一种人原代肝细胞的分离及培养方法与流程

本发明属于现代生物技术之细胞培养技术领域，具体涉及一种人原代肝细胞的分离及培养方法。

背景技术：

肝细胞作为细胞移植治疗慢性肝衰竭的种子细胞以及作为药物筛选的靶细胞，制备和培养大规模的、高活力的肝细胞是这些研究的最基本环节。因此肝细胞的分离和培养技术正日益受到人们关注，成为当前研究的热点。

目前肝细胞的分离方法有机械分离法、螯合法和酶消化法等。机械法操作简单，但分离获得的肝细胞数量少、活性差。howard创建了胶原酶灌流法，seglen进一步将这种方法发展为两步灌流法。胶原酶灌流法得到的肝细胞数量和活性都得到提高，灌流法广泛应用于大鼠、小鼠、犬和兔等动物。但此方法对肝组织块的体积要求较大，不适用于手术切除的不规则小块人肝组织，无法满足基础研究中对人肝细胞的需求。因此，急需建立一种简单、高效的分离培养人原代肝细胞的技术。

本发明在传统灌流法的基础上采用三步针刺灌流法，旨在提供一种操作简单、高效的获得生长状态好、纯度高的人原代肝细胞的方法，建立一套完善可靠的人原代肝细胞体外培养技术。本发明为应用人肝细胞进行生物人工肝和细胞移植等研究提供技术保障。

技术实现要素：

根据上述问题，本发明提供了一种人原代肝细胞的分离及培养方法，该方法操作简单，细胞产量和成活率高，是一种较为理想的人原代肝细胞培养方法，可以满足多种生理生化实验的要求。

一种人原代肝细胞的分离及培养方法步骤包括：(1)无菌条件下切取新鲜人肝组织，4℃密封运回实验室；(2)将组织放入预冷无菌含双抗的pbs缓冲液中洗涤数次除去血液、结缔组织；(3)预热的pbs缓冲液针刺法灌洗；(4)预热的hbss缓冲液针刺法灌洗；(5)预热的gbss混合酶液针刺法灌洗；(6)剪碎组织用gbss混合酶液消化，离心，弃上清；(7)取细胞滤液用锥虫蓝染色检测细胞活性；(8)细胞计数后用完全培养基重悬接种到包被后的培养瓶，置于37℃、5％co2环境中培养；(9)细胞形态鉴定；(10)elisa法检测；(11)rt-pcr检测。

其中，步骤(2)或(3)所述的pbs缓冲液浓度为0.01m，ph为7.2～7.4。

其中，步骤(4)所用的hbss缓冲液含1％～5％的bsa以保持细胞的活性，防止酶的分解和非特异性吸附。

其中，步骤(5)所用gbss混合酶液(ph为7.2～7.4)为含0.1％～0.5％iv型胶原酶和0.1％～0.5％中性蛋白酶的溶液，灌洗时间10～30min，灌洗量40～60ml。

其中，步骤(6)所述gbss混合酶液(ph为7.2～7.4)含0.1％～0.5％iv型胶原酶和0.1％～0.5％中性蛋白酶的溶液，消化时间10～30min。

其中，步骤(8)所述完全培养基为h-dmem培养基，含10％胎牛血清，100u/ml的青霉素、100u/ml的链霉素的双抗，5μg/ml的胰岛素。

其中，步骤(8)所述的培养瓶用3～4μg/cm²的多聚赖氨酸包被，培养条件为37℃、5％co2培养箱。

有益效果

本发明建立了一种简单、高效的分离培养人原代肝细胞的方法，所得原代细胞经细胞形态学观察与鉴定：数量多、纯度高、活性好，细胞成活率达90％以上，细胞纯度达96％以上。

本发明采用三步针刺灌流法，优于机械分离法和传统的两步灌流法，获得的细胞数量多，细胞损伤性小，细胞纯度更高。对细胞的损伤降到最低，有利于肝细胞贴壁和后期生长。得到的肝细胞纯度96％以上，本发明所得肝细胞数量多、质量稳定、重复性好。

传统灌流法对肝组织块的体积要求较大，灌流不充分影响分离效果，本发明采用针刺法能够分离小体积的肝组织，所得细胞均匀牢固的贴附在培养瓶壁，增强了其成活能力。机械分离法易使细胞受损。组织块法操作简单，成本低，但细胞成活率较低。

本发明采用多聚赖氨酸包被培养瓶，细胞生长状态好，可满足人原代肝细胞实验的要求，多聚赖氨酸包被比apes包被制作更简单，更易保存，本方法经济实用，简便易行，有利于建立体外实验模型细胞，研究人肝细胞的特性，为生物人工肝、细胞移植和药物筛选等研究提供高质量的肝细胞。

附图说明

图1培养2d的人肝细胞图片(100×)

图2培养7d的人肝细胞图片(100×)

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合附图和实例对本发明进行详细说明，本发明的保护内容不限于下述实施例。

在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。

本实验所用的实验仪器与试剂如下：

外科手术器械一套，cck-8细胞计数盒(sigma，美国)，倒置显微镜(xds-1a，上海)，荧光显微镜(leica，美国)，低温离心机(td24b-ws，上海)，超低温冰箱(中科美菱)，移液枪(eppendorf，美国)，电子分析天平(sartorius，美国)，超净工作台(hj-cj-1d，上海)，co2细胞培养箱(sanyomco-17ai，日本)。

h-dmem购于hyclone公司，bsa购于sigma公司，elisa试剂盒购于rd公司，青霉素-链霉素双抗于gibco购买，胎牛血清购买于bioind公司，多聚赖氨酸购买于美国gibco公司，pbs自制(8.0gnacl、0.2gkcl、0.2gkh2po4、1.44gna2hpo4溶于1000ml去离子水中，调整ph为7.2～7.4，非特殊指出，本专利所用的pbs皆为此配方)，hbss自制(8g/lnacl，0.4g/lkcl，1g/l葡萄糖，0.06g/lkh2po4，0.0475g/lna2hpo4，调整ph为7.2～7.4，非特殊指出，本专利所用的hbss皆为此配方)，gbss自制(8g/lnacl，0.4g/lkcl，1g/l葡萄糖，0.21g/lmgcl2·6h2o，0.03g/lkh2po4，0.227g/lna2co3，0.0596g/lna2hpo4，0.225g/lcacl2·2h2o，调整ph为7.2～7.4，非特殊指出，本专利所用的gbbs皆为此配方)，iv型胶原酶和中性蛋白酶购买于德国serva公司，细胞培养瓶、离心管购于美国corning公司，锥虫蓝购买于美国biofer。

本发明提供的技术方案包括如下步骤：

1.无菌条件下切取新鲜肝组织，用pbs缓冲液(浓度为0.008～0.015m，ph为7.2～7.4)冲洗2～3次，保存在1000u/ml青霉素和1000mg/l链霉素的h-dmem培养基中，4℃密封运回实验室。

2.将组织处理器械浸泡于体积分数75％乙醇水溶液，再置于无菌操作台紫外灭菌30min，将器械取出，在无菌操作台里晾干；

3.超净台内用无菌镊取出组织，放入预冷无菌含双抗(100u/ml的青霉素，100u/ml的链霉素)pbs缓冲液(浓度为0.008～0.015m，ph为7.2～7.4)中，培养皿置于冰上洗涤除去表面的血液、坏死组织和结缔组织等；

4.超净工作台内，用10ml一次性注射器多点穿刺灌注37℃预热的pbs缓冲液(浓度为0.008～0.015m，ph为7.2～7.4)，灌洗时间15min，灌洗量50ml，肝组织由暗红色变为土黄色；

5.用10ml一次性注射器多点穿刺灌注37℃预热的含1％～5％bsa的无钙离子、镁离子hbss缓冲液(ph为7.2～7.4)，灌洗时间20min，灌洗量50ml；

6.用10ml一次性注射器多点穿刺灌注37℃预热的含0.1％～0.5％iv型胶原酶和0.1％～0.5％中性蛋白酶的gbss(ph为7.2～7.4)溶液，灌洗时间10～30min，灌洗量40-60ml，肝组织由土黄色变为灰白色；

7.用无菌眼科剪将肝组织剪成1mm×1mm×1mm的碎块，用含0.1％～0.5％iv型胶原酶和0.1％～0.5％中性蛋白酶的gbss(ph为7.2～7.4)溶液于37℃、5％co2培养箱振荡消化10～30min；

8.用10ml含10％胎牛血清、双抗(100u/ml的青霉素，100u/ml的链霉素)、4～6μg/ml胰岛素的h-dmem完全培养基(简称完全培养基)终止消化，200目筛网过滤，所得滤液40～60g离心5min；

9.去上清，底层沉淀用含dnasei的gbss(ph为7.2～7.4)缓冲液重悬肝细胞，50g离心5min，沉淀用完全培养基重悬；

10.取细胞滤液用锥虫蓝染色检测细胞活性：锥虫蓝排斥实验，吸取0.2ml细胞虑液加入0.2ml的0.4％锥虫蓝溶液，吹打均匀，然后吸取少量悬液沿细胞计数板上盖片边缘缓缓滴入，至盖片下刚好充满悬液，在倒置显微镜下观察，若细胞核未被染色则提示细胞存活，如细胞核被染蓝，提示细胞死亡，计数四个大格子细胞数(四大格细胞总数/4×10⁴)，计算细胞成活率：活细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数)×100％；

11.加入完全培养基重悬，细胞计数板计数，在细胞计数板中央放置计数专用的盖玻片，用玻璃虹吸管吸取细胞，让虹吸管在盖玻片上或下侧的计数板凹蹧处流出悬液，至盖玻片被液体充满为止，置显微镜下计数四角大方格内的细胞总数。对于压线的细胞只计数在上线和左线者，对于细胞团按单个细胞计数，细胞数/ml＝四大格细胞总数/4×10⁴；

12.计数完成后再加入培养基将细胞密度调至1×10⁵个/ml，.接种细胞至铺多聚赖氨酸包被的的培养瓶中，置于37℃、5％co2环境中培养，24h后换液，此后2～3d换液一次；

13.细胞形态及生长情况观察：倒置显微镜下观察新鲜分离的肝细胞，细胞透亮、呈球形边界清晰，多数呈单个均匀散在分布，接种2h后部分肝细胞开始贴壁，4h后镜下观察肝细胞的形态逐渐向多边形转变，可明显观察到细胞核，部分肝细胞可以看到双核甚至多核，培养24h后所有肝细胞牢固贴壁，形态扁平，呈多边形或不规则形，细胞内可见大量颗粒及少量脂滴，7d后细胞均质透明，胞体清亮，折光性好，可见双核和多核肝细胞；

14.细胞成活率测定：锥虫蓝排斥实验，吸取0.2ml原代细胞悬液加入0.2ml的0.4％锥虫蓝溶液，吹打均匀，然后吸取少量悬液沿细胞计数板上盖片边缘缓缓滴入，至盖片下刚好充满悬液，在倒置显微镜下观察，若细胞核未被染色则提示细胞存活，如细胞核被染蓝，提示细胞死亡，计数四个大格子细胞数(四大格细胞总数/4×10⁴)，计算细胞成活率：活细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数)×100％；

15.elisa法检测多点穿刺三步灌流法分离的人原代肝细胞培养上清中白蛋白的含量，白蛋白含量在第三天达到最高峰，以后逐渐下降；

16.rt-pcr检测检测原代培养的人肝细胞中albmrna和细胞色素p450酶系中的cyp2e1mrna的表达，分别在374bp和338bp处出现明亮条带。

高倍显微镜下计数300个细胞，人肝细胞纯度为96％以上。

本发明所得到的，人肝细胞数量多，细胞成活率达90％以上，细胞纯度达96％以上，为生物人工肝、细胞移植和药物筛选等研究提供高质量的细胞资源。

以上所述，仅为本发明较佳的实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此实施实例。任何在本发明的精神和原则之内作出任何修改，等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围内。