一种嗜肺军团菌dotA基因的LAMP引物组及其试剂盒和应用的制作方法

本发明涉及微生物分子检测技术领域，更具体地，涉及一种嗜肺军团菌dotA基因的LAMP引物组及其试剂盒和应用。

背景技术：

嗜肺军团菌（Legionella pneumophila，LP）是一种革兰氏阴性杆菌，也是一种条件性致病菌及胞内病原菌。它广泛存在于天然淡水或人工水体中，是军团菌病最主要的致病原，也可引起庞蒂亚克热。1976年，美国费城召开的退伍军人大会上暴发了一场大规模感染，221人出现非典型肺炎症状，22人死亡；次年分离出致病菌株，即嗜肺军团菌。此后，军团菌病在世界各地时有暴发流行，我国也于1982年首次报道了军团菌病的临床病例。研究表明，军团菌病暴发的首要风险来自于中央空调冷却塔和供水系统，因而有人称其为“现代城市文明病”。而随着我国城市化水平的提高，空调及供水系统逐渐普及，军团菌病及其致病原值得我们的警惕和重视。

传统的嗜肺军团菌实验室检测方法有分离培养、血清抗体检测、尿抗原检测等。细菌培养法是检测嗜肺军团菌的“金标准”，但其生长所需营养丰富，耗时长，检测成本高且效率低下；血清学检测则存在滞后性，缺乏早期诊断意义；尿抗原检测对血清型1型（LP1）以外的嗜肺军团菌敏感性较低。而近年来发展起来的分子生物学技术以其快速、简便、特异、敏感等优点，已在军团菌检测及军团菌病快速诊断方面占有一席之地。其中，聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）无疑是一种相对成熟、应用广泛的方法。PCR依赖于热循环完成扩增，在实际应用中往往离不开热循环仪（即PCR仪）；而新兴的等温核酸扩增技术能够在恒温条件下完成扩增，实际应用中只需一台恒温水浴锅，应用于病原微生物的检测将更为简便高效。

2000年，Notomi T.等报道了环介导等温扩增法（Loop-mediated isothermal amplification, LAMP）。该方法可在恒温条件（60～65℃）下高效、快速地扩增DNA，且具有高特异性。LAMP利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶（Bst DNA聚合酶）及一套针对靶序列6个不同区域的4条引物（FIP、BIP、F3、B3），可在1h内实现10⁹倍的扩增。

自LAMP诞生以来，将其应用于嗜肺军团菌的检测已有少量报道；其靶标多为16S rRNA基因及巨噬细胞感染力增强因子（Macrophage Infectivity Potentiator, mip）基因等，未见以嗜肺军团菌分泌系统的基因为靶标的检测方法。嗜肺军团菌具有I型、II型、IVA型和IVB型4种分泌系统，V型分泌系统也于近期在巴黎株中被发现。其中，IVB型分泌系统（Type IVB secretion system, T4BSS）是其最主要的毒力系统，也被称为Dot（Defective Organelle Trafficking）/Icm（Intracellular Multiplication）系统。目前的研究表明，T4BSS的结构基因dotA对嗜肺军团菌至关重要，缺失dotA的嗜肺军团菌将完全丧失毒力和感染能力。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种嗜肺军团菌dotA基因的LAMP引物组。

本发明的第二个目的是提供含有所述嗜肺军团菌dotA基因的LAMP引物组的试剂盒。

本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的：

一种嗜肺军团菌dotA基因的LAMP引物组，所述引物组包含外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP、环引物LF、环引物LB，其序列如SEQ ID NO：1～6所示。

本发明还提供所述嗜肺军团菌dotA基因的LAMP引物组在制备检测嗜肺军团菌的试剂中的应用。

本发明还提供含有所述嗜肺军团菌dotA基因的LAMP引物组的试剂盒。

优选地，所述试剂盒中外引物B3的浓度为0.2μM、外引物F3的浓度为0.2μM、内引物FIP的浓度为1.6μM、内引物BIP的浓度为1.6μM、环引物LF的浓度为0.4μM、环引物LB的浓度为0.4μM。

优选地，所述试剂盒还含有DNA聚合酶、dNTP mix和反应缓冲液。

优选地，利用所述试剂盒进行LAMP反应的体系为：引物FIP、BIP各2μL，引物F3、B3各0.25μL ，引物LF、LB各0.5μL ，10×Isothermal Amplification Buffer 2.5μL，模板DNA 1μL，浓度为8000U/mL Bst DNA聚合酶1μL，浓度为100mmol/L的MgSO4 1.5μL，浓度为10mmol/L的dNTP mix 3.5μL，加入ddH2O补足25μL。

优选地，利用所述试剂盒进行LAMP反应的程序为：62℃，50min扩增，85℃，10min失活。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明通过对嗜肺军团菌IVB型分泌系统序列的比对，设计、筛选出特异性LAMP引物组，利用该引物组，只需要通过简单的LAMP扩增，可以通过观察是否出现白色沉淀来判断靶基因的存在与否；亦可加入荧光染料后在紫外光下观察是否出现荧光加以判断，不需要复杂的专用检测设备。该方法相对于常规的PCR，操作简便，特异性强，灵敏度高，可于30min内检出嗜肺军团菌，本方法具备现场检测及基层推广的应用潜力。

附图说明

图1为嗜肺军团菌A1、A2、A3引物组LAMP实时荧光定量结果图。

图2为嗜肺军团菌A1引物组LAMP产物及其BamHI酶切产物琼脂糖凝胶电泳图；NTC：阴性对照；D0：阴性对照的酶切产物；1、2：阳性结果；D1、D2：1、2阳性结果的酶切产物；M：DS 2000 marker。

图3为嗜肺军团菌A2引物组LAMP产物及其BamHI酶切产物琼脂糖凝胶电泳图；NTC：阴性对照；D0：阴性对照的酶切产物；1、2：阳性结果；D1、D2：1、2阳性结果的酶切产物；M：DS 2000 marker。

图4为嗜肺军团菌A3引物组LAMP产物及其BamHI酶切产物琼脂糖凝胶电泳图；NTC：阴性对照；D0：阴性对照的酶切产物；1、2：阳性结果；D1、D2：1、2阳性结果的酶切产物；M：DS 2000 marker。

图5为嗜肺军团菌dotA-LAMP检测法沉淀判定；左侧2管为阴性管，右侧3管为阳性管；红色箭头所指即为反应副产物焦磷酸镁沉淀。

图6为嗜肺军团菌dotA-LAMP检测法目视荧光判定；左管为阴性管，右管为阳性管。

图7为嗜肺军团菌dotA-LAMP检测法特异性试验实时荧光定量结果图；上方的大图为总图，4个小图分别为约旦军团菌、马氏军团菌、沙门氏菌及阴性对照的扩增曲线。

图8为梯度稀释模板的普通PCR产物电泳图；1～9：梯度稀释模板（192ng/μL、19.2 ng/μL、1.92 ng/μL、192 pg/μL、19.2 pg/μL、1.92 pg/μL、192 fg/μL、19.2 fg/μL、1.92 fg/μL）；NTC：阴性对照；M：DS 2000 marker。

图9为梯度稀释模板的LAMP实时荧光定量结果图。

图10为环境水样dotA-LAMP嗜肺军团菌检测结果电泳图；1：嘉禾望岗站空调系统冷却水；2：嘉禾望岗站空调系统冷冻水；3：区庄站空调系统冷却水；4：区庄站空调系统冷冻水；NTC：阴性对照；+：阳性对照Lp02；M：DS 2000 marker。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的简单修改或替换，均属于本发明的范围；若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1嗜肺军团菌的检测

（1）引物设计

以嗜肺军团菌IVB型分泌系统dotA基因（NC_002942.5）为靶标设计多组引物，分别为引物组A1、引物组A2和引物组A3，每一组的引物序列如下：

引物组A1：

外引物A1-F3：ACAAAATCTTCACCCTGC；

外引物A1-B3：CCTGATCTTAGTGATAATCCTC；

内引物A1-FIP：ACCGTTGACCTTTGCCAATCTAATCAAAATCCTGGTGCTTC；

内引物A1-BIP：CCTGGCAATTGAACCATCATGAACGACAGTCTGTGAGTG；

环引物A1-LB：TTGACAAATCCATAGACTGTTGAGG。

引物组A2：

外引物A2-F3：GATCAGGTTGCTTGACGC；

外引物A2-B3：CCAATTTGATACGGGAACAG；

内引物A2-FIP ：TGTACCTGGTTTCAAAACAAGAGTGGACCTAAAGCAGGTACGC；

内引物A2-BIP：AATGAATAGGGATCCTGACACGGTAGTTTTGATCCCACACA；

环引物A2-LF：GCTGATTCAAATCCAGTCAC；

环引物A2-LB：TTTCCAAAGGGTTTGGTAAG；

引物组A3：

外引物A3-F3：GATCAGGTTGCTTGACGC；

外引物A3-B3：CCAATTTGATACGGGAACAG；

内引物A3-FIP：TGTACCTGGTTTCAAAACAAGAGTGGACCTAAAGCAGGTACGC；

内引物A3-BIP：GAATAGGGATCCTGACACGTTTAGTAGTTTTGATCCCACACAG；

环引物A3-LF：GCTGATTCAAATCCAGTCAC；

环引物A3-LB：TTCCAAAGGGTTTGGTAAG。

（2）LAMP反应

以嗜肺军团菌L. pneumophila Philadelphia-1 Lp02的基因组DNA为阳性模板，筛选出一套特异性好、扩增速度快的引物组。反应体系共25μL，具体组分如下：

引物FIP、BIP各2μL，引物F3、B3各0.25μL，引物LF、LB各0.5μL，10×Isothermal Amplification Buffer 2.5μL，模板DNA（样品）1μL，浓度为8000U/mL Bst DNA聚合酶1μL，浓度为100mmol/L的MgSO₄ 1.5μL，浓度为10mmol/L的dNTP mix 3.5μL，100×SYBR Green I 0.25μL，加入ddH₂O补足25μL。

反应条件为：62℃1h扩增，每隔1min收集1次荧光信号；85℃10min失活。

（3）结果判读：

实时荧光定量结果如图1所示，3组引物的扩增区域均含BamHI酶切位点。A1、A2、A3的扩增产物及BamHI酶切产物电泳结果分别如图2、3和4所示。A1的阴性对照有条带，说明可能发生了非特异扩增；A2的阴性对照及其酶切产物均无条带，阳性模板的产物呈现LAMP特有的梯形条带，酶切产物也符合理论值（65bp和132bp）；A3的阴性对照及其酶切产物均无条带，但阳性模板的产物酶切后并无条带，可能出现了不正确的扩增；即引物组A2正确地扩增了目标基因。

除了根据条带判断之外，也可以采用简便的目视检测来判断反应结果。如图5所示，反应液离心后，阳性管中可见白色沉淀，阴性管则无；在反应液中加入荧光染料，如溴乙锭，在相应波长的紫外光下观察，阳性管发出明显荧光，阴性管无明显变化（如图6所示）。

实施例2 引物组A2的特异性实验

挑取沙门氏菌、约旦军团菌、马氏军团菌及嗜肺军团菌血清型3型、6型的菌落，移至50μL无菌水中，煮沸10min后，冰浴1min，13000×g离心5min，上清液即为扩增样本。然后以Lp02的基因组DNA为阳性对照，ddH₂O为阴性对照，利用实施例1所述扩增体系和方法进行扩增反应。实时荧光定量结果如图7所示。可见嗜肺军团菌Lp02、LP3、LP6均发生了扩增，约旦军团菌、马氏军团菌、沙门氏菌及阴性对照未扩增，说明利用引物组A2的特异性好。

实施例3 引物组A2的灵敏度实验

测得Lp02基因组提取原液的DNA浓度为192ng/μL。10倍倍比稀释至1.92×10^-6ng/μL，分别作为LAMP及普通PCR的模板。LAMP反应体系如实施例1所示。普通PCR反应体系共20μL，具体组分如下：

2×Taq PCR StarMix 2.5μL，引物F3、B3各1μL，模板1μL，加入ddH₂O补足20μL。反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸8s，34个循环；72℃延伸5min；12℃停止。

取10μL普通PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，结果如图8所示，产物条带为199bp。普通PCR在模板浓度为1.92×10^-3ng/μL时，电泳条带已十分微弱。LAMP实时荧光定量结果如图9所示。LAMP在模板浓度为1.92×10^-5ng/μL时仍可见明显的扩增，可见LAMP检测法的敏感性高于普通PCR。

实施例4 地铁空调水样的检测

在广州地铁嘉禾望岗站、区庄站采集了空调系统的冷却水及冷冻水。水样用0.2μm滤膜抽滤后，用1ml无菌水收集滤膜上的菌体。以环境水样浓缩、煮沸后的上清为模板，利用实施例1所述LAMP反应体系进行检测，结果如图10所示。4份水样均检测出嗜肺军团菌。

实施例5 嗜肺军团菌LAMP检测试剂盒的建立

按下列组成（终浓度）配制嗜肺军团菌LAMP检测试剂盒（利用引物组A2）：

引物组A2，1×Isothermal Amplification Buffer， Bst DNA聚合酶8U， MgSO₄ 8mM，dNTP mix 1.4mM，1×SYBR Green I（可选）。

引物组A2：

外引物A2-F3：GATCAGGTTGCTTGACGC；

外引物A2-B3：CCAATTTGATACGGGAACAG；

内引物A2-FIP ：TGTACCTGGTTTCAAAACAAGAGTGGACCTAAAGCAGGTACGC；

内引物A2-BIP：AATGAATAGGGATCCTGACACGGTAGTTTTGATCCCACACA；

环引物A2-LF：GCTGATTCAAATCCAGTCAC；

环引物A2-LB：TTTCCAAAGGGTTTGGTAAG。

SEQUENCE LISTING

<110> 华南农业大学

<120> 一种嗜肺军团菌dotA基因的LAMP引物组及其试剂盒和应用

<130>

<160> 17

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> A2-F3

<400> 1

gatcaggttg cttgacgc 18

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> A2-B3

<400> 2

ccaatttgat acgggaacag 20

<210> 3

<211> 43

<212> DNA

<213> A2-FIP

<400> 3

tgtacctggt ttcaaaacaa gagtggacct aaagcaggta cgc 43

<210> 4

<211> 41

<212> DNA

<213> A2-BIP

<400> 4

aatgaatagg gatcctgaca cggtagtttt gatcccacac a 41

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> A2-LF

<400> 5

gctgattcaa atccagtcac 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> A2-LB

<400> 6

tttccaaagg gtttggtaag 20

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> A1-F3

<400> 7

acaaaatctt caccctgc 18

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> A1-B3

<400> 8

cctgatctta gtgataatcc tc 22

<210> 9

<211> 41

<212> DNA

<213> A1-FIP

<400> 9

accgttgacc tttgccaatc taatcaaaat cctggtgctt c 41

<210> 10

<211> 39

<212> DNA

<213> A1-BIP

<400> 10

cctggcaatt gaaccatcat gaacgacagt ctgtgagtg 39

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> A1-LB

<400> 11

ttgacaaatc catagactgt tgagg 25

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> A3-F3

<400> 12

gatcaggttg cttgacgc 18

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> A3-B3

<400> 13

ccaatttgat acgggaacag 20

<210> 14

<211> 43

<212> DNA

<213> A3-FIP

<400> 14

tgtacctggt ttcaaaacaa gagtggacct aaagcaggta cgc 43

<210> 15

<211> 43

<212> DNA

<213> A3-BIP

<400> 15

gaatagggat cctgacacgt ttagtagttt tgatcccaca cag 43

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> A3-LF

<400> 16

gctgattcaa atccagtcac 20

<210> 17

<211> 19

<212> DNA

<213> A3-LB

<400> 17

ttccaaaggg tttggtaag 19