一种南极磷虾脂质超分子体系中游离脂肪酸的提取及检测方法与流程

本发明涉及一种南极磷虾脂质超分子体系中游离脂肪酸的提取及检测方法，属于食品和化工技术领域。

背景技术：

南极磷虾(Euphausia superba)又名大磷虾或南极大磷虾，隶属节肢动物门、甲壳纲、磷虾目，是南大洋生态系统食物链中的关键物种，是地球上数量最大、繁衍最成功的单种生物资源之一。南极磷虾生物蕴藏量最新估计为3.42～5.36亿吨，年可持续捕捞量将近1亿吨，相当于目前全世界鱼类和其他水产捕获量的总和，世界各国都将南极磷虾作为重要的战略生物资源。

南极磷虾不仅蕴藏量十分惊人，而且营养价值极高。南极磷虾含油脂较多。油脂中含有丰富的Ω-3不饱和脂肪酸二十碳五烯酸(EPA)和二十碳六烯酸(DHA)。将南极磷虾油脂与其他所有动植物油脂比较发现，南极磷虾油脂具有极为突出的特点：南极磷虾磷脂含量高，占油脂含量的35-41％(其他动植物磷脂一般占其油脂含量的2％)；南极磷虾磷脂中磷脂酰胆碱(PC)含量极高，占磷脂含量的80％以上(其他动植物PC一般占其磷脂含量的15-24％)，除PC外，其他的磷脂为磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酸(PA)等等。

南极磷虾在头、背、尾部及肢与躯干交接处的甲壳之下油脂成颗粒分布，在头背部甲壳下分布更为集中，肉眼可见，呈红色颗粒状(见图1)。去甲壳后进行电镜扫描可发现这些物质是一个个各自独立的脂质颗粒(见图2)。两种或两种以上的分子通过非共价键相互作用自组装成的聚集体即是超分子体系。经本课题组研究发现，该甲壳下脂质颗粒即是由多种物质组成的聚集体。因此，南极磷虾甲壳下脂质颗粒其存在状态完全不同于其他任何一种生物体，它是一个独特的、自组装的脂类超分子体系。

目前尚未有关于从南极磷虾脂质超分子体系中提取及检测游离脂肪酸的报道。因此，有必要建立一种针对南极磷虾脂质超分子体系中游离脂肪酸的提取及检测方法，以便于对南极磷虾资源的开发利用。

技术实现要素：

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种南极磷虾脂质超分子体系中游离脂肪酸的提取方法。

本发明的另一目的是提供一种南极磷虾脂质超分子体系中游离脂肪酸的检测方法。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

本发明的第一方面，提供一种南极磷虾脂质超分子体系中游离脂肪酸的提取方法，步骤如下：

(1)分别将南极磷虾头部、背部和尾部的脂质超分子体系剥离，向剥离后的脂质超分子体系中加入乙醇溶液，过滤，收集滤液，滤渣用乙醇洗涤，将洗涤液和滤液合并，得超分子体系油脂溶液；

(2)将超分子体系油脂溶液进行浓缩处理，得超分子体系油脂膏体；

(3)将超分子体系油脂膏体用丙酮溶解，搅拌均匀，离心，分离上清液，除去上清液中的丙酮，即提取得到游离脂肪酸。

步骤(1)中，南极磷虾在进行脂质超分子体系剥离前，南极磷虾鲜虾优选在-45℃～-80℃条件下冷冻处理，然后在质量分数为5％的盐水(氯化钠水溶液)中解冻。将南极磷虾在-45℃～-80℃条件下冷冻处理，一方面可以保证南极磷虾的脂质超分子体系的品质，另一方面，经冷冻处理后，有利于南极磷虾脂质超分子体系的剥离。

步骤(1)中，所述乙醇溶液的体积分数为95-100％。该步骤中加入的乙醇主要有两方面的作用，其一，将剥离的脂质超分子体系溶解；其二，脂质超分子体系在剥离过程中会附着部分软膜，通过乙醇溶液可以将软膜沉淀除去。需要说明的是，溶剂的选择是该步骤处理的关键，经试验验证，选择体积分数为95-100％的乙醇溶液作为溶剂能够有效的将脂质超分子体系溶解，并同时能将附着的软膜去除。

步骤(1)中，乙醇溶液与脂质超分子体系加入量的比为(4-6)ml：1g；优选的，乙醇溶液与脂质超分子体系加入量的比为5ml：1g。乙醇溶液与脂质超分子体系加入量的比会影响脂质超分子体系处理的效果和成本，若乙醇溶液的加入量过少，则会导致脂质超分子体系溶解不完全；若乙醇溶液的加入量过多，则会增加处理的成本，经多次试验验证，并综合考虑处理的效果与成本，发现乙醇溶液与脂质超分子体系加入量的比以(4-6)ml：1g为宜。

步骤(2)中，浓缩处理的条件为：40-50℃下旋转蒸发至干。

步骤(3)中，超分子体系油脂膏体与丙酮加入量的比为(3-4)g：50ml。该步骤中加入丙酮的目的是除去超分子体系油脂膏体中的磷脂。

步骤(3)中，离心的条件为：3000r/min下离心2-4min。

本发明的第二方面，提供一种南极磷虾脂质超分子体系中游离脂肪酸的检测方法，步骤如下：

(1)采用上述方法从南极磷虾脂质超分子体系中提取游离脂肪酸；

(2)将提取的游离脂肪酸用无水乙醇溶解，配成的溶液，混合均匀，过滤，得到澄清透明液体作为待测样品；

(3)将待测样品按照常规的游离脂肪酸检测方法进行检测。

优选的，步骤(2)中，配成的溶液浓度为10mg/ml。

优选的，步骤(2)中，过滤的条件为：采用0.22μm针式过滤器过滤，每次过滤3～5mL的溶剂，过滤1～3次。

优选的，步骤(3)中，采用游离脂肪酸(NEFA)试剂盒进行检测。

需要说明的是，对于南极磷虾脂质超分子体系中游离脂肪酸的提取及检测而言，目前并没有相关的文献报道，属于一个全新的领域。在南极磷虾脂质超分子体系中具体含有哪些成分，如何进行提取分离？这些在现有技术中均未有记载，这也就极大的增加了本发明技术方案提出的难度。

本发明的有益效果：

(1)本发明系首次从南极磷虾脂质超分子体系中提取得到了游离脂肪酸，所需的试剂的种类少，数量小，降低了提取成本，减小了对环境的污染，有利于南极磷虾资源的开发利用。

(2)本发明的南极磷虾脂质超分子体系中游离脂肪酸的提取方法，首先选择体积百分数为95-100％的乙醇溶液对南极磷虾脂质超分子体系进行溶解处理，溶解处理的同时还将脂质超分子体系所附着的软膜沉淀去除；再通过丙酮将脂质超分子体系中的磷脂去除，从而提取得到游离脂肪酸。上述各工艺步骤是一个有机的整体，互为条件，形成了一条全新的从南极磷虾脂质超分子体系中提取游离脂肪酸的工艺流程。

附图说明

图1：南极磷虾脂质超分子体系(甲壳下脂质颗粒)的分布图；

图2：去壳后脂质颗粒的电镜扫描图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述实施例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。

实施例1：南极磷虾脂质超分子体系中游离脂肪酸的提取及检测

1.游离脂肪酸的提取

具体步骤如下：

(1)取少量-80℃冷冻保存的南极磷虾放在5％(质量分数)的盐水中解冻，解冻完全后取南极磷虾在显微镜下观察其脂质超分子体系的分布和形态，然后将其头部、背部、尾部的脂质超分子体系分别剥离到3个50mL的做好标记的烧杯中，按溶液：溶质为5ml：1g在烧杯中倒入无水乙醇，液体呈橙红色。

(2)将橙红色溶液过滤，收集滤液。向滤渣中每次倒入无水乙醇20mL，清洗残渣1次，至溶液无色后将每次清洗的滤液合并。

(3)在45℃温度下旋转蒸发至干，得到头部、背部、尾部脂质超分子体系油脂膏体，分别为3.62g、3.02g、3.18g。

(4)将所得到的头部、背部、尾部南极磷虾脂质超分子体系油脂膏体分别溶于50mL丙酮，磁力搅拌10min后在3000r/min下离心3min，将上清液倒出，每次以20mL丙酮清洗沉淀1～2次，磁力搅拌和离心的条件同上，将每次离心的上清液混合，在45℃温度下旋转蒸发，除去丙酮，即得到从南极磷虾的头部、背部、尾部的脂质超分子体系中提取的游离脂肪酸，将它们4℃遮光保存。

2.游离脂肪酸的检测

具体步骤如下：

(1)分别取从南极磷虾的头部、背部、尾部的脂质超分子体系中提取的游离脂肪酸4.48mg、4.92mg、3.71mg溶于无水乙醇中配成10mg/mL的溶液，并在涡旋振荡器上2000r/min震动10s使其充分混匀。

(2)将充分混匀的南极磷虾脂质超分子体系油脂用有机系0.22μm针式过滤器过滤，每次过滤4mL的溶剂，过滤2次，得到澄清透明的液体作为待测样品。

(3)按照游离脂肪酸(NEFA)试剂盒的操作步骤对待测样品进行检测，具体操作为：

1)取5支带盖的玻璃磨口试管进行编号；

2)向1号管中加入0.2mL的双蒸水、0.5mL的试剂二缓冲液、1.0mL的试剂三铜试剂、4.0mL的试剂一作为空白管；向2号管中加入0.2mL的双蒸水、0.2mL的棕榈酸标准品、0.5mL的试剂二缓冲液、1.0mL的试剂三铜试剂、3.8mL的试剂一作为标准管；向3号管中加入0.2mL的南极磷虾脂质超分子体系头部样品溶液、0.5mL的试剂二缓冲液、1.0mL的试剂三铜试剂、4.0mL的试剂一作为测定管1；向4号管中加入0.2mL的南极磷虾脂质超分子体系背部样品溶液、0.5mL的试剂二缓冲液、1.0mL的试剂三铜试剂、4.0mL的试剂一作为测定管2；向3号管中加入0.2mL的南极磷虾脂质超分子体系尾部样品溶液、0.5mL的试剂二缓冲液、1.0mL的试剂三铜试剂、4.0mL的试剂一作为测定管3。

3)充分抽提2min，2500r/min离心10min，仔细吸去上层蓝色液体弃之，吸取下层抽提液进行显色。

4)用移液枪准确吸去2mL下层抽提液加入另一试管中，加0.25mL显色剂混匀，室温放置2min，在440nm，1cm光径下测量并记录其吸光度。

5)根据游离脂肪酸(NEFA)试剂盒说明书提供的计算公式计算出南极磷虾脂质超分子体系头部、背部、尾部各部位的游离脂肪酸浓度分别为17559.7umol/L、15247umol/L、18980.3umol/L。

实施例2：南极磷虾脂质超分子体系中游离脂肪酸的提取及检测

1.游离脂肪酸的提取

(1)取少量-80℃冷冻保存的南极磷虾放在5％(质量分数)的盐水中解冻，解冻完全后取南极磷虾在显微镜下观察其脂质超分子体系的分布和形态，然后将其头部、背部、尾部的脂质超分子体系分别剥离到3个50mL的做好标记的烧杯中，按溶液：溶质为4ml：1g在烧杯中倒入无水乙醇，液体呈橙红色。

(2)将橙红色溶液过滤，收集滤液。向滤渣中每次倒入无水乙醇20mL，清洗残渣2次，至溶液无色后将每次清洗的滤液合并。

(3)在45℃温度下旋转蒸发至干，得到头部、背部、尾部脂质超分子体系油脂膏体，分别为3.58g、3.04g、3.15g。

(4)将所得到的头部、背部、尾部南极磷虾脂质超分子体系油脂膏体分别溶于50mL丙酮，磁力搅拌10min后在3000r/min下离心3min，将上清液倒出，每次以20mL丙酮清洗沉淀1～2次，磁力搅拌和离心的条件同上，将每次离心的上清液混合，在45℃温度下旋转蒸发，除去丙酮，即得到从南极磷虾的头部、背部、尾部的脂质超分子体系中提取的游离脂肪酸，将它们4℃遮光保存。

2.游离脂肪酸的检测

具体步骤如下：

(1)分别取从南极磷虾的头部、背部、尾部的脂质超分子体系中提取的游离脂肪酸4.36mg、4.75mg、3.98mg溶于无水乙醇中配成10mg/mL的溶液，并在涡旋振荡器上2000r/min震动10s使其充分混匀。

(2)将充分混匀的南极磷虾脂质超分子体系油脂用有机系0.22μm针式过滤器过滤，每次过滤4mL的溶剂，过滤2次，得到澄清透明的液体作为待测样品。

(3)按照游离脂肪酸(NEFA)试剂盒的操作步骤对待测样品进行检测，具体操作同实施例1。

根据游离脂肪酸(NEFA)试剂盒说明书提供的计算公式计算出南极磷虾脂质超分子体系头部、背部、尾部各部位的游离脂肪酸浓度分别为16986.3umol/L、15012.5umol/L、19124.3umol/L。

实施例3：南极磷虾脂质超分子体系中游离脂肪酸的提取及检测

1.游离脂肪酸的提取

(1)取少量-80℃冷冻保存的南极磷虾放在5％(质量分数)的盐水中解冻，解冻完全后取南极磷虾在显微镜下观察其脂质超分子体系的分布和形态，然后将其头部、背部、尾部的脂质超分子体系分别剥离到3个50mL的做好标记的烧杯中，按溶液：溶质为6ml：1g在烧杯中倒入无水乙醇，液体呈橙红色。

(2)将橙红色溶液过滤，收集滤液。向滤渣中每次倒入无水乙醇20mL，清洗残渣3次，至溶液无色后将每次清洗的滤液合并。

(3)在45℃温度下旋转蒸发至干，得到头部、背部、尾部脂质超分子体系油脂膏体，分别为3.65g、3.06g、3.22g。

(4)将所得到的头部、背部、尾部南极磷虾脂质超分子体系油脂膏体分别溶于50mL丙酮，磁力搅拌10min后在3000r/min下离心3min，将上清液倒出，每次以20mL丙酮清洗沉淀1～2次，磁力搅拌和离心的条件同上，将每次离心的上清液混合，在45℃温度下旋转蒸发，除去丙酮，即得到从南极磷虾的头部、背部、尾部的脂质超分子体系中提取的游离脂肪酸，将它们4℃遮光保存。

2.游离脂肪酸的检测

具体步骤如下：

(1)分别取从南极磷虾的头部、背部、尾部的脂质超分子体系中提取的游离脂肪酸4.52mg、4.87mg、3.66mg溶于无水乙醇中配成10mg/mL的溶液，并在涡旋振荡器上2000r/min震动10s使其充分混匀。

(2)将充分混匀的南极磷虾脂质超分子体系油脂用有机系0.22μm针式过滤器过滤，每次过滤4mL的溶剂，过滤2次，得到澄清透明的液体作为待测样品。

(3)按照游离脂肪酸(NEFA)试剂盒的操作步骤对待测样品进行检测，具体操作同实施例1。

根据游离脂肪酸(NEFA)试剂盒说明书提供的计算公式计算出南极磷虾脂质超分子体系头部、背部、尾部各部位的游离脂肪酸浓度分别为18452.3umol/L、14973.2umol/L、17937.8umol/L。

对比例1：

在游离脂肪酸提取的步骤(1)中，将无水乙醇替换为甲醇，其余操作同实施例1，经检测，提取得到的南极磷虾脂质超分子体系头部、背部、尾部各部位的游离脂肪酸浓度分别为13647.2umol/L、12367.4umol/L、13553.8umol/L。

对比例2：

在游离脂肪酸提取的步骤(1)中，将无水乙醇替换为体积分数为70％的乙醇，其余操作同实施例1，经检测，提取得到的南极磷虾脂质超分子体系头部、背部、尾部各部位的游离脂肪酸浓度分别为13584.6umol/L、12493.2umol/L、13602.3umol/L。

由上述对比例可以看出，在游离脂肪酸的提取过程中，替换不同的提取溶剂，或改变提取溶剂的体积分数，则会直接影响南极磷虾脂质超分子体系中游离脂肪酸的提取效率。与对比例1-2相比，采用本发明的提取方法，能够显著的提高南极磷虾脂质超分子体系中游离脂肪酸的提取量。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。