一种用于评价嗜酸乳杆菌免疫调节作用的方法及应用与流程

本发明涉及一种用于评价嗜酸乳杆菌免疫调节作用的方法及应用，属于生物技术领域。

背景技术：

益生乳酸菌是一群能够粘附于宿主肠道后通过定植作用改变宿主某一部位菌群组成，从而对宿主发挥多种有益作用的活的微生物。研究表明，其在维持肠道微生态平衡、增强机体免疫机能、降低血清胆固醇和预防及抑制肿瘤发生等方面发挥着重要的作用，是维持机体健康必不可少的生理菌群之一。肠道正常菌群紊乱会导致口服免疫耐受丧失，甚至会引起系统性的超敏反应，这些细菌是胃肠道或系统免疫稳态维持不可缺少的重要组成部分。国内外已有大量实验证实体内的多种乳酸菌可对免疫系统产生调节作用，嗜酸乳杆菌(NCFM)作为研究的一种模式菌株，能够调节宿主特异性及非特异性免疫反应，且可能对局部细胞因子分泌以及局部免疫反应有影响。

目前普遍认为嗜酸乳杆菌(NCFM)需经吸附、定植至肠道上皮细胞，然后发挥益生及免疫调节作用。Caco-2细胞体外吸附试验模型和动物(小鼠)益生菌体内灌胃试验模型是评价免疫调节作用常用的研究方法。Caco-2细胞在特定体外培养条件下可自发进行上皮样分化形成紧密连接，其形态学、结构功能、标志酶的功能表达等都与小肠上皮细胞类似，因而被广泛应用于乳酸菌的肠道粘附评估和药物等物质肠道吸收代谢实验中。小鼠试验模型则更加直观的评价嗜酸乳杆菌(NCFM)免疫调节作用的效果。

现阶段对嗜酸乳杆菌免疫调节作用的评价主要依据《保健食品功能学评价程序和检验方法》中所规定的脏器/体重比值、细胞免疫功能测定、体液免疫功能测定、巨噬细胞功能测定和NK细胞活性测定相关方法，但仅仅依据某一检测指标的阳性或阴性结果来判断是否具有免疫调节作用对全面、有效、整体化的评价有一定局限性。因此，建立一种快速、准确的通过确定和检测与免疫调节功能紧密相关的细胞因子和趋化因子来评价嗜酸乳杆菌免疫调节作用的方法显得尤为重要。

技术实现要素：

为解决现有技术的不足，本发明提供了一种用于评价嗜酸乳杆菌免疫调节作用的方法，采用的技术方案如下：

本发明的目的在于提供一种用于评价嗜酸乳杆菌免疫调节作用的方法，该方法是对与免疫相关的差异表达基因的动态变化情况进行检测；所述差异表达基因包括：上调的免疫相关基因CCL2、CCL20、IL1α、IL1β、IL6ST、IL8、PTX3、TNFRSF9和下调的免疫相关基因CXCR4。

优选地，所述方法是利用Real Time RT-PCR对与免疫相关的差异表达基因的动态变化情况进行检测；所述差异表达基因包括：上调的免疫相关基因CCL2、CCL20、IL1α、IL1β、IL6ST、IL8、PTX3、TNFRSF9和下调的免疫相关基因CXCR4。

更优选地，所述的方法，其特征在于，步骤如下：

1)将嗜酸乳杆菌与宿主细胞共培养后提取宿主细胞的总RNA，或将嗜酸乳杆菌菌悬液给受体食用后提取受体的肠组织的总RNA，获得总RNA；

2)利用步骤1)所得的总RNA通过反转录获得cDNA，以cDNA为模板，根据差异表达基因CCL2、CCL20、IL1α、IL1β、IL6ST、IL8、PTX3、TNFRSF9和CXCR4的特异性上下游引物进行扩增，以GAPDH作为内参基因进行Real Time RT-PCR检测，分析各个所述差异表达基因在mRNA水平的表达情况。

优选地，步骤1)所述嗜酸乳杆菌为嗜酸乳杆菌NCFM。

优选地，步骤1)所述宿主细胞，为Caco-2细胞；优选地，当宿主细胞为Caco-2细胞时，步骤2)所述GAPDH的特异性上、下游引物如SEQ ID NO.1-2所示；所述CCL2的特异性上、下游引物如SEQ ID NO.3-4所示；所述CCL20的特异性上、下游引物如SEQ ID NO.5-6所示；所述IL1α的特异性上、下游引物如SEQ ID NO.7-8所示；所述IL1β的特异性上、下游引物如SEQ ID NO.9-10所示；所述IL6ST的特异性上、下游引物如SEQ ID NO.11-12所示；所述IL8的特异性上、下游引物如SEQ ID NO.13-14所示；所述PTX3的特异性上、下游引物如SEQ ID NO.15-16所示；所述TNFRSF9的特异性上、下游引物如SEQ ID NO.17-18所示；所述CXCR4的特异性上、下游引物如SEQ ID NO.19-20所示。

优选地，步骤1)所述受体，为小鼠；当受体为小鼠时，步骤2)所述GAPDH的特异性上、下游引物如SEQ ID NO.21-22所示；所述CCL2的特异性上、下游引物如SEQ ID NO.23-24所示；所述CCL20的特异性上、下游引物如SEQ ID NO.25-26所示；所述IL1α的特异性上、下游引物如SEQ ID NO.27-28所示；所述IL1β的特异性上、下游引物如SEQ ID NO.29-30所示；所述IL6ST的特异性上、下游引物如SEQ ID NO.31-32所示；所述IL8的特异性上、下游引物如SEQ ID NO.33-34所示；所述PTX3的特异性上、下游引物如SEQ ID NO.35-36所示；所述TNFRSF9的特异性上、下游引物如SEQ ID NO.37-38所示；所述CXCR4的特异性上、下游引物如SEQ ID NO.39-40所示。

优选地，步骤2)所述差异表达基因CCL2、CCL20、IL1α、IL1β、IL6ST、IL8、PTX3、TNFRSF9和CXCR4的筛选方法为：通过对嗜酸乳杆菌NCFM作用后的肠道细胞的基因表达谱进行分析，根据基因表达谱分析的结果，利用Gene Ontology分类标准进行筛选得到的。

优选地，步骤2)所述Real Time RT-PCR，反应程序为：95℃，10s预变性；95℃，5s；60℃，34s，40个循环。

优选地，所述评价嗜酸乳杆菌具有免疫调节作用的判定方法，是基因CCL2、CCL20、IL1α、IL1β、IL6ST、IL8、PTX3、TNFRSF9表达上调且基因CXCR4表达下调。

本发明还提供了一种上述任一方法在评价乳酸菌免疫调节作用中的应用。

本发明有益效果：

本发明根据嗜酸乳杆菌(NCFM)免疫调节相关研究结果，提供了一种可以快速有效的评价嗜酸乳杆菌免疫调节作用的方法，该方法只需要检测九种免疫相关基因就可以评估嗜酸乳杆菌的免疫调节作用，同时利用Real Time PCR(RT-PCR)可以实现快速评估，大大节约时间；本发明还针对Caco-2细胞和小鼠细胞为受体的情况下，分别设计了进行Real Time PCR反应的特异性引物，在小鼠试验中以及Caco-2细胞中均得到了较好的验证。本发明克服了现有的嗜酸乳杆菌免疫调节功能评价的不足，可以客观评价嗜酸乳杆菌对宿主的免疫调节作用。

附图说明

图1为Caco-2细胞的形态(×400)。

图2为总RNA琼脂糖凝胶电泳图；

(1，对照：无NCFM作用Caco-2细胞；2，NCFM作用Caco-2细胞2h)。

图3 Real Time RT-PCR检测免疫相关基因的扩增曲线。

图4总RNA琼脂糖凝胶电泳图；

(1，对照：无NCFM作用Caco-2细胞)；2，3，4，5分别为嗜酸乳杆菌NCFM作用Caco-2细胞2、4、8和12h)。

图5 Real Time RT-PCR检测免疫相关基因表达的扩增曲线；

(1，2，3，4分别为嗜酸乳杆菌NCFM作用于Caco-2细胞2、4、8和12h)。

图6嗜酸乳杆菌NCFM作用后Caco-2细胞相关免疫基因表达的动态变化；

(A，CCL2；B，CCL20；C，IT1α；D，IL1β；E，IL6ST；F，IL8；G，PTX3；H，TNFRSF9；ICXCR4)。

图7总RNA琼脂糖凝胶电泳图；

(1：对照；2,，3，4，5分别为嗜酸乳杆菌NCFM对小鼠灌胃1、3、5和7天)。

图8 Real Time RT-PCR检测免疫相关基因的扩增曲线；

(A，B，C，D分别为嗜酸乳杆菌NCFM作用于小鼠1、3、5和7天后的扩增曲线)

图9嗜酸乳杆菌NCFM作用后小鼠肠组织细胞免疫相关基因表达的动态变化；

(A，CCL2；B，CCL20；C，IT1α；D，IL1β；E，IL6ST；F，IL8；G，PTX3；H，TNFRSF9；ICXCR4)。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。

1 实验材料与方法

1.1 实验菌株、细胞、实验动物、基因芯片

嗜酸乳杆菌NCFM由丹麦丹尼斯克公司(Danisco)惠赠。

人结肠癌细胞Caco-2购自中国科学院上海生命科学研究所。

昆明系小白鼠购自黑龙江省医科大学实验动物中心。

基因芯片：Affymetrix公司的U133Plus2.0基因表达谱芯片，由上海生物芯片有限公司-生物芯片上海国家工程研究中心提供，该芯片涵盖47000个转录本，代表38500个人类基因。

1.2 人结肠腺癌细胞Caco-2的培养

人结肠癌细胞Caco-2为贴壁生长细胞，在37℃下用含10％胎牛血清、100U/mL青霉素及100μg/mL链霉素的DMEM培养液于5％CO2的培养箱内培养，隔天换液。

1.3 筛选确定免疫相关的差异表达基因

采用Affymetrix公司的U133 Plus 2.0表达谱芯片对嗜酸乳杆菌NCFM作用后Caco-2细胞的基因表达谱进行了分析，该芯片涵盖47000个转录本，代表38500个人类基因。基因芯片制备及杂交反应和芯片扫描均严格按照Affymetrix基因表达谱芯片操作指南进行。

为了进一步分析嗜酸乳杆菌NCFM对机体免疫相关基因的调控作用及其机制，根据基因芯片杂交结果，利用GO分类标准筛选嗜酸乳杆菌作用后Caco-2细胞中差异表达的免疫相关基因。差异表达基因筛选标准是基因变化(change)为I或MI，log ration≥1，实验组检测值(Detection)为P的为上调基因；change为D或MD，log ratio≤-1，Detection为P的为下调基因。具体筛选步骤如下：

1.打开基因芯片杂交结果对应的GO分类附表文件，hs-go-resuLt.xls，全选该表以后在菜单上选择自动筛选；

2.选择自动筛选以后，点击“immune response”旁边的小三角形，选择筛选条件＝1；

3.程序会自动将所有该列值为1的探针号列出，选择整张数据表，将其复制后粘贴到一个新的EXCEL文件中，将此时生成的新表称为条件表；

4.打开需要做筛选的数据表，点击探针列后选择高级筛选；

5.程序会自动跳出一个高级筛选的条件对话框，点击条件区域，准备填写筛选条件；

6.切换到条件表后选择探针序列，点击确定；

7.EXCEL会自动将数据表根据条件表的探针ID号进行筛选，仅显示在条件表内出现ID号的探针，此时筛选的基因即为免疫相关的差异表达基因。

1.4 Real Time RT-PCR方法验证基因芯片结果

1.4.1 嗜酸乳杆菌NCFM作用后的Caco-2细胞总RNA的提取

Caco-2细胞在DMEM培养液中培养16～17天后达到极化状态。嗜酸乳杆菌NCFM在MRS培养基中培养至对数生长期后，用DMEM培养液调整菌浓度为3×108cfu/mL，与极化状态的Caco-2细胞在37℃、5％CO2条件下作用2h，之后用4℃PBS缓冲液对嗜酸乳杆菌NCFM作用组(实验组)和无嗜酸乳杆菌NCFM作用组(对照组)的Caco-2细胞冲洗3次。

参用标准的Trizol RNA提取方法抽提实验组和对照组的Caco-2细胞总RNA。

1.4.2 RNA完整性和纯度的检测

1.4.3 反转录反应体系

将待检测的RNA样品进行反转录反应，反转录成cDNA，利用ExScriptTM RT PCR试剂盒(TaKaRa公司)中的反转录部分进行RT反应，具体反转录体系中试剂的名称及用量如下：

反转录过程为：反转录反应37℃，15min；反转录酶的失活反应85℃，5s。

1.4.4 Real Time RT-PCR方法验证芯片结果

对提取出的Caco-2细胞总RNA样品进行反转录获得cDNA后进行Real Time RT-PCR反应，针对待检测基因GAPDH、CCL2、CCL20、IL1α、IL1β、IL6ST、IL8、PTX3、TNFRSF9和CXCR4，利用Primer 5.0软件设计各基因特异性上下游引物，见表1。

表1 待测基因Real Time RT-PCR引物的碱基序列、基因定位、Tm值及扩增产物的大小

利用ExScriptTM RT-PCR试剂盒进行检测，反应体系为20μL，具体试剂名称及用量如下：

使用ABI/7500系统进行各基因PCR扩增反应，反应程序如下：95℃，10s预变性；95℃，5s；60℃，34s，40个循环。每种基因的PCR反应均进行扩增产物的融解曲线分析，以确定扩增产物的特异性和纯度。各基因表达比较均采用GAPDH作为内参基因，所有待测样品均设3个重复，并用去离子水代替模板作为阴性对照。分析各基因的Ct值，计算出标化后的-△△Ct值，利用2-△△Ct法对目的基因的表达量进行评估。

1.4.5 免疫相关基因动态变化规律的体外研究

Caco-2细胞接种于6孔细胞培养板中，培养16～17天后，达到极化状态。经嗜酸乳杆菌NCFM(3×108cfu/mL)作用2、4、8和12h后，按1.4.1提取细胞总RNA。

反转录反应体系及过程同1.4.3，引物设计、Real Time RT-PCR反应体系及反应程序同1.4.4，通过分析各基因的Ct值，计算出标化后的-△△Ct值，利用2-△△Ct法对目的基因的表达量进行评估。

1.5 免疫相关基因动态变化规律的体内研究

1.5.1 实验动物的分组

实验动物采用昆明属小鼠(清洁级，雌雄各半，鼠龄8周左右，体重20±2g)，随机分为5组，分别为空白对照组(灌服灭菌脱脂乳)、灌服嗜酸乳杆菌NCFM 1d、3d、5d和7d组。培养嗜酸乳杆菌NCFM至对数生长期，并按表2以灭菌脱脂乳将嗜酸乳杆菌配成浓度为3×10⁹cfu/mL的含菌脱脂乳悬液，每日一次灌服给各实验组小鼠。

表2 实验分组及饲喂方式

1.5.2 小鼠肠组织RNA的提取

颈椎离断处死小鼠，打开腹腔，取回肠和结肠，置于预冷的生理盐水溶液中，冲洗干净肠内容物后，迅速置于液氮中保存。参用标准的Trizol RNA提取方法抽提小鼠肠组织RNA.

1.5.3 Real Time RT-PCR检测免疫相关基因的动态变化规律

对提取出的小鼠肠组织RNA样品进行反转录获得cDNA后进行Real Time RT-PCR反应，针对待检测基因GAPDH、CCL2、CCL20、IL1α、IL1β、IL6ST、IL8、PTX3、TNFRSF9和CXCR4，利用Primer 5.0软件设计各基因特异性上下游引物(见表3)。

表3 待测基因Real Time RT-PCR引物的碱基序列、基因定位、Tm值及扩增产物的大小

反转录反应体系及过程同1.4.3，Real Time RT-PCR反应体系及反应程序同1.4.4，通过分析各基因的Ct值，计算出标化后的-△△Ct值，利用2-△△Ct法对目的基因表达量进行评估。

2 结果与分析

2.1 细胞的培养

由图1可以看出，Caco-2细胞为贴壁生长的细胞，用含有10％胎牛血清的DMEM培养在37℃、5％CO2的培养箱内培养，隔天换液，5天传代。连续培养16～17天后，细胞可达极化状态。此时，细胞紧密连接，与小肠上皮细胞类似，可用于后续实验。

2.2 免疫相关基因的筛选确定

实验室前期已经利用涵盖47 000个转录本，代表38 500个人类基因的人基因表达谱芯片杂交分析检测了嗜酸乳杆菌NCFM作用2h后Caco-2细胞的基因表达变化情况。对基因芯片结果进行分析，发现嗜酸乳杆菌NCFM作用2h后Caco-2细胞的差异表达基因为508个，包括473个基因上调和35个基因下调。

利用Gene Ontology分类(GO分类)标准对免疫相关的差异表达基因进行筛选，发现嗜酸乳杆菌NCFM作用后可诱导Caco-2细胞中趋化因子及其受体、白细胞介素类细胞因子以及肿瘤坏死因子受体等基因的表达变化，这些基因都与机体的免疫调节作用有关。表4列出了嗜酸乳杆菌NCFM作用后Caco-2细胞免疫相关基因的表达变化情况。

表4 嗜酸乳杆菌NCFM对Caco-2细胞免疫相关基因表达的影响

↑代表上调表达，↓代表下调表达

2.3 Real Time RT-PCR方法验证芯片结果

2.3.1 Caco-2细胞中总RNA的质量检测

对提取的Caco-2细胞总RNA进行260nm和280nm处的OD值检测，每个样品重复检测3次，并计算OD260/OD280的比值，结果如表5。由检测结果可以看出，RNA纯度较高、蛋白质污染较低，Trozol法可以获得高质量的RNA，用于后续实验。

表5 RNA样品的纯度及浓度检测

经1％琼脂糖凝胶电泳后，由图2可以看出，18s RNA和28s RNA电泳条带清晰，28s RNA条带无明显降解。说明总RNA质量较好，可以用于进行后续实验。

2.3.2 Real Time RT-PCR验证芯片结果

为了进一步验证基因芯片的准确性，我们以GAPDH作为内参基因，采用Real TimeRT-PCR方法对筛选出的免疫相关基因在mRNA表达水平进行验证。结果显示，实验组和对照组中免疫相关基因和GAPDH基因mRNA表达的扩增曲线重合度良好，均呈现出典型的“S”型，见图3。

通过分析嗜酸乳杆菌NCFM作用于Caco-2细胞后免疫相关基因扩增曲线的Ct值，我们利用2-ΔΔCt法，以GAPDH扩增曲线的Ct值消除本底模板差异后，对Caco-2细胞中免疫相关基因受嗜酸乳杆菌NCFM作用后mRNA表达水平的变化进行量化。通过表4可以看出，嗜酸乳杆菌NCFM作用后Caco-2细胞中免疫相关基因表达的Real Time RT-PCR检测结果，与基因芯片的相应分析结果基本一致。

2.4 免疫相关基因动态变化规律的体外研究

2.4.1 Caco-2细胞的总RNA质量检测

抽提的Caco-2细胞总RNA经1％琼脂糖凝胶电泳后，18s RNA和28sRNA电泳条带清晰，28s RNA条带无明显降解(见图4)。说明总RNA质量完好，可进行RealTime RT-PCR实验。

2.4.2 Real Time RT-PCR检测免疫相关基因的动态变化规律

为进一步检测嗜酸乳杆菌NCFM作用于Caco-2细胞后诱导免疫相关基因表达的动态变化趋势，我们利用嗜酸乳杆菌NCFM分别与Caco-2细胞共同培养2、4、8和12h，然后采用Real Time RT-PCR方法对免疫相关基因的表达在mRNA水平进行检测，并以管家基因GAPDH作为内参基因，结果如图5所示。通过图5可以看出，嗜酸乳杆菌NCFM与Caco-2细胞共培养2、4、8和12h后，实验组和对照组中免疫相关基因和GAPDH基因mRNA表达的扩增曲线重合度良好，均呈现出典型的“S”型。

通过分析嗜酸乳杆菌NCFM作用于Caco-2细胞不同时间后免疫相关基因扩增曲线的Ct值，我们利用2-ΔΔCt法，以GAPDH扩增曲线的Ct值消除本底模板差异后，对Caco-2细胞中免疫相关基因受嗜酸乳杆菌NCFM作用后在mRNA表达水平的变化进行量化。如图6所示，除上调基因IL6ST的表达一直呈现出下降的趋势和下调基因CXCR4的表达一直呈现出增加的趋势外，随着嗜酸乳杆菌NCFM作用时间的延长，其他基因的表达均呈现出先增加后减小的规律，而且均在第4h时基因的表达出现最大值；嗜酸乳杆菌NCFM作用后，免疫相关基因的表达变化只有CCL2、CCL20、IL1α、IL1β、PTX3和TNFRSF9基因与对照组相比差异显著(p<0.05)，其中CCL2基因的表达变化在作用第4h时与对照组相比差异极显著(p<0.01)；趋化因子CCL2和CCL20基因的表达量与白细胞介素类细胞因子IL1α和IL1β的表达量相比存在一定的差异，趋化因子在嗜酸乳杆菌NCFM作用后的表达量基本上大于细胞介素类细胞因子，尤其是在作用第4小时时，表达量的差异更大。

2.5 免疫相关基因动态变化规律的体内研究

2.5.1 小鼠肠组织总RNA的质量检测

小鼠肠组织总RNA经1％琼脂糖凝胶电泳后，18s RNA和28s RNA电泳条带清晰，28s RNA条带无明显降解(见图7)，说明总RNA质量完好，可进行Real Time RT-PCR实验。

2.5.2 Real Time RT-PCR检测免疫相关基因的动态变化规律

为了进一步验证嗜酸乳杆菌NCFM作用后免疫相关基因表达的动态变化的体外研究结果，我们每天以一定浓度(3×10⁹cfu/mL)的嗜酸乳杆菌NCFM菌悬液对小鼠进行灌胃，灌胃1、3、5和7天后处死小鼠，取肠道组织，然后采用Real Time RT-PCR方法检测小鼠肠组织免疫相关基因表达的动态变化趋势，结果如图8所示，嗜酸乳杆菌NCFM灌胃后，实验组和对照组的小鼠肠组织中免疫相关基因和GAPDH基因mRNA表达的扩增曲线重合度良好，均呈现出典型的“S”型。

通过分析嗜酸乳杆菌NCFM对小鼠灌胃不同时间后免疫相关基因表达的扩增曲线Ct值，我们利用2-ΔΔCt法，以GAPDH扩增曲线的Ct值消除本底模板差异后，对小鼠肠组织中免疫相关基因受嗜酸乳杆菌NCFM作用后在mRNA表达水平的变化进行量化，结果见图9。从图中可以看出，随着嗜酸乳杆菌NCFM作用时间的延长，除下调基因CXCR4基因的表达量增加外，其他基因的表达均呈现出先增加后减小的规律，其中CCL2、CCL20、IL1α、IL1β和PTX3基因在灌胃后第5天出现最大值，而IL6ST、IL8和TNFRSF9基因表达出现峰值是在灌胃后第3天；免疫相关基因中只有CCL2、CCL20、IL1β和TNFRSF9基因的表达量与对照组相比差异显著(p<0.05)。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。