筛选高二羟基儿茶素茶树的类黄酮3′,5′‑羟化酶基因功能标记及其应用、应用方法与流程

本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及一种筛选高二羟基儿茶素茶树的类黄酮3′,5′-羟化酶基因功能标记及其应用、应用方法。
背景技术：
：儿茶素类（catechins）是茶树茶类黄酮（flavonoids）的主体成分，占绿茶干重的8-26%(Chen&Zhou,2005)，成茶的几乎所有特性如滋味、汤色和香气等都直接或间接与儿茶素有关（Wangetal.,2000）。儿茶素具有抗氧化、抗诱变、抗癌、抗心血管疾病、紫外线辐射保护作用、抗糖尿病、抗菌消炎、减肥和帕金森病的治疗等作用（夏涛和高丽萍,2009），属于黄烷-3-醇类化合。儿茶素是2-苯基苯并吡喃的衍生物，根据儿茶素B环的羟基数目、C环上2,3位同分异构体、C环上3位是否连接没食子酸等可以划分为若干种组分。根据儿茶素B环的羟基数目，儿茶素主要可以分为B环双羟基和三羟基儿茶素，其中表儿茶素(EC)和表儿茶素没食子酸酯(ECG)属于B环二羟基儿茶素，而表没食子儿茶素(EGC)和表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)属于B环三羟基儿茶素。类黄酮3′,5′-羟化酶(flavonoid3′,5′-hydroxylase，F3′5′H)是茶树黄烷-3-醇合成中的重要酶类。F3′5′H属于CYP75A亚家族，可以分别催化黄酮、黄烷酮、二氢黄酮醇和黄酮醇转化为3′,4′,5′三羟基化产物，是目前已知的细胞色素P450家族中催化B-环5′羟基化反应的唯一酶系。在红茶发酵过程中，每个茶黄素分子的形成需要1个二羟基儿茶素和1个三羟基儿茶素，因此含有等浓度的二羟基儿茶素和三羟基儿茶素的鲜叶原料最有利于形成高品质红茶。但专利申请人在2010年和2011年对403份茶树资源儿茶素组分进行了系统鉴定，发现与肯尼亚等主产红茶国家相比，我国不乏高儿茶素资源，但EGCG占儿茶素总量的比例很高，平均为59.3–61.3%（Jinetal.,2014），远高于肯尼亚（所有品种都在32%以下）（Owuor&Obanda,2007），而二羟基儿茶素ECG和EC含量较低。因此，今后我国茶树品种的改良，特别是红茶的品种选育，需要筛选和利用高二羟基儿茶素的茶树资源，进而培育高品质的红茶品种。迄今为止，国内外茶叶儿茶素含量鉴定大都采取生化测定方法。该方法需要一定数量茶树叶片，鉴定的植株需要长到3-4年后才能鉴定，耗费时间过长，效率低下。此外，鉴定植株的儿茶素含量受栽培环境和茶树树龄影响很大，需要多年、多点鉴定才能做到精准评价。随着分子生物学技术的迅速发展,分子标记辅助选择(MAS)被广泛应用于分子育种中，由于其不受环境和育种世代的影响，可以进行早期选择和预测，大大缩短了茶树育种年限。功能标记是一类基于基因特定序列开发的标记，与目标基因共分离，大大提高了选择的准确性。技术实现要素：针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种筛选高二羟基儿茶素茶树的类黄酮3′,5′-羟化酶基因功能标记及其应用、应用方法的技术方案。所述的一种筛选高二羟基儿茶素茶树的类黄酮3′,5′-羟化酶基因功能标记，其特征在于该功能标记的上游引物序列如SEQIDNo.1所示，下游引物如SEQIDNo.2所示。所述的一种筛选高二羟基儿茶素茶树的类黄酮3′,5′-羟化酶基因功能标记在筛选具有高二羟基儿茶素茶树中的应用，其特征在于该功能标记的上游引物序列如SEQIDNo.1所示，下游引物如SEQIDNo.2所示。所述的一种筛选高二羟基儿茶素茶树的类黄酮3′,5′-羟化酶基因功能标记在筛选具有高二羟基儿茶素茶树中的应用方法，其特征在于包括以下步骤：利用功能标记对各茶树材料中的F3′5′H基因起始密码子ATG下游676bp至下游871bp的DNA片段进行PCR扩增、酶切和琼脂糖凝胶分析，如扩增产物酶切后显示为196bp的片段则该茶树确定为低二羟基儿茶素茶树，如扩增产物酶切后显示为176bp的片段则该茶树确定为高二羟基儿茶素茶树。所述的应用方法，其特征在于所述的PCR扩增的体系和反应程序为：PCR反应体系：32µLddH2O，2µLDNA，5µL10×PCRBuffer，4µL25mMMgCl2，5µL2MmdNTP，1µLKOD-Plus-Neo酶，10µM的上、下游引物各3µL；PCR扩增程序为：94℃2min，然后进行以下循环，94℃15sec，58℃25sec，68℃5sec，共35个循环；最后68℃延伸2min；所述的酶切和琼脂糖凝胶条件为：PCR产物10μL，内切酶EcoRI10U，内切酶缓冲液2μL，用ddH2O补齐至20μL酶切体系；酶切反应时间为1小时，温度为37℃，扩增产物在3%的琼脂糖胶电泳分离。与现有的技术相比，本发明的优点在于：将本发明中的功能标记运用于分子标记辅助选择，能快速筛选出具有高二羟基儿茶素的茶树植物材料，从而加快优质红茶茶树品种的育成步伐。本发明对利用分子标记辅助选择高二羟基儿茶素茶树品种具有重要的理论意义和经济价值。附图说明图1是龙井43和凤凰大茶树类黄酮3′,5′-羟化酶基因F3′5′H的比对谱图；图1中：LJ43为龙井43，FFDCS为凤凰大茶树。图2是龙井43和凤凰大茶树酶切条带差异的比对谱图；图2中：M为Marker；1和2分别为龙井43的DNA用引物对1和2扩增的PCR产物经内切酶EcoRI酶切前后的条带，3和4分别为凤凰大茶树的DNA用引物对1和2扩增的PCR产物经内切酶EcoRI酶切前后的条带。图3是用功能标记dCAPS-F3′5′H对28份茶树资源SNP848的基因型检测结果；图3中：M为Marker；1-10依次为福鼎大白茶、藤茶、白石牙茶、银笋、福安大白茶、宁州厚叶种、江华甜茶、大阳茶、水古茶和木里4号，PCR产物酶切后条带大小为196bp，SNP848的基因型为AA；11-20依次为乐昌郎田苦茶、乳源柳坑1号、台山白云茶、英红1号、五岭红、乐昌尖叶白毛、罗定红芽种、锡茶10号、大叶茶群体和红河浪堤茶，PCR产物酶切后条带大小为196bp和176bp，SNP848的基因型为AG；21-28依次为凤凰大茶树、师宗5号、镇沅2号、昌宁4号、景谷老仓群体、麻栗坡8号、云茶普蕊和云县1号，PCR产物酶切后条带大小为176bp，SNP848基因型为AG。具体实施方式下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步详细的说明。下述实施例中所用的试剂，如无特殊说明，可以从常规生化试剂商店购买得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例1F3′5′H等位基因差异序列的发现、引物对及功能标记dCAPS-F3′5′H的开发1.供试材料选择龙井43和凤凰大茶树为研究材料。2.儿茶素含量测定采摘茶树春季新梢的一芽二叶，采用120℃热风干燥5min及时固样，75℃烘至足干低温保存。待测定时用机械磨碎，过40目筛后低温保存，备用。称取0.2g样品（精确到0.0001g），置于10mL离心管中。加入70℃预热的70%甲醇溶液5mL，混匀后70℃水浴。水浴10min，中间揺匀2-3次。3,500r/min离心10min，转移上清液。重复步骤2-4，合并两次收集的上清液，定容至10mL。移取2ml提取液置于容量瓶中，用稳定液（5%的10mg/mLEDTA溶液、5%的10mg/mL抗坏血酸溶液、10%的乙腈）定容至10ml，混匀后用0.45μm的滤膜过滤。采用高压液相色谱法（HPLC）进行检测，以外标法对生物碱和儿茶素进行定性和定量分析。液相色谱测定条件：C12色谱柱4.6mm×250mm(4μm，广州菲罗门)；流动相A为0.5％甲酸，流动相B为乙腈，流速1mL/min，柱温30℃，检测波长280nm，进样量10μL，梯度洗脱：流动相B在16min内由6.5％线性梯度变化到16％，第16min到20min由16％线性梯度变化到25％，保持5min，回到初始状态，再平衡5min。测定结果表明，凤凰大茶树的三羟基儿茶素含量与龙井43相当，但二羟基儿茶素含量却是龙井43的2.4倍。表12份茶树材料春茶儿茶素含量的差异（mg/g）材料名称EGCECEGCGECG三羟基儿茶素（EGC+EGCG）二羟基儿茶素（EC+ECG）儿茶素总量龙井438.25.469.232.577.437.9115.3凤凰大茶树16.322.765.968.382.291.0173.23.基因组DNA的提取取1g新鲜嫩梢，加液氮研磨至粉末状。将0.2g粉末置入1.5mL离心管，加700μLCTAB提取液，充分混匀后65℃下水浴1h，每20min揺匀一次。加入等体积氯仿/异戊醇（24：1），混匀后静置2min。室温下14,000g离心10min，取上清。加入等体积预冷的异丙醇，-20℃静置1h。14,000g离心10min，弃上清。加入300μL高盐溶液，65℃温育30min至沉淀溶解。室温下10,000g离心10min，取上清。加入1/10体积预冷的NaAc（pH5.2），2/3体积预冷的异丙醇，充分混合，-20℃放置30min。14,000g离心5min，弃上清。70%乙醇洗涤沉淀1次，无水乙醇洗涤一次。放在超净工作台上吹干30min，溶于200μL灭菌水中，-20℃保存。4.PCR测序及测序分析设计特异引物，扩增各茶树材料中的F3′5′H起始密码子ATG上游54bp至下游891bp的DNA片段，引物由软件Primer5.0设计，序列如下：上游引物（如SEQIDNo.3所示）：5′－ACCAAAACACTCAACCAGGT－3′，下游引物（如SEQIDNo.4所示）：5′－TGCCTTGATGTTGGTCGTGT－3′；PCR反应体系：32µLddH2O，2µLDNA，5µL10×PCRBuffer，4µL25mMMgCl2，5µL2MmdNTP，1µLKOD-Plus-Neo酶，10µM的正、反向引物各3µL。PCR扩增程序为：94℃2min，然后进行以下循环，94℃15sec，5325sec，68℃30sec，共35个循环；最后68℃延伸7min。PCR扩增产物在1.2%琼脂糖凝胶上进行电泳，在紫外灯下观察并切胶回收，连入载体、转化，菌液PCR筛选阳性克隆测序。分析发现两份材料间第一外显子中有3个单核苷酸突变（SNP），其中仅SNP848为非同义突变（图1）。5.功能标记dCAPS-F3′5′H的开发设计特异引物，扩增各茶树材料中的F3′5′H基因起始密码子ATG下游676bp至下游871bp的DNA片段，引物由利用dCAPSFinder2.0（http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html）设计。在下游引物3′端引入1bp的错配，序列如下：上游引物（如SEQIDNo.1所示）：5′－GATTTCATACCATCGATTGCGT－3′，下游引物（如SEQIDNo.2所示）：5′－TGAGCTTCTCTTCACCAGGAATT－3′；利用所述的引物序列分别进行PCR扩增、酶切和琼脂糖凝胶分析。PCR反应体系：32µLddH2O，2µLDNA，5µL10×PCRBuffer，4µL25mMMgCl2，5µL2MmdNTP，1µLKOD-Plus-Neo酶，10µM的正、反向引物各3µL。PCR扩增程序为：94℃2min，然后进行以下循环，94℃15sec，58℃25sec，68℃5sec，共35个循环；最后68℃延伸2min。酶切体系、时间、温度和琼脂糖凝胶电泳为：PCR产物10μL，内切酶EcoRI10U，内切酶缓冲液2μL，用ddH2O补齐至20μL；酶切反应时间为1小时，温度为37℃，扩增产物在3%的琼脂糖胶电泳分离。分析发现，龙井43的PCR产物酶切后仍条带大小仍为196bp，表明SNP848的基因型为AA，而凤凰大茶树酶切后产生了1条176bp的条带，表明SNP848的基因型为GG（图2）。利用该分子标记可以鉴定茶树资源F3′5′H基因SNP848的基因型，并可把含高二羟基儿茶素的茶树材料筛选出来。实施例2功能标记dCAPS-F3′5′H对茶树资源的基因型分析1.供试材料本实验所研究的材料列于表2中，包括28份茶树资源。表2本实验所研究的28份茶树资源及其二羟基儿茶素含量2.功能标记对不同茶树资源F3′5′H基因SNP848的基因型检测利用分子标记dCAPS-F3′5′H对28份材料的标记基因型分析。DNA提取、PCR扩增体系、程序、酶切和琼脂糖凝胶条件同实施例1。结果如图3所示，其中在材料1—10的基因型为AA，材料11—20的基因型为AG，材料21—28的基因型为GG。3.28份茶树材料儿茶素含量鉴定儿茶素鉴定方法高效液相色谱法同实施例1所述。28份材料中，基因型为AA的10份材料二羟基儿茶素含量为32.6±4.6mg/g，基因型为AG的10份材料二羟基儿茶素含量为42.0±8.9mg/g，基因型为GG的8份材料二羟基儿茶素含量为84.1±22.2mg/g。统计分析表明，GG基因型的材料二羟基儿茶素含量极显著高于其它2种基因型的材料，dCAPS-F3′5′H可以作为鉴定和筛选高二羟基儿茶素茶树材料的功能标记。本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属
技术领域：
的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。SEQUENCELISTING<110>中国农业科学院茶叶研究所<120>筛选高二羟基儿茶素茶树的类黄酮3′,5′-羟化酶基因功能标记及其应用、应用方法<130>11<160>4<170>PatentInversion3.3<210>1<211>22<212>DNA<213>人工合成<400>1gatttcataccatcgattgcgt22<210>2<211>23<212>DNA<213>人工合成<400>2tgagcttctcttcaccaggaatt23<210>3<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>3accaaaacactcaaccaggt20<210>4<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>4tgccttgatgttggtcgtgt20当前第1页1 2 3