雨生红球藻中与虾青素积累相关基因及其筛选的方法与流程

本发明属于分子生物学领域，具体地涉雨生红球藻中与虾青素积累相关基因及其筛选的方法。

背景技术：

虾青素是一种氧化型类胡萝卜素，具有较强的抗氧化活性，并且能够显著提高动物的免疫能力，能起到预防癌症的作用。目前虾青素主要用作鱼类和虾蟹等甲壳类动物及家禽的饲料添加剂。此外，天然虾青素已被批准为安全的人类食品添加剂，以用于食品的着色、保鲜及营养。

雨生红球藻是一种单细胞绿藻，在多种逆境胁迫条件下能够大量合成并迅速积累虾青素，其积累量最高可达细胞干重的4％，从而成为目前最理想的天然虾青素合成工具。雨生红球藻中虾青素的合成和积累总是发生在不适于藻细胞生物量积累的逆境胁迫条件下，因此虾青素积累与藻细胞生物量积累之间的矛盾已经成为利用雨生红球藻高效生产虾青素的限制因素。

虽然各国研究者通过摸索雨生红球藻培养条件、优化虾青素的提取条件来提高天然的虾青素的产量。但是这些研究从生理环境上或通过一定的理化处理来协调虾青素积累与生物量积累之间的矛盾，并没有从根本上解决这一矛盾，主要原因是对雨生红球藻这一生理过程中细胞内发生的分子调控机制未知。目前一些科学家对于红球藻胁迫条件下积累虾青素，抵御胁迫环境的机制也进行了一些探索研究。一些研究结果提示在虾青素积累过程中存在着复杂的调控网络，所以仅仅研究几个基因很难从全局上了解细胞的分子调控机制。要揭示雨生红球藻在胁迫条件下积累虾青素的分子调控机制还需要进行更多的研究。

雨生红球藻在胁迫条件下的防御过程是发生在虾青素积累和形态上发生可视变化之前，因此雨生红球藻在变成红细胞之前，细胞内的转录组已经发生变化；并且以前也有研究证明虾青素合成酶基因的调控是发生在转录水平上。目前传统克隆相关基因的方法，在没有基因序列的前提下，大多是根据其他物种的同源基因设计兼并引物，这种方法的缺点是非特异性高，不容易成功，而且一次只能进行少量基因操作。因此，想要揭示雨生红球藻在胁迫条件下积累虾青素的分子机理，快速的筛选诱导条件下参与雨生红球藻积累虾青素的基因，了解这些基因的功能显得尤为重要。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题在于提供一种雨生红球藻中与虾青素积累相关基因及其筛选的方法，本发明筛选方法灵敏度高，检测数量多，筛选速度快，操作简单。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案予以实现：

一种雨生红球藻中与虾青素积累相关基因HpHDR，序列长1421bp，基因序列见SEQ NO.1。

一种HpHDR蛋白，由434个氨基酸残基组成，分子式为C₂₁₂₉H₃₃₆₃N₆₀₁O₆₅₆S₂₄，分子量大约为48.64KD，理论等电点为6.53，所述蛋白的空间结构具有15个α-螺旋结构和12个β-折叠结构，氨基酸序列见SEQ NO.2。

本发明还提供一种所述基因的筛选方法，具体步骤如下：

1)雨生红球藻的培养与诱导

取对数生长期的雨生红球藻在缺N培养基中培养，并用光强200μmol photon/m^-2s^-1连续光照，取诱导24h后的雨生红球藻，用液氮速冻，以备用；

2)cDNA文库的构建

用Trizol方法提取步骤1)收集的诱导24小时后和正常培养的雨生红球藻的总RNA，并对RNA进行定量；分离miRNA，进行反转录得到cDNA，构建诱导后和正常培养的两个雨生红球藻cDNA文库；

3)深度测序

采用第二代测序技术Solexa对步骤2)所述的两个cDNA文库进行深度测序；

4)测序分析

利用生物信息学对步骤3)测的数据进行分析，分析2个表达谱的差异；采用了IDEG6来识别两个转录组中显著性差异的基因，显著性差异主要是以两个库中reads的丰度的差异性来确定，从而获得诱导条件下的差异基因；

5)差异基因的生物信息学分析

通过Blastn、Blastp程序在GenBank数据库中同源搜索，对步骤4)中得到差异基因进行功能推测，并进行KEGG、COG功能聚类分析，推测它们参与的代谢过程；

6)差异基因的克隆及表达模式的研究

根据步骤5)中分析和步骤3)获得的序列，通过RACE方法获得差异基因的全长，对雨生红球藻细胞设置不同诱导条件，用qRT-PCR定量检测差异基因在不同诱导条件下的转录情况，推测它们在代谢途径中的功能。

本发明与现有技术相比的有益效果：

本发明方法通过缺氮诱导结合高光诱导，能使雨生红球藻中的虾青素在短时间内迅速积累，达到差异基因分析需要，缩短试验时间，同时本发明方法运用高通量测序技术，可以短时间内获得数量巨多的差异表达的基因，缩短研究周期，加快研究进程。

本发明方法将实验与生物信息学分析相结合，加上运用定量PCR进行验证，可高效筛选出虾青素积累相关的基因，大大提高了筛选效率，为研究雨生红球藻在胁迫条件下积累虾青素的分子机制提供新思路和方法。

附图说明

图1:雨生红球藻诱导积累虾青素：a、空白对照；b、诱导12小时；c、诱导24小时；d、诱导36小时；e、诱导48小时；f、诱导64小时；g、诱导72小时。

图2：总RNA库的琼脂糖凝胶电泳检测：1、marker，2、空白组细胞提取的RNA，3、是诱导组细胞提取的RNA；

图3：生物信息学分析路线图；

图4：测序得到的序列数据；

图5：对雨生红球藻两个转录组中Unigens的数量进行比较；

图6:差异基因的GO分析；

图7：预测的HDR蛋白质三维结构；

图8：雨生红球藻HpHDR推导的氨基酸序列与其它物种HDR同源性比较。*为保守的半胱氨酸位点：Ch-Vc-HDR：团藻HDR，XP_002947297.1；Ch-Cr-HDR：莱茵衣藻HDR，XP_001701302.1；Ch-Ds-HDR：杜氏盐藻HDR，ACM79143.1；Ch-Cv-HDR：小球藻HDR，XP_005848540.1；Ch-Ms-HDR：细小微胞藻HDR，ACI45954.1；Eu-Pt-HDR：杨树HDR，XP_002313816.1；Eu-Pd-HDR：赤松HDR，ACC54561.1；Eu-Gm-HDR：大豆HDR，XP_003541082.2；Eu-At-HDR：拟南芥HDR，NP_567965.1；Eu-Os-HDR：水稻HDREEC76125.1，；Cy-Sy-HDR：聚球藻HDRWP_015125553.1，；Cy-Ph-HDR：原緑丝藻HDR，WP_017712910.1；Cy-Sm-HDR：米氏伪枝藻HDR，WP_039717069.1；Cy-Cw-HDR：单细胞集胞藻HDR，WP_007309931.1；Cy-Ct-HDR：拟色球藻HDR，WP_041462512.1；

图9：荧光定量PCR检测雨生红球藻中HDR基因在缺氮、高光和高光缺氮条件下的表达。

具体实施方式

实施例1

缺N培养基在配制过程中比正常培养基缺少N源。取对数生长期的雨生红球藻收集后在缺N元素的MCM培养基中培养，并用光强200μmol photon/m^-2s^-1连续光照。并分别取诱导后0h、12h、24h、36h、48h、64h、72h的雨生红球藻进行细胞显微镜观察，并收集雨生红球藻，用液氮速冻，以备用。结果发现N饥饿加上强光可以很好的诱导的雨生红球藻进行虾青素的积累。

图1为分别在诱导0小时、12小时、24小时、36小时、48小时、64小时、72小时的雨生红球藻细胞镜检结果。从结果中可以看出细胞在诱导12小时时，与空白对照组相近，没有什么变化。但是在诱导24小时后，可以看出雨生红球藻细胞已经开始积累虾青素，随着诱导时间的增长，虾青素积累越来越明显。

实施例2 cDNA文库的构建

分别取正常培养的细胞和诱导24小时后的细胞，经2μm滤膜过滤，过滤后将藻细胞连同滤膜用液氮速冻并进行研磨，研磨后用于RNA提取。雨生红球藻总RNA的提取使用Trizol试剂(Invitrogen,USA)，根据操作说明进行提取并检测其质量，晾干的RNA用去30μl DEPC水溶解。提取的总RNA用琼脂糖凝胶进行检测。琼脂糖凝胶检测参数为：胶浓度：1％，电压：180v，电泳时间：16min。根据电泳图(图2)检测结果可以看出提取的雨生红球藻RNA条带清晰完整，没有基因组DNA污染，无明显拖尾现象。安捷伦2100检测显示雨生红球藻RNA样品RIN值>6.5，浓度>100ng/μl，OD260/280>1.8，OD260/230>2.0，无蛋白和杂质污染，无颜色异常，样品检测合格，满足转录组建库要求。从总RNA中纯化mRNA。mRNAs用SMART IV^TMOligonucleotide(5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTACGGCCGGG-3')and CDS III/3'PCR Primer(5'-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)30N-1N-3')进行反转录和双链cDNA的合成。用大约10μg修整的cDNA，分离300-500bp大小的片段用来建库。cDNA文库用Illumina Genome Analyzer进行solexa法测序。

实施例3生物信息学分析

通过solexa测序，根据图3的分析路径，对测序的原始数据进行分析整理，得到表1中的数据。图4为测序长度分布。

表1：cDNA文库测序得到的reads

应用BLASTN和BLASTX分别将Unigenes与NCBI Nr数据库和Nr蛋白质数据库比对，设置E值为1e-5。这些Unigene还与SWISS-PROT和COG数据库比对，设置的E值为1e-10。为了探索这些Unigene参与的代谢途径，我们应用blastX程序将得到的Unigene与Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)数据库比对。

在36,151contigs中,16,473(45.6％)与NT或Nr数据库中有明显的匹配。8685and 6380contig分别与SWISSPROT和COG数据库匹配。而没有匹配的contigs可能是该物种特有的基因序列。与各数据库的匹配情况见表2。

表2雨生红球藻ESTs与各个数据库的匹配情况

所有这些contigs通过Blast2GO分配到GO分类上，在15，151unigenes中，有8996分配到细胞组分分类中，有12,865归类于分子功能分类，还有14,390属于生物过程分类。在生物过程分类中，其中细胞(31.2％)和代谢(36.3％)过程占比例较大。在分子功能分类中，具有结合和催化功能的占了多数，分别为40.9％和43.4％。

在KEGG途径分析中，发现16,068contigs可归类于232KEGG途径。其中reads数目最多的属于折叠、整理和降解(1687(途径，氨基酸代谢途径(1496)和能量代谢途径(1305)。

该实施例中分别对正常生长状态下的雨生红球藻和用N饥饿加强光诱导的雨生红球藻的转录组通过生物信息学分析进行了比较分析。在寻找两个基因组的差异基因时，实施例中采用了IDEG6来识别两个转录组中显著性差异的基因，显著性差异主要是以两个库中reads的丰度的差异性来确定。采用的检验方法为Chi2检验。当P值<＝0.01,表达比率>＝1.5或者表达比率<＝0.5的这些Unigenes被确定为两个转录组中差异表达的基因。

在13047contigs中，9393contigs在丰度上是显著上升的，3654contigs在丰度上显著下降。两个转录组中数量的差异见图5。图6是差异基因的GO分类图。

实施例4雨生红球藻HpHDR基因的克隆及表达模式的研究

4-羟基-3-甲基-2-(E)-丁烯基-4-磷酸还原酶(HDR)是甲基赤藓糖磷酸(MEP)途径中的最后一个酶，催化4-羟基-3-甲基-(2E)-丁烯基-4-磷酸生成异戊烯基焦磷酸(IPP)，而IPP合成途径是叶绿素和类胡萝卜素合成的上游途径。在本发明中，发现HDR基因属于差异表达的基因，可能属于筛选到的虾青素积累相关的基因，从雨生红球藻中进行克隆并进行表达分析，以更好了解该基因在虾青素积累中的作用。

4.1实验材料

将处于指数生长期的雨生红球藻分成四份，一份进行正常培养作为对照组，另外3份进行，1)缺氮诱导(-N)，将藻细胞转移到不添加氮元素的培养基中培养中；2)高光诱导(HL)，在200μmol photon/m^-2s^-1连续光照下培养；3)高光缺氮诱导(HL-N)，200μmol photon/m^-2s^-1连续光照和缺氮培养基中培养。每种诱导条件培养3瓶。除变量外，其余培养条件均与之前的藻种培养条件相同。每天摇动三次并分别取诱导后0d、3d、7d、11d、15d、19d、22d的细胞显微镜观察，并收集细胞，用液氮速冻，以备用。每个取样点设3个重复，以正常培养条件下的样品作为对照组。

4.2方法

4.2.1雨生红球藻总RNA的提取与鉴定

取在一定处理时间，正常条件、缺氮和高光缺氮处理条件下的藻液50ml-100ml经2μm滤膜过滤，过滤后将藻细胞连同滤膜用液氮速冻并进行研磨，研磨后用于RNA提取。雨生红球藻总RNA的提取使用Trizol试剂(Invitrogen,USA)，根据操作说明进行提取并检测其质量，晾干的RNA用去30μl DEPC水溶解。

4.2.2 HpHDR基因的克隆与分析

用oligod(T)18(TaKaRa Biotech Co,Dalian,China)作为引物，用MMLV(Promega Biotech Co,Madison,WI,USA)进行反转录得到cDNA。用3’RACE和5’RACE PCR方法来获得全长HDR基因。RACE中特异性的引物HDR—GSP1(Race引物)：GTTGCACCAAATGCTGGGAAGATGACT；HDR—GSP2(Race引物)：GAGACGGAGCAGATCGGCAAGATG是根据本发明中测序获得的雨生红球藻ESTs序列设计的。RACE PCR是用SMARTer^TM RACE cDNA扩增试剂盒(BD-Clontech)根据操作说明进行。获得的PCR产物在1％琼脂糖凝胶电泳中检测并进行胶回收。胶收回产物克隆到pMD-18T载体中，并进行测序。用DNAstar软件进行序列拼接，并在NCBI中比对，以确认获得HDR基因的完整编码区序列。用the Six Frame Translation of Sequence system进行开放阅读框(ORF)分析，以证实所获得序列的准确性。我们将获得序列利用ProtParam程序进行在线分析，利用SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org/)在线分析工具对HDR进行蛋白质空间结构预测。将所测得克隆序列利用http://www.ncbi.nlm.nih.gov网站上的BlastX工具进行数据库基因序列的相似性及同源性查找，使用CLUSTALX和BioEdit软件将以上序列和HpHDR蛋白质序列进行比对相似性分析。

4.2.3雨生红球藻HpHDR基因的表达调控分析

为了探讨HpHDR在胁迫条件下的表达情况，我们采用实时定量PCR的方法进行检测。实时定量PCR的引物根据以上获得的HpHDR基因序列设计的，引物序列HDR—qR(实时定量引物)：CCTACACAAAGAAGAACAGCACC；HDR—qF(实时定量引物)：TCAGGTCCTTCACGATGATG。Actin基因作为内参基因，引物序列为Actin-F：AGCGGGAGGATAGTGCGGGACA；Actin-R：ATGCCCACCGCCTCCATGC。实时定量PCR程序如下：首先用无菌水将反转录得到的cDNA样品进行稀释，将稀释后的样品作为荧光定量PCR的模板，然后建立实时荧光定量PCR反应体系，总体积共20.0μl，其中SYBR Priemix ExTaq(2×)的体积为10μl，P1的体积为0.4μl，P2的体积为0.4μl，Template的体积为2.0μl，H₂O的体积为7.2μl。荧光定量PCR进行40个循环，共设置了四个温度梯度，其中温度为95℃的时间为5s，58℃的时间为10s，72℃的时间为30s，72℃的时间为5min。在每一个循环的退火阶段收集荧光进行实时监测。

4.3结果与分析

4.3.1 HpHDR基因的克隆与序列分析

根据雨生红球藻转录组中HpHDR基因的部分序列片段设计引物进行3'-RACE和5'-RACE，分别获得455bp和605bp的片段。将获得的3'端序列、5'端序列和中间保守区序列进行拼接，拼接序列命名为HpHDR。获得的HpHDR序列长1421bp，具备完整的阅读框架，长度为1311bp，该序列上游有起始密码子AUG，下游有终止密码子UGA。预测编码的蛋白质434个氨基酸。此外还有63bp的5'调控区，48bp的3'非编码区。

本发明中将获得序列利用ProtParam程序进行在线分析，HpHDR蛋白由434个氨基酸残基组成，分子式为C₂₁₂₉H₃₃₆₃N₆₀₁O₆₅₆S₂₄，分子量大约为48.64KD，理论等电点为6.53，属于稳定类蛋白质。利用SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org/)在线分析工具对HDR进行蛋白质空间结构预测，分析表明，HpHDR蛋白质共有15个α-螺旋结构和12个β-折叠结构(图7)，属于LytB_ispH蛋白质超家族，结构域中包括保守的半胱氨酸残基活性位。该实例中，通过将雨生红球藻中HpHDR序列与部分蓝藻，绿藻以及高等植物的同源蛋白质序列，结果表明雨生红球藻HDR氨基酸序列与其他物种中的HDR相似性在89％-95％之间，从多序列比对图8中可以看出，各物种HDR基因整体在进化过程中相对保守，但是N端保守性相对较差，其它部分保守性较好。而且雨生红球藻在与其他高等植物植物都含有4个保守的半胱氨酸残基活性位点。

4.3.2雨生红球藻HpHDR基因的表达调控分析

为验证IPP生物合成途径中的HpHDR基因在色素合成中的作用，将藻体分别放置在缺氮、高光和高光缺氮条件下进行诱导。测定不同时期的总RNA，并进行定量RT-PCR，分析HpHDR基因在不同诱导时间的表达模式(如图9)。从图9中可以看出雨生红球藻中HpHDR基因在缺氮、高光和高光缺氮三种诱导条件下均存在转录上调的现象，但在三种诱导条件下的变化趋势明显不同。在缺氮条件下，HpHDR基因在前9天内基因表达量持续增加，且在第9天达到前9天内的最大值，为正常条件下的16.3倍；缺氮诱导9天后，HpHDR基因的表达量开始降低，但其表达量仍比正常条件下的表达量高；直至22天时，基因表达量达到了最大峰值，为正常条件下的18.0倍，此后基因表达量又开始急剧下降。在高光条件下，HpHDR基因表达量在前7天内基因表达量持续增加，并在第7天达到最大值，为正常条件下的22.3倍；在诱导7天后，HpHDR基因的表达量开始降低，但其表达量仍比正常条件下的表达量高。在缺氮高光同时的诱导条件下，HpHDR基因表达量在第2天便达到了最大值，为正常条件下的54.4倍。这些结果表明HpHDR基因对外界胁迫条件能够做出响应。本发明结果表明HpHDR的表达调控可以影响下游类胡萝卜素的含量，这也提示我们提高虾青素含量可以从调控IPP途径关键酶出发，给人工调控虾青素合成与代谢工程及大规模工厂化生产提供科学依据。