定相，以0.1％醋酸水溶液/乙腈为流动相，收集目的峰馏分，浓缩冻干，得纯品4.0g，纯度大于98％。
实施例9：N-磷酰肽粗肽的制备
将实施例8得到的精肽4.0克加入到500ml单口瓶中，加入5％钯碳0.4克，乙醇200ml加压氢解，得粗肽3.1克，收率85％。
实施例10：纯化制备N-磷酰肽精肽
将实施例9得到的粗肽用高效液相纯化，得精肽2.8g，纯度95％。
制备N-磷酰肽3，肽序如下：
实施例11：N-磷酰肽树脂的制备
称取替代度为0.303mmol/g的Wang树脂20g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后。称取1.9g(6mmol)Fmoc-Pro-OH和0.89g(6.6mmol)DIPEA用DMF溶解，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时。 反应结束，用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护6min+8min，用DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。称取2.83g(6mmol)Fmoc-Ser(tBu)-OH和0.89g(6.6mmol)HOBt用DMF溶解，冰水浴下加入1.2mL(7.2mmol)DIPCDI活化3min后，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时，以茚三酮检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应1小时)。反应结束，用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护6min+8min，用DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。称取2.83g(6mmol)Fmoc-Ser(tBu)-OH和0.89g(6.6mmol)HOBt用DMF溶解，冰水浴下加入1.2mL(7.2mmol)DIPCDI活化3min后，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时，以茚三酮检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应1小时)。反应结束，用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护6min+8min，用DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。称取2.45g(6mmol)Fmoc-Gly-OH和0.89g(6.6mmol)HOBt用DMF溶解，冰水浴下加入1.2mL(7.2mmol)DIPCDI活化3min后，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时，以茚三酮检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应1小时)。反应结束，用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护6min+8min，DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。称取3.45g(6mmol)Fmoc-Tyr(tBu)-OH和0.89g(6.6mmol)HOBt用DMF溶解，冰水浴下加入1.2mL(7.2mmol)DIPCDI活化3min后，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时，以茚三酮检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应1小时)。反应结束，用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护6min+8min，DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。称取2.83g(6mmol)Fmoc-Ser(tBu)-OH和0.89g(6.6mmol)HOBt用DMF溶解，冰水浴下加入1.2mL(7.2mmol)DIPCDI活化3min后，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时，以茚三酮检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应1小时)。用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护6min+8min，DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。称取2.8g(6mmol)Fmoc-Try(Trt)-OH和0.89g(6.6mmol)HOBt用DMF溶解，冰水浴下加入1.2mL(7.2mmol)DIPCDI活化3min后，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时，以茚三酮检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应1小时)。反应结束，用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护6min+8min，用DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。称取3.01g(6mmol)Fmoc-His(tBu)-OH和0.89g(6.6mmol)HOBt用DMF溶解，冰水浴下加入1.2mL(7.2mmol)DIPCDI活化3min后，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时，以茚三酮检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应1小时)。用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护6min+8min，DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。称取2.81g(6mmol)Fmoc-Glu(OtBu)-OH和0.89g(6.6mmol)HOBt用DMF溶解，冰水浴下加入1.2mL(7.2mmol)DIPCDI活化3min后，将混合液加入到反应柱 中，室温反应2小时，以茚三酮检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应1小时)。用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护6min+8min，DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。依次取氯磷酸二间甲基苯酯5.0g(12mmol)、DIPEA20ml和DMF50ml加入到反应柱中，室温反应2小时，以茚三酮检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应1小时)。偶联结束，树脂收缩抽干，得到肽树脂21.72克，树脂增重率75.0％。
实施例12：N-磷酰粗肽的制备
将实施例11得到的肽树脂21.72克加入到500ml单口瓶中，加入预先配置好的TFA：H2O：EDT：PhOMe＝92：2：2：4混合溶液280ml，室温反应2小时，过滤树脂，收集滤液。用少量TFA洗涤树脂，合并滤液。将滤液缓慢加入2800ml冰乙醚中沉淀。离心，冰乙醚洗涤5次，减压干燥得到粗肽6.58克，HPLC纯度85％。
实施例13：含保护基的精肽制备
将实施例12得到的粗肽6.58克用高效液相纯化制备。以反相十八烷基硅烷为固定相，以0.1％醋酸水溶液/乙腈为流动相，收集目的峰馏分，浓缩冻干，得纯品2.5g，纯度大于95％。
实施例14：N-磷酰肽粗肽的制备
将实施例13得到的精肽2.5克加入到500ml单口瓶中，加入5％钯碳0.25克，异丙醇200ml加压氢解。得粗肽2.2克。
实施例15：纯化制备N-磷酰肽精肽
将实施例14得到的粗肽2.2克用高效液相纯化，得精肽0.8g。收率40％，纯度96％。
制备N-磷酰肽4，肽序如下：
实施例16：N-磷酰肽树脂的制备
称取替代度为0.310mmol/g的2-氯树脂20g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后。称取1.50g(6mmol)Fmoc-Leu-OH和0.89g(6.6mmol)DIPEA用DMF溶解，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时。反应结束，用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护6min+8min，用DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。称取1.20g(6mmol)Fmoc-Ala-OH和0.89g(6.6mmol)HOBt用DMF溶解，冰水浴下加入1.2mL(7.2mmol)DIPCDI活化3min后，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时，以茚三酮检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应1小时)。反应结束，用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护6min+8min，用DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。称取1.9g(6mmol)Fmoc-Pro-OH和0.89g(6.6mmol)HOBt用DMF溶 解，冰水浴下加入1.2mL(7.2mmol)DIPCDI活化3min后，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时，以茚三酮检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应1小时)。反应结束，用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护6min+8min，用DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。称取2.83g(6mmol)Fmoc-Ser(tBu)-OH和0.89g(6.6mmol)HOBt用DMF溶解，冰水浴下加入1.2mL(7.2mmol)DIPCDI活化3min后，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时，以茚三酮检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应1小时)。反应结束，用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护6min+8min，用DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。称取2.83g(6mmol)Fmoc-Ser(tBu)-OH和0.89g(6.6mmol)HOBt用DMF溶解，冰水浴下加入1.2mL(7.2mmol)DIPCDI活化3min后，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时，以茚三酮检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应1小时)。反应结束，用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护6min+8min，用DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。称取2.45g(6mmol)Fmoc-Gly-OH和0.89g(6.6mmol)HOBt用DMF溶解，冰水浴下加入1.2mL(7.2mmol)DIPCDI活化3min后，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时，以茚三酮检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应1小时)。反应结束，用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护6min+8min，DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。称取3.45g(6mmol)Fmoc-Tyr(tBu)-OH和0.89g(6.6mmol)HOBt用DMF溶解，冰水浴下加入1.2mL(7.2mmol)DIPCDI活化3min后，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时，以茚三酮检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应1小时)。反应结束，用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护6min+8min，DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。称取2.83g(6mmol)Fmoc-Ser(tBu)-OH和0.89g(6.6mmol)HOBt用DMF溶解，冰水浴下加入1.2mL(7.2mmol)DIPCDI活化3min后，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时，以茚三酮检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应1小时)。用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护6min+8min，DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。称取2.8g(6mmol)Fmoc-Try(Trt)-OH和0.89g(6.6mmol)HOBt用DMF溶解，冰水浴下加入1.2mL(7.2mmol)DIPCDI活化3min后，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时，以茚三酮检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应1小时)。反应结束，用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护6min+8min，用DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。称取3.01g(6mmol)Fmoc-His(tBu)-OH和0.89g(6.6mmol)HOBt用DMF溶解，冰水浴下加入1.2mL(7.2mmol)DIPCDI活化3min后，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时，以茚三酮检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应1小时)。用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护6min+8min，DMF洗涤树脂 6次，茚三酮检测树脂有颜色。称取2.81g(6mmol)Fmoc-Glu(OtBu)-OH和0.89g(6.6mmol)HOBt用DMF溶解，冰水浴下加入1.2mL(7.2mmol)DIPCDI活化3min后，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时，以茚三酮检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应1小时)。用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护6min+8min，DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。依次取氯磷酸二苄酯5.0g(12mmol)、DIPEA20ml和DMF50ml加入到反应柱中，室温反应2小时，以茚三酮检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应1小时)。偶联结束，树脂收缩抽干，得到肽树脂22.52克，树脂增重率76.0％。
实施例17：N-磷酰粗肽的制备
将实施例16得到的肽树脂22.52克加入到500ml单口瓶中，加入预先配置好的TFA：H2O＝95:5(V:V)260ml，室温反应2小时，过滤树脂，收集滤液。用少量TFA洗涤树脂，合并滤液。将滤液缓慢加入2600ml冰乙醚中沉淀。离心，冰乙醚洗涤5次，减压干燥得到粗肽6.28克，HPLC纯度81.6％。
实施例18：含苄基保护基的精肽制备
将实施例17得到的粗肽6.28克用高效液相纯化制备。以反相十八烷基硅烷为固定相，以0.1％醋酸水溶液/乙腈为流动相，收集目的峰馏分，浓缩冻干，得纯品3.6g，纯度大于98％。
实施例19：N-磷酰肽粗肽的制备
将实施例18得到的精肽3.6克加入到500ml单口瓶中，加入5％钯碳0.36克，甲醇200ml加压氢解,得粗肽3.0克，收率85％。
实施例20：纯化制备N-磷酰肽精肽
将实施例19得到的粗肽用高效液相纯化，得精肽1.9g，收率65％。纯度96％。