本发明涉及生物技术和资源利用与可持续发展领域，更具体涉及一种从雨生红球藻提取虾青素的方法。
背景技术：
目前，富含虾青素的雨生红球藻孢子细胞壁较厚，难以破除。对雨生红球藻细胞壁的破除多见于物理方法，有高压均质法、研磨法、反复冻融法，以及添加玻璃珠振荡法，但效率极低，特别是添加液氮研磨法不仅费时，而且研磨过程虾青素损耗严重，难以定量。
虾青素(astaxanthin)即3,3′-二羟基-4,4′-二酮基-β,β′-胡萝卜素，是萜烯类不饱和化合物，分子化学式为C40H52O4，分子量为596.86。虾青素在自然界中广泛存在，在虾蟹、鱼、红发夫酵母、雨生红球藻中含量较高。由于其分子结构两端具有两个羟基，因此虾青素具备左旋、内消旋、右旋这三种异构型态，人工合成虾青素为3种构象的混合物，其中左旋右旋各占25％，内消旋占50％。酵母源虾青素为100％右旋结构，藻源虾青素为100％左旋结构，而仅有左旋异构型具有生物活性，因此，雨生红球藻被视为自然界中强抗氧化性虾青素的来源。其分子结构具有11个共轭双键，因此具备极强的抗氧化性，其抗氧化活性远超过现有的抗氧化剂，其清除自由基的能力是维生素C的6000倍，是维生素E的1000倍等，广泛应用于抗氧化、抗肿瘤及预防癌症。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种从雨生红球藻提取虾青素的方法，该方法简单，操作方便，易于定量，细胞壁破除效率高。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
一种从雨生红球藻提取虾青素的方法，包括：
1)10-20mg冻干藻粉与1-1.5ml提取溶剂加入冻存管中，加入锆珠后进行高速震荡，震荡条件为：5000-8000rpm高速震荡15-20s，静置10秒，5000-8000rpm高速震荡15-20s；震荡完毕后立即进行4℃，7000-8000rpm离心2.5分钟，转移过程避光；取上清至经过充氮和冰浴处理的棕色玻璃瓶；藻渣中继续加入1ml提取溶剂，继续高速震荡，离心，取上清，重复此步骤直至藻渣无色。
所述的提取溶剂为：二氯甲烷：甲醇＝1:3，V/V；
加入的锆珠的规格为：3mm粒径3-5颗，1mm粒径7-10颗和0.15mm粒径1-1.5g；
以上所述的方案中，优选的，加入的锆珠的规格为：3mm粒径3颗，1mm粒径7颗和0.15mm粒径1g；
2)将棕色玻璃瓶中收集的上清进行3000-5000rpm离心5-10min，取上清至经过充氮和冰浴处理的新的棕色玻璃瓶，充氮保存。
本发明用于上述提取方法的锆珠，该锆珠也可以替代传统的玻璃珠应用于同类藻细胞的细胞壁破除实验，如小球藻、栅藻等。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和显著地效果：
雨生红球藻细胞壁破除率高，效率高，操作方便，设备简单，安全可靠，适用于雨生红球藻虾青素的定量工作。相对于国标的研磨法而言，研磨过程中虾青素损失严重并无法提取完全，不同规格配比的锆珠的加入使得雨生红球藻细胞破碎完全，破碎率可达95％以上，虾青素提取率达95％以上，使用HPLC可对雨生红球藻虾青素含量进行精确定量。
具体实施方式
本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案，所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
实施例1：
一种从雨生红球藻提取虾青素的方法，包括以下步骤：
本实施例所用的雨生红球藻为中国科学院淡水藻种库保藏的FACHB-797。
所用的锆珠(即破碎碾磨珠)购自湖北新纵科病毒疾病工程技术有限公司。
1、提取阶段
A.首先配制提取溶剂及皂化试剂，成分如下：
(1)二氯甲烷：甲醇＝1:3(V/V)：取洁净量筒量取100ml二氯甲烷和300ml甲醇溶液，于洁净的蓝盖瓶，现用现配，为提取溶剂；
(2)0.4M NaOH-甲醇：取1.6g NaOH溶于100ml甲醇溶液，超声辅助溶解，置于棕色细口瓶备用；
(3)2％磷酸-甲醇：取2ml磷酸与98ml甲醇溶液混合，保存备用。
B.称取10mg冻干后藻粉于2.0ml冻存管中，依次编号记录，充氮密封并于-20℃低温保藏备用。正式提取前准备好冰盒对提取过程中虾青素溶液及时低温保藏，防止温度偏高造成虾青素降解。加入锆珠(3mm，1mm和0.15mm粒径大小各3颗,7颗和1g)和1ml二氯甲烷-甲醇溶液后，进行下述步骤：
a、将冻存管放入高速震荡机中，5000rpm高速震荡20s，静置10秒，5000rpm高速震荡20s；
b、立即进行4℃，8000rpm离心2.5分钟，转移过程避光；
c、使用毛细管转移上清于洁净并经过充氮和冰浴处理的40ml棕色玻璃瓶(CNW)。
余下的藻渣继续加入1ml体积提取溶剂，重复步骤a～c，直至藻渣无色。
C.对上述棕色玻璃管中收集的上清进行3000rpm离心5min后，转移上清至洁净并经过充氮和冰浴处理的25ml容量瓶，加入适量的提取溶剂将玻璃管内壁上沾的虾青素洗脱干净重复离心取上清，定容。
D.将定容后的虾青素提取液转移至洁净并经过充氮和冰浴处理的新的40ml棕色玻璃瓶，充氮保存。
2、皂化阶段
从上述容量瓶中准确量取5ml提取液于洁净并充氮处理的10ml比色管中，使用铝箔纸将管架封好避光。
加入0.7ml上述NaOH-甲醇溶液，漩涡混合，在4℃冰箱中遮光反应过夜14h。
在反应液中加入0.4ml 2％磷酸-甲醇溶液中和剩余的碱，混匀，在氮气吹扫下定容至5ml，低于5ml时使用上述二氯甲烷-甲醇溶液定容。
3、测定阶段高效液相色谱法：
(1)色谱条件：
i.色谱柱：C18色谱柱，4.6mm×250mm，5μm(WAT054275)。
ii.柱温：25℃。
iii.检测器：检测波长为474nm。
iv.进样量：20μl。
v.流速：1.0ml·min-1。
vi.流动相：流动相和梯度洗脱程序见表1和2。
表1流动相(各组分体积比)
表2流动相梯度洗脱程序
(2)定量方法
i.制备标准液
称取约1mg虾青素标准样品(SML0982-50MG,Sigma)，溶于上述二氯甲烷-甲醇溶液于10ml容量瓶定容，充氮密封。分别准确移取上述溶液0,0.05,0.1,0.15,0.20,0.40,0.60,0.80,1.00ml于2ml棕色玻璃瓶(CNW)，并分别加入1.00,0.95,0.90,0.85,0.80,0.60,0.40,0.20,0ml稀释，备用。按照上述列出的色谱条件进行高效液相色谱分析测定，根据峰面积与虾青素含量制定标准曲线。
ii.样品准备及测定
移取1ml皂化后样品于2ml棕色玻璃瓶(CNW)，依次编号。按照上述列出的色谱条件进行高效液相色谱分析测定，记录峰面积依据上述标准曲线计算虾青素含量。
结果显示：不同规格配比的锆珠的加入使得雨生红球藻细胞破碎完全，破碎率达96％，虾青素提取率达95.5％，使用HPLC可对雨生红球藻虾青素含量进行精确定量，根据HPLC结果显示，所提取的虾青素出峰时间与标准样品(左旋虾青素，Sigma)出峰时间一致，表明提取过程虾青素基本没有被氧化。按照所使用的样品，10mg的雨生红球藻可获得350ug虾青素。