本发明涉及药物化学及有机合成领域，具体说是一类具抗肿瘤活性去甲斑蝥素衍生物及其制备方法。
技术背景
斑蝥素分子中含有氧杂降冰片烯结构，而很多有此类结构的化合物都具备药理活性，氧杂降冰片烯结构在斑蝥素类抗肿瘤活性中发挥的作用值得探索。其可有效抑制包括：肝癌，肺癌，喉癌，食管癌，胰腺癌，结肠癌，口腔癌，膀胱癌，乳腺癌和白血病等多种癌症细胞，对肝癌的治疗效果尤为突出。斑蝥素不仅具有广泛的抗癌谱且不易产生耐药性、抗癌效率较高等优点，而且具有抗病毒，升高白细胞和改善胰功能等作用。
与斑蝥素相比，去甲基斑蝥素（NCTD）是在斑蝥素的基础上少了2,3位上的两个甲基，这使得其毒性大大降低，基本上消除了斑蝥素对泌尿系统的刺激这一副作用，且并不影响NCTD的活性。并且实验发现：NCTD是目前唯一具有升高白细胞作用的抗肿瘤药物。因至今没有对斑蝥素系统的药物化学及药物作用机制的研究是其未获FDA批准，以至于斑蝥素类药物一直受FDA限制，但由于其优良的抗肿瘤活性，一直被临床应用和研究。特别在中国，斑蝥素类药物一直作为临床抗肿瘤药物在使用，对其依赖性强，市场潜力巨大。
为降低斑蝥素的毒性，对斑蝥素分子进行结构改造衍生化等研究工作备受关注，去甲斑蝥素等就是其较好的衍生物的代表，而且其分子含有氧杂降冰片烯结构，而氧杂降冰片烯结构化合物和含氮化合物大多分别具有良好的药用活性，以期通过两类结构的良好结合得到具有更好药理活性分子。因此，本发明在斑蝥素构效关系研究的基础上，以呋喃与丁炔二酸二甲/乙酯为原料，经D-A反应后首先构建去甲斑蝥素的母环—氧杂冰片烯，再以7-氧杂二环[2.2.1]庚烷-2,5-二烯-2,3-二酸二甲/乙酯和含氮化合物为原料，探索胺对氧杂冰片烯的加成反应制备去甲斑蝥素衍生物。
技术实现要素：
本发明提供了一种以丁炔二酸二甲/乙酯与呋喃为原料制备中间体7-氧杂二环[2.2.1]庚烷-2,5-二烯-2,3-二酸二甲/乙酯，再利用胺对氧杂冰片烯的Aza-Michael加成反应制备一类具抗肿瘤活性的去甲斑蝥素衍生物（I）的绿色合成方法。
本发明所合成的去甲斑蝥素衍生物（I）的结构如下所示：
其中：R1、R2、R3选自氢原子、卤素原子、甲氧基、三氟甲基、硝基、烷基或芳基中的一种。
本发明制备去甲斑蝥素衍生物（I）的方法包含以下步骤：
（1）丁炔二酸二甲/乙酯与过量呋喃无溶剂和无催化剂的条件下，加热回流得中间产物7-氧杂二环[2.2.1]庚烷-2,5-二烯-2,3-二酸甲/乙酯；
（2）中间体（I）与胺类化合物（）在无溶剂、室温的绿色化学合成条件下，经薄层色谱点板检测反应完全后，减压旋去溶剂，PE与EA做洗脱剂柱层析分离提纯，制备得到去甲斑蝥素衍生物（I）。
制备路线为：
本发明步骤1中间产物的NMR数据如下：
Yellow oil; 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.18 (2H, t, J = 0.9 Hz), 5.63 (2H, t, J = 1 Hz), 4.26-4.20 (4H, m), 1.28 (6H, t, J = 7.1 Hz).
Yellow oil; 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.21 (2H, t, J = 1.0 Hz), 5.68 (2H, t, J = 1 Hz), 3.08 (6H, s).
本发明的有益效果是：
（1）设计合成了新的具有抗肿瘤活性的去甲斑蝥素衍生物，结构新颖，填补了本领域的空白，为制备选择性抑制肿瘤细胞、毒性小的斑蝥素衍生物打下基础，具有潜在产业化开发价值以及对研究抗癌药物的重要贡献；
（2）本发明的两个初始原料均简单易得，经两步简单反应，工艺条件温和，实验操作简单，绿色高效，具有良好的工业化市场前景。
具体实施实例
实例1 2-4-苯基哌嗪基-7-氧杂二环[2.2.1]庚烷-2,5-二烯-2,3-二乙酯的制备
以丁炔二酸二乙酯与过量呋喃无溶剂和无催化剂的条件下，加热回流得中间产物7-氧杂二环[2.2.1]庚烷-2,5-二烯-2,3-二酸乙酯。中间体再与4-苯基哌嗪在无溶剂、室温的绿色化学合成条件下，经薄层色谱点板检测反应完全后，减压旋去溶剂，PE与EA做洗脱剂柱层析分离提纯，制备得到2-4-苯基哌嗪基-7-氧杂二环[2.2.1]庚烷-2,5-二烯-2,3-二乙酯。化合物数据为： Yield: 83%, yellow oil; IR (KBr) (νmax, cm-1) 3447, 2333, 1731, 1597, 1452, 1263, 1127, 1136, 1060, 860, 755, 568 cm-1; 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ7.27-7.23 (2H, m), 6.91-6.83 (3H, m), 6.59-6.57 (1H, m), 6.25-6.23 (1H, m), 5.31 (1H, s), 5.24 (1H, s), 4.23-4.09 (4H, m), 3.42 (1H, s), 3.08-2.93 (8H, m), 1.32 (3H, t, J = 7.1 Hz), 1.27 (3H, t, J = 7.1 Hz). 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 171.1, 169.9, 151.3, 140.7, 135.0, 129.2, 120.0, 116.2, 81.2, 80.2, 78.2, 61.2, 61.0, 53.3,50.2, 48.2, 14.6, 14.4;HRMS (TOF ES+): m/z calcd for C22H28N2O5Na+[(M+Na)+], 423.1890; found, 423.1885.
实例2 2-4-甲基哌嗪基-7-氧杂二环[2.2.1]庚烷-2,5-二烯-2,3-二乙酯的制备
以丁炔二酸二乙酯与过量呋喃无溶剂和无催化剂的条件下，加热回流得中间产物7-氧杂二环[2.2.1]庚烷-2,5-二烯-2,3-二酸乙酯。中间体再与4-甲基哌嗪在无溶剂、室温的绿色化学合成条件下，经薄层色谱点板检测反应完全后，减压旋去溶剂，PE与EA做洗脱剂柱层析分离提纯，制备得到2-4-甲基哌嗪基-7-氧杂二环[2.2.1]庚烷-2,5-二烯-2,3-二乙酯。化合物数据为： Yield: 59%; yellow oil; IR (KBr) (νmax, cm-1) 3447, 3136, 2838, 2345, 1733, 1455, 1378, 1266, 1127, 1056, 859, 808, 558 cm-1; 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ6.54-6.51 (1H, m), 6.19-6.16 (1H, m), 5.23-5.17 (2H, m), 4.22-4.08(4H, m), 3.35-3.34 (1H, m), 2.82-2.74 (4H, m), 2.30-2.19 (7H, m), 1.30-1.23 (6H, m); 13C NMR (100 MHz, CDCl3):δ 170.1, 169.8, 140.5, 134.7, 81.0, 79.9, 77.9, 60.9, 60.7, 55.8, 53.0, 46.0, 14.3, 14.2; HRMS (TOF ES+): m/z calcd for C22H28N2O5[M+Na+], 423.1890; found, 423.1885.
实例3 2-哌啶基-7-氧杂二环[2.2.1]庚烷-2,5-二烯-2,3-二乙酯的制备
以丁炔二酸二乙酯与过量呋喃无溶剂和无催化剂的条件下，加热回流得中间产物7-氧杂二环[2.2.1]庚烷-2,5-二烯-2,3-二酸乙酯。中间体再与哌啶在无溶剂、室温的绿色化学合成条件下，经薄层色谱点板检测反应完全后，减压旋去溶剂，PE与EA做洗脱剂柱层析分离提纯，制备得到2-哌啶基-7-氧杂二环[2.2.1]庚烷-2,5-二烯-2,3-二乙酯。化合物数据为： Yield: 89%; White solid; m.p. 81-82 oC; IR (KBr) (νmax, cm-1) 3448, 3134, 2332, 1728, 1452, 1265, 1126, 1061, 860, 568 cm-1; 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 6.54-6.53 (1H, m), 6.20-6.18 (1H, m), 5.29 (1H, s), 5.18 (1H, s), 4.22-4.11 (4H, m), 3.36 (1H, s), 2.72-2.67 (4H, m), 1.46-1.36 (6H, m), 1.32-1.26 (6H, m); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 171.3, 170.3, 140.6, 135.2, 81.3, 80.2, 80.1, 79.1, 61.0, 60.9, 53.0, 50.6, 49.3, 27.0, 24.6, 14.6, 14.3; HRMS (TOF ES+): m/zcalcd for C17H25NO5Na+ [(M+Na)+], 346.1624; found, 346.1622.
实例4 2-吗啉基-7-氧杂二环[2.2.1]庚烷-2,5-二烯-2,3-二乙酯的制备
以丁炔二酸二乙酯与过量呋喃无溶剂和无催化剂的条件下，加热回流得中间产物7-氧杂二环[2.2.1]庚烷-2,5-二烯-2,3-二酸乙酯。中间体再与吗啉在无溶剂、室温的绿色化学合成条件下，经薄层色谱点板检测反应完全后，减压旋去溶剂，PE与EA做洗脱剂柱层析分离提纯，制备得到2-吗啉基-7-氧杂二环[2.2.1]庚烷-2,5-二烯-2,3-二乙酯。化合物数据为： Yield: 97%; yellow oil; IR (KBr) (νmax, cm-1) 3447, 3134, 2332, 1730, 1453, 1262, 1122, 1061, 860, 553 cm-1; 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 6.57 (1H, dd, J = 5.8, 1.6 Hz), 6.21 (1H, dd, J = 5, 1.7 Hz), 5.24 (2H, d, J = 9.5 Hz), 4.26-4.12 (4H, m), 3.59 (4H, t, J = 4.5 Hz), 3.38 (1H, s), 2.87-2.81 (2H, m), 2.74-2.71 (2H, m), 1.60 (1H, s), 1.34-1.26 (7H, m); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 171.1, 169.8, 140.8, 134.9, 81.2, 79.8, 78.2, 67.8, 61.2, 60.9, 53.2, 49.7, 48.7, 14.6, 14.4; HRMS (TOF ES+): m/z calcd for C16H23NO6Na+[(M+Na)+], 348.1417; found, 348.31407.
实例5 2-N-乙基-7-氧杂二环[2.2.1]庚烷-2,5-二烯-2,3-二乙酯的制备
以丁炔二酸二乙酯与过量呋喃无溶剂和无催化剂的条件下，加热回流得中间产物7-氧杂二环[2.2.1]庚烷-2,5-二烯-2,3-二酸乙酯。中间体再与乙胺在无溶剂、室温的绿色化学合成条件下，经薄层色谱点板检测反应完全后，减压旋去溶剂，PE与EA做洗脱剂柱层析分离提纯，制备得到2-N-乙基-7-氧杂二环[2.2.1]庚烷-2,5-二烯-2,3-二乙酯。化合物数据为： Yield: 42%; yellow oil; IR (KBr) (νmax, cm-1) 3447, 2980, 2357, 1733, 1457, 1377, 1257, 1126, 1061, 859, 709, 558 cm-1; 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 6.71 (1H, dd, J = 5.8, 1.7 Hz), 6.35 (1H, dd, J = 5.8, 1.8 Hz), 5.07-5.06 (1H, m), 4.79-4.78 (1H, m), 4.16-4.07 (4H, m), 3.06 (1H, d, J = 4.3 Hz), 2.82-2.76 (1H, m), 2.66-2.60 (1H, m), 1.78 (1H, s), 1.24 (6H, t, J = 7.1 Hz), 1.15 (3H, t, J = 7.1 Hz); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 170.6, 170.4, 137.7, 132.8, 85.5, 80.3, 75.6, 61.1, 60.8, 55.9, 39.8, 15.6, 14.2, 14.0.
实例6 2-N-丁基-7-氧杂二环[2.2.1]庚烷-2,5-二烯-2,3-二乙酯的制备
以丁炔二酸二乙酯与过量呋喃无溶剂和无催化剂的条件下，加热回流得中间产物7-氧杂二环[2.2.1]庚烷-2,5-二烯-2,3-二酸乙酯。中间体再与丁胺在无溶剂、室温的绿色化学合成条件下，经薄层色谱点板检测反应完全后，减压旋去溶剂，PE与EA做洗脱剂柱层析分离提纯，制备得到2-N-乙基-7-氧杂二环[2.2.1]庚烷-2,5-二烯-2,3-二乙酯。化合物数据为： Yield: 54%; yellow oil; IR (KBr) (νmax, cm-1) 3381, 2357, 1734, 1664, 1460, 1259, 1127, 860, 550 cm-1; 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 6.72 (1H, dd, J = 5.8, 1.6 Hz), 6.35 (1H, dd, J = 5.8, 1.8 Hz), 5.08-5.06 (1H, m), 4.79-4.78 (1H, m), 4.16-4.06 (4H, m), 3.05 (1H, d, J = 4.3 Hz), 2.80-2.73 (1H, m), 2.58-2.52 (1H, m), 1.84 (1H, s), 1.53-1.46 (2H, m), 1.38-1.33 (2H, m) 1.26-1.22 (6H, m), 0.90 (3H, t, J = 7.28 Hz); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 170.8, 170.6, 137.8, 133.0, 85.6, 80.4, 75.7, 61.3, 60.9, 60.0, 45.3, 32.5, 20.5, 14.3, 14.1, 14.0; HRMS (TOF ES+): m/z calcd for C16H25NO5Na+ [(M+Na)+], 334.1624; found, 334.1625.
实例7 2-N-烯丙基-7-氧杂二环[2.2.1]庚烷-2,5-二烯-2,3-二乙酯的制备
以丁炔二酸二乙酯与过量呋喃无溶剂和无催化剂的条件下，加热回流得中间产物7-氧杂二环[2.2.1]庚烷-2,5-二烯-2,3-二酸乙酯。中间体再与烯丙胺在无溶剂、室温的绿色化学合成条件下，经薄层色谱点板检测反应完全后，减压旋去溶剂，PE与EA做洗脱剂柱层析分离提纯，制备得到2- N-烯丙基-7-氧杂二环[2.2.1]庚烷-2,5-二烯-2,3-二乙酯。化合物数据为： Yield: 57%; colorless oil; IR (KBr) (νmax, cm-1) 3323, 2985, 1734, 1659, 1606, 1459, 1376, 1254, 1170, 1062, 914, 859, 786, 710, 554 cm-1; 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 6.74 (1H, dd, J = 5.8, 1.7 Hz), 6.34 (1H, dd, J = 5.8, 1.8 Hz), 5.98-5.88 (1H, m), 5.23-5.18 (1H, m), 5.11-5.07 (2H, m), 4.80-4.79 (1H, m), 4.16-4.08 (4H, m), 3.46-3.41(1H, m), 3.24-3.19 (1H, m), 3.08 (1H, d, 4.3 Hz), 2.00 (1H, s), 1.26-1.22 (6H, m); 13C NMR (100 MHz, CDCl3):δ 170.5, 170.4, 137.9, 136.0, 132.8, 116.7, 85.8, 80.4, 75.5, 61.3, 60.9, 55.9, 48.5, 14.2, 14.1; HRMS (TOF ES+): m/z calcd for C15H22NO5[(M+1)+], 296.1498; found, 296.1501.
实例8 2-N-苯基-7-氧杂二环[2.2.1]庚烷-2,5-二烯-2,3-二乙酯的制备
以丁炔二酸二乙酯与过量呋喃无溶剂和无催化剂的条件下，加热回流得中间产物7-氧杂二环[2.2.1]庚烷-2,5-二烯-2,3-二酸乙酯。中间体再与苯胺在无溶剂、室温的绿色化学合成条件下，经薄层色谱点板检测反应完全后，减压旋去溶剂，PE与EA做洗脱剂柱层析分离提纯，制备得到2- N-苯基-7-氧杂二环[2.2.1]庚烷-2,5-二烯-2,3-二乙酯。化合物数据为： Yield 54%; White solid; m.p. 107-108 ℃; IR (KBr) (νmax, cm-1) 3385, 2974, 2331, 1735, 1604, 1511, 1449, 1377, 1321, 1254, 1062, 1011, 859, 749, 689, 551 cm-1; 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.20-7.16 (2H, m), 6.84-6.80 (4H, m), 6.46 (1H, dd, J = 5.8, 1.9 Hz), 5.15-5.14 (1H, m), 5.06-5.05 (1H, m), 4.41 (1H, s), 4.20-4.09 (4H, m), 3.19 (1H, d, J = 4.4Hz), 1.30 (3H, t, J = 7.2 Hz), 1.15 (3H, t, J = 7.1 Hz); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 170.6, 169.8, 144.9, 138.3, 132.3, 129.1, 119.5, 115.8, 86.5, 80.6, 72.4, 61.9, 61.2, 58.2, 14.1, 14.0.
实例9 2-N-对甲苯基-7-氧杂二环[2.2.1]庚烷-2,5-二烯-2,3-二乙酯的制备
以丁炔二酸二乙酯与过量呋喃无溶剂和无催化剂的条件下，加热回流得中间产物7-氧杂二环[2.2.1]庚烷-2,5-二烯-2,3-二酸乙酯。中间体再与对甲苯胺在无溶剂、室温的绿色化学合成条件下，经薄层色谱点板检测反应完全后，减压旋去溶剂，PE与EA做洗脱剂柱层析分离提纯，制备得到2- N-对甲苯基-7-氧杂二环[2.2.1]庚烷-2,5-二烯-2,3-二乙酯。化合物数据为： Yield 57%; yellow oil; IR (KBr) (νmax, cm-1) 3386, 2356, 1730, 1519, 1454, 1257, 1126, 1061, 858, 814, 567 cm-1; 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.00 (2H, d, J = 8.4 Hz), 6.79 (1H, dd, J = 5.8, 1.6 Hz), 6.74-6.71 (2H, m), 6.46 (1H, dd, J = 5.8, 1.8 Hz), 5.13-5.12 (1H, m), 5.04 (1H, s), 4.26 (1H, s), 4.19-4.09(4H, m), 3.18 (1H, d, J = 4.4 Hz), 2.25 (3H, s), 1.29 (3H, t, J = 7.13 Hz), 1.17 (6H, t, J = 7.13 Hz); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 170.7, 170.40, 142.5, 138.1, 132.5, 129.6, 129.1, 116.4, 86.3, 72.8, 61.9, 61.2, 58.1, 20.6, 14.2, 14.1; HRMS (TOF ES+): m/z calcd for C19H24NO5 [(M+1)+], 346.1468; found, 346.1649.
实例10 2-N-间甲氧基-7-氧杂二环[2.2.1]庚烷-2,5-二烯-2,3-二乙酯的制备
以丁炔二酸二乙酯与过量呋喃无溶剂和无催化剂的条件下，加热回流得中间产物7-氧杂二环[2.2.1]庚烷-2,5-二烯-2,3-二酸乙酯。中间体再与间甲氧基苯胺在无溶剂、室温的绿色化学合成条件下，经薄层色谱点板检测反应完全后，减压旋去溶剂，PE与EA做洗脱剂柱层析分离提纯，制备得到2-N-间甲氧基-7-氧杂二环[2.2.1]庚烷-2,5-二烯-2,3-二乙酯。化合物数据为： Yield 57%; yellow oil; IR (KBr) (νmax, cm-1) 3448, 2356, 1656, 1456, 1265, 1125, 1062, 860, 554 cm-1; 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.09-7.05 (1H, m), 6.80 (1H, dd, J = 5.9, 1.7 Hz), 6.45 (1H, dd, J = 5.8, 1.9 Hz), 6.42-6.36 (3H, m), 5.14-5.13 (1H, m), 5.06-5.05 (1H, m), 4.44 (1H, s), 4.19-4.10 (4H, m), 3.75 (3H, s), 3.19 (1H, d, J = 4.4 Hz), 1.30 (3H, t, J = 7.2 Hz), 1.16 (3H, t, J = 7.1 Hz); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ170.5, 169.7, 160.6, 146.3, 138.2, 132.3, 129.8, 108.5, 104.6, 102.0, 86.5, 80.6, 72.4, 61.9, 61.2, 58.3, 55.2, 14.1, 14.0.
下面通过药效学实验来进一步说明其药物活性。
实验例：采用MTT法评价化合物对肿瘤细胞株的生长抑制作用
实验方法：
1、收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入198μL，铺板使待测细胞调密度至1000-10000/孔，（边缘孔用无菌PBS填充）；
2.、5%CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板），加入浓度梯度的药物，设3个副孔，细胞贴壁后加药2μL；
3.、5%CO2，37℃孵育24小时，倒置显微镜下观察；
4、每孔加入20μL MTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h；
5、终止培养，小心吸去孔内培养液；
6、每孔加入150μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值；
7、同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）；
抑制率=1-（给药组OD值均值-空白组OD值均值）/（阴性组OD值均值-空白组OD值均值）。
实验结果：去甲斑蝥素衍生物对褐家鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞（PC12）的生长具有显著的抑制作用。该化合物抑制细胞生长的IC50值为27.517μM。
由上述实验例表明，本发明的去甲斑蝥素衍生物对肿瘤细胞株褐家鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞（PC12）的生长具有显著的抑制作用。由此证明，本发明的去甲斑蝥素衍生物具有抗肿瘤活性，具有用于治疗或预防癌症的用途。这为深入研究和开发新的抗肿瘤药物开辟了新的途径和方向。