本发明属于基因工程领域，具体的说是涉及一种应用于厌氧菌和兼性厌氧菌筛选阳性克隆菌株的方法。
技术背景
基因工程或重组dna技术是指对遗传信息的分子操作和施工，即把分离到的或合成的基因经过改造，插入载体中，导入宿主细胞内，使其扩增和表达，从而获得大量基因产物，或者令生物表现出新的性状。基因工程这个术语用来表示特定基因操作，也可泛指它所涉及的技术系统，其核心是构建重组体dna的技术。
基因工程里，质粒转化进微生物是其中一种常用的技术。在质粒转化进微生物的实验操作过程中对阳性克隆菌株的筛选是其中的必经步骤。目前，常用的筛选方法有抗生素筛选、蓝白斑筛选、菌落pcr筛选等方法。这些筛选方法各有优缺点，比如抗生素筛选，不同的微生物宿主，其抗生素耐受性不同，会出现不同程度的假阳性，需要挑选多个克隆进行验证；蓝白斑因为其特殊性，对菌株、质粒等选择有一定限制；菌落pcr筛选，需要耗费较多的昂贵试剂。
厌氧菌是一类在无氧条件下比在有氧环境中生长好的细菌，而不能在空气（18%氧气）和（或）10%二氧化碳浓度下的固体培养基表面生长的细菌。这类细菌缺乏完整的代谢酶体系，其能量代谢以无氧发酵的方式进行。厌氧菌和大多数兼性厌氧菌不含过氧化氢酶(catalase)而无法降解过氧化氢，通常也无法破坏超氧化基团。
过氧化氢酶可以催化h2o2分解为h2o与o2，随之伴随的就是o2在液体h2o2里产生以气泡的现象呈现出来。也就是说当把h2o2滴加到不含过氧化氢酶的厌氧菌或兼性厌氧菌时，不会有气泡产生。
技术实现要素：
本发明的目的是：设计一种应用于厌氧菌和兼性厌氧菌筛选阳性克隆菌株的方法，在转入厌氧菌或兼性厌氧菌的质粒上携带表达过氧化氢酶的基因，在转化成功的菌落上滴加h2o2会产生气泡的现象来判断阳性菌株，方法简单，速度快捷。
本发明的技术解决方案是该应用于厌氧菌和兼性厌氧菌筛选阳性克隆菌株的方法包括如下具体步骤：
第一步是从escherichiacolidh5α提取catalase基因：escherichiacolidh5α菌株培养使用lb培养基，37℃试管振荡摇床培养至od660为0.6，提取菌全基因放置-20℃冰箱保存备用；escherichiacolidh5α菌株有二种catalase基因，一种为锰过氧化氢酶（mn-dependentcatalase），另一种为heme过氧化氢酶（heme-dependentcatalase）；根据escherichiacolidh5α的heme过氧化氢酶基因序列设计上下游引物提取heme过氧化氢酶基因放置-20℃冰箱保存备用；
第二步是从bifidobacteriumlongumatcc15707提取启动子和终止子基因：bifidobacteriumlongumatcc15707菌株培养使用mrs培养基，37℃螺口厌氧试管静置培养od660为0.6，提取菌全基因放置-20℃冰箱保存备用；根据bifidobacteriumlongum的hup基因启动子和终止子序列设计上下游引物提取hup启动子和终止子基因放置-20℃冰箱保存备用；
第三步是catalase表达序列组装进pkkt427质粒：把bifidobacteriumlongum的hup启动子和终止子与escherichiacoli的heme-catalase基因组装成表达序列hpcatht连接进bifidobacterium-e.coli穿梭质粒pkkt427，形成新的具有表达heme-catalase基因的质粒pkkt-cat；
第四步是质粒pkkt-cat转化进bifidobacteriumlongum：制备bifidobacteriumlongum感受态细胞后，pkkt-cat电转化进bifidobacteriumlongum，电转化条件为：使用2mm电转盒，12.5kv/cm，200ω，电转时间在3.9~4.2ms；转化稀释10到10000倍涂布于含有10µmhemin的带质粒抗生素抗性的mrs培养皿后bifidobacteriumlongum放入厌氧袋37℃培养1-2天至菌落出现，选用菌落在10~50的培养皿进行阳性克隆验证；
第五步是bifidobacteriumlongum阳性克隆验证：灭菌制备好mrs液体培养基螺口厌氧试管和牙签，用灭菌好的牙签挑取培养皿上的克隆至螺口厌氧试管，做好相应标记；随后在挑取后的培养皿上对应菌落滴加h2o2，有泡沫出现的即为阳性克隆；相对应的螺口厌氧试管进行37℃静置培养后做菌株保存或质粒提取后续相关工作；
第六步是携带目的基因转化进bifidobacteriumlongum阳性克隆快速验证：把目的基因连接与hpcatht序列连接后与质粒pkkt427进行连接并转化进bifidobacteriumlongum后，重复步骤5进行阳性克隆验证。
本发明的优点是：利用在转入厌氧菌或兼性厌氧菌的质粒上携带表达过氧化氢酶catalase基因，在菌落上滴加h2o2，转化成功的菌株会产生气泡的现象来判断阳性克隆菌株，前面的步骤1-5为开始的准备工作，是一次性的准备工作，其后对于同一个菌株操作不同的目的基因只需要重复步骤6即可，快速简易，效果显著。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本发明的技术方案，以兼性厌氧菌bifidobacteriumlongumatcc15707为转化菌株，escherichiacolidh5α为过氧化氢酶catalase基因提供菌株为例说明。
实施例1：筛选escherichiacolidh5α中的sod超氧化物歧化酶目的基因进bifidobacteriumadolescentisatcc15703的阳性克隆
1）从escherichiacolidh5α分别提取catalase和sod基因：escherichiacolidh5α菌株培养，使用lb培养基，37℃试管振荡摇床培养至od660约0.6，提取菌全基因放置-20℃冰箱保存备用；根据escherichiacolidh5α的heme过氧化氢酶基因序列设计上下游引物提取heme过氧化氢酶基因放置-20℃冰箱保存备用；根据escherichiacolidh5α的sod超氧化物歧化酶基因序列设计上下游引物提取sod过氧化氢酶基因放置-20℃冰箱保存备用；
2）从bifidobacteriumlongumatcc15707提取启动子和终止子基因：bifidobacteriumlongumatcc15707菌株培养，使用mrs培养基，37℃螺口厌氧试管静置培养od660约0.6，提取菌全基因放置-20℃冰箱保存备用；根据bifidobacteriumlongum的hup基因启动子和终止子序列设计上下游引物提取hup启动子和终止子基因放置-20℃冰箱保存备用；
3）catalase表达序列组装进pkkt427质粒：把bifidobacteriumlongum的hup启动子和终止子与e.coli的heme-catalase基因组装成表达序列hpcatht与sod基因连接后转进bifidobacterium-e.coli穿梭质粒pkkt427，形成新的质粒pkkt-csod；
4）质粒pkkt-csod转化进bifidobacteriumadolescentisatcc15703：制备bifidobacteriumadolescentis感受态细胞后，pkkt-csod电转化进bifidobacteriumadolescentis，电转化条件为：使用2mm电转盒，12.5kv/cm，200ω，电转时间在3.9ms；转化稀释10倍涂布于含有10µmhemin的带质粒抗生素抗性的mrs培养皿后bifidobacteriumadolescentis放入厌氧袋37℃培养2天至菌落出现，选用菌落在50的培养皿进行阳性克隆验证；
5）bifidobacteriumadolescentis阳性克隆验证：灭菌制备好mrs液体培养基螺口厌氧试管和牙签；用灭菌好的牙签挑取培养皿上的克隆至螺口厌氧试管，做好相应标记；随后在挑取后的培养皿上对应菌落滴加h2o2，有泡沫出现的即为阳性克隆；相对应螺口厌氧试管进行37℃静置培养后做菌株保存或质粒提取后续相关工作。
实施例2：筛选escherichiacolidh5α中的sod目的基因进lacterbaillusacidophilusatcc4356的阳性克隆
1）从escherichiacolidh5α分别提取catalase和sod基因：escherichiacolidh5α菌株培养，使用lb培养基，37℃试管振荡摇床培养至od660约0.6，提取菌全基因放置-20℃冰箱保存备用；根据escherichiacolidh5α的heme过氧化氢酶基因序列设计上下游引物提取heme过氧化氢酶基因放置-20℃冰箱保存备用；根据escherichiacolidh5α的sod超氧化物歧化酶基因序列设计上下游引物提取sod过氧化氢酶基因放置-20℃冰箱保存备用；
2）从lacterbaillusacidophilusatcc4356提取启动子和终止子基因：lacterbaillusacidophilusatcc4356菌株培养，使用mrs培养基，37℃螺口厌氧试管静置培养od660约0.6，提取菌全基因放置-20℃冰箱保存备用；根据lacterbaillusacidophilus的hup基因启动子和终止子序列设计上下游引物提取hup启动子和终止子基因放置-20℃冰箱保存备用；
3）catalase表达序列组装进pnz8148质粒：把lacterbaillusacidophilus的hup启动子和终止子与e.coli的heme-catalase基因组装成表达序列hpkatht与sod基因连接后转进lacterbaillus-e.coli穿梭质粒pnz8148，形成新的质粒pnz-ksod；
4）质粒pnz-ksod转化进lacterbaillusacidophilusatcc4356：制备lacterbaillusacidophilus感受态细胞后，pnz-ksod电转化进lacterbaillusacidophilus，电转化条件为：使用2mm电转盒，12.5kv/cm，200ω，电转时间在4.2ms；转化稀释10000倍涂布于含有10µmhemin的带质粒抗生素抗性的mrs培养皿后lacterbaillusacidophilus放入厌氧袋37℃培养1天至菌落出现，选用菌落在10的培养皿进行阳性克隆验证；
5）lacterbaillusacidophilus阳性克隆验证：灭菌制备好mrs液体培养基螺口厌氧试管和牙签；用灭菌好的牙签挑取培养皿上的克隆至螺口厌氧试管，做好相应标记；随后在挑取后的培养皿上对应菌落滴加h2o2，有泡沫出现的即为阳性克隆；相对应的螺口厌氧试管进行37℃静置培养后做菌株保存或质粒提取后续相关工作。
实施例3：筛选escherichiacolidh5α中的sod超氧化物歧化酶目的基因进bifidobacteriumadolescentisatcc15703的阳性克隆
1）从escherichiacolidh5α分别提取catalase和sod基因：escherichiacolidh5α菌株培养，使用lb培养基，37℃试管振荡摇床培养至od660约0.6，提取菌全基因放置-20℃冰箱保存备用；根据escherichiacolidh5α的heme过氧化氢酶基因序列设计上下游引物提取heme过氧化氢酶基因放置-20℃冰箱保存备用；根据escherichiacolidh5α的sod超氧化物歧化酶基因序列设计上下游引物提取sod过氧化氢酶基因放置-20℃冰箱保存备用；
2）从bifidobacteriumlongumatcc15707提取启动子和终止子基因：bifidobacteriumlongumatcc15707菌株培养，使用mrs培养基，37℃螺口厌氧试管静置培养od660约0.6，提取菌全基因放置-20℃冰箱保存备用；根据bifidobacteriumlongum的hup基因启动子和终止子序列设计上下游引物提取hup启动子和终止子基因放置-20℃冰箱保存备用；
3）catalase表达序列组装进pkkt427质粒：把bifidobacteriumlongum的hup启动子和终止子与e.coli的heme-catalase基因组装成表达序列hpcatht与sod基因连接后转进bifidobacterium-e.coli穿梭质粒pkkt427，形成新的质粒pkkt-csod；
4）质粒pkkt-csod转化进bifidobacteriumadolescentisatcc15703：制备bifidobacteriumadolescentis感受态细胞后，pkkt-csod电转化进bifidobacteriumadolescentis，电转化条件为：使用2mm电转盒，12.5kv/cm，200ω，电转时间在4.0ms；转化稀释5000倍涂布于含有10µmhemin的带质粒抗生素抗性的mrs培养皿后bifidobacteriumadolescentis放入厌氧袋37℃培养1.5天至菌落出现，选用菌落在30的培养皿进行阳性克隆验证；
5）bifidobacteriumlongum阳性克隆验证：灭菌制备好mrs液体培养基螺口厌氧试管和牙签；用灭菌好的牙签挑取培养皿上的克隆至螺口厌氧试管，做好相应标记；随后在挑取后的培养皿上对应菌落滴加h2o2，有泡沫出现的即为阳性克隆；相对应螺口厌氧试管进行37℃静置培养后做菌株保存或质粒提取等后续相关工作。