羟基磷灰石辅助过滤制备和厚朴酚与厚朴酚混合物的方法与流程

本发明属于生物医药领域，具体涉及羟基磷灰石辅助过滤制备和厚朴酚与厚朴酚混合物的方法。

背景技术：

厚朴是我国传统的一种中药材，其具有行气消胀，温中燥湿，降逆平喘等功效。研究表明厚朴中的有效成分是厚朴酚与和厚朴酚，因其互为异构体分离难度大；文献报道二者除了抗菌作用外，还具有抗炎、抗焦虑、抗抑郁、抗肿瘤、抗衰老和心肌保护作用；此外，还有明显的、持久的中枢性肌肉松弛和中枢神经抑制作用；近期有药效学研究证实，厚朴酚与和厚朴酚还显示出降血糖活性。

厚朴为常用中药，来源于木兰科木兰属植物厚朴，常见为厚朴(原亚种)M.officinalis subsp.officinalis与凹叶厚朴(亚种)M.officinalis subsp.biloba两种，主产于四川、湖北等地。中药材中专指该植物的干燥干皮、根皮及枝皮。

目前市面上厚朴提取工艺一般为普通的碱提酸沉，再用乙醇萃取；或直接用乙醇浸提后浓缩干燥。在现有的碱提酸沉条件下，和厚朴酚与厚朴酚能被碱性溶液(如氢氧化钠或氢氧化钙)溶解并在酸性条件下形成沉淀；但该沉淀较小，无法采用常规方式截留，一般都是使用萃取的方式得到浸膏。然而，上述这种方式的有机溶剂用量大，后续处理麻烦，且用乙醇提取后，因为乙醇对许多物质的溶解性比较好，提取的过程中会引入大量的杂质，加重后续纯化的负担。所以，上述的提取方式对于工业生产都有一定的困难，很难做到规模化的和厚朴酚与厚朴酚的生产。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是有机溶剂用量大，后续处理麻烦，乙醇提取过程中会引入大量的杂质，加重后续纯化的负担。

发明解决上述技术问题的方案是提供一种羟基磷灰石辅助过滤制备和厚朴酚与厚朴酚混合物的方法。本发明采用碱提酸沉的方式，在碱提过程中，使用氧化钙提取和厚朴酚与厚朴酚；再使用磷酸进行沉淀，进一步在碱的调节下使形成的羟基磷灰石沉淀能包裹和厚朴酚与厚朴酚，使沉淀的粒径大，易于沉淀，且羟基磷灰石沉淀无毒，性质稳定，能够被滤布截留，便于工业生产。

上述羟基磷灰石辅助过滤制备和厚朴酚与厚朴酚混合物的方法，包括以下步骤：

1)将厚朴粉碎，过2～5目筛，得到厚朴碎片；

2)在厚朴碎片中加入水和氧化钙，在25～100℃下提取3～4次，过滤后得碱提液；

3)在碱提液中加入磷酸，将pH调节至2～3，然后加入碱将pH调节至3～6，搅拌，静置，过滤，用水将滤饼洗至中性；

4)将上述洗至中性的滤饼用有机溶剂加热提取2～4次，收集提取液，提取液除去有机溶剂后干燥，得到和厚朴酚与厚朴酚混合物。

上述羟基磷灰石辅助过滤制备和厚朴酚与厚朴酚混合物的方法中，步骤2)所述水的用量为厚朴碎片质量的5～15倍。

上述羟基磷灰石辅助过滤制备和厚朴酚与厚朴酚混合物的方法中，步骤2)所述氧化钙的用量为厚朴碎片质量的0.1～0.01倍。

上述羟基磷灰石辅助过滤制备和厚朴酚与厚朴酚混合物的方法中，步骤2)所述提取的时间为2～24h。

上述羟基磷灰石辅助过滤制备和厚朴酚与厚朴酚混合物的方法中，步骤3)所述的碱为氢氧化钠水溶液、氢氧化钾水溶液或饱和氢氧化钙水溶液中的任意一种。所述氢氧化钠水溶液或氢氧化钾水溶液的浓度为2～8mol/L。

上述羟基磷灰石辅助过滤制备和厚朴酚与厚朴酚混合物的方法中，步骤3)所述搅拌时间为0.5～2h；所述的静置，是指静置至不再有明显的沉淀下降。

上述羟基磷灰石辅助过滤制备和厚朴酚与厚朴酚混合物的方法中，步骤4)所述的有机溶剂为乙醇、乙酸乙酯、二氯甲烷或丙酮中的任意一种。所述乙醇的质量浓度为70～100％。

上述羟基磷灰石辅助过滤制备和厚朴酚与厚朴酚混合物的方法中，步骤4)所述有机溶剂的体积为滤饼质量的5～10倍。

上述羟基磷灰石辅助过滤制备和厚朴酚与厚朴酚混合物的方法中，步骤4)所述加热提取的温度为60～90℃；所述加热提取的时间为0.5～3h。

本发明的有益效果在于：本发明提供的方法极大地提高了目标化合物的提取效率，大量减少了杂质的存在，极大地提高了厚朴酚及和厚朴酚在浸膏中的含量，提取物中厚朴酚及和厚朴酚含量大于90％。同时，在提取过程中，引入无害的助滤剂(羟基磷灰石)，能够极大的简化过滤过程，最大化保留目标化合物。本发明方法工艺设备简单、生产周期短、投资规模小、对环境污染减到最小、制备成本低，得到的提取物中和厚朴酚与厚朴酚的含量高，操作简单方便，适用于工业化大生产。

附图说明

图1本发明提供的羟基磷灰石辅助过滤制备和厚朴酚与厚朴酚混合物的方法工艺流程图。

图2乙醇提取(A)和本发明方法提取(B)的和厚朴酚与厚朴酚混合物相色谱图对比。采用waters的反相色谱柱(Sunfire 4.6×150，5μm)对乙醇提取物和碱提酸沉的样品进行HPLC分析，流动相为乙腈/水，65/35；色谱柱温度为25℃；流速为1mL/min；从图中可以看到，在保留时间1～4min内，乙醇提取物较本发明方法提取的和厚朴酚与厚朴酚混合物含有更多的杂质。

具体实施方式

羟基磷灰石辅助过滤制备和厚朴酚与厚朴酚混合物的方法，包括以下步骤：

1)将厚朴粉碎，过2～5目筛，得到厚朴碎片；

2)在厚朴碎片中加入水和氧化钙，在25～100℃下提取3～4次，过滤后得碱提液；

3)在碱提液中加入磷酸，将pH调节至2～3，然后加入碱将pH调节至3～6，搅拌，静置，过滤，用水将滤饼洗至中性；

4)将上述洗至中性的滤饼用有机溶剂加热提取2～4次，收集提取液，提取液除去有机溶剂后干燥，得到和厚朴酚与厚朴酚混合物。

上述羟基磷灰石辅助过滤制备和厚朴酚与厚朴酚混合物的方法中，步骤2)所述水的用量为厚朴碎片质量的5～15倍。

上述羟基磷灰石辅助过滤制备和厚朴酚与厚朴酚混合物的方法中，步骤2)所述氧化钙的用量为厚朴碎片质量的0.1～0.01倍。

上述羟基磷灰石辅助过滤制备和厚朴酚与厚朴酚混合物的方法中，步骤2)所述提取的时间为2～24h。

上述羟基磷灰石辅助过滤制备和厚朴酚与厚朴酚混合物的方法中，步骤3)所述的碱为氢氧化钠水溶液、氢氧化钾水溶液或饱和氢氧化钙水溶液中的任意一种。所述氢氧化钠水溶液或氢氧化钾水溶液的浓度为2～8mol/L。

上述羟基磷灰石辅助过滤制备和厚朴酚与厚朴酚混合物的方法中，步骤3)所述搅拌时间为0.5～2h；所述的静置，是指静置至不再有明显的沉淀下降。

上述羟基磷灰石辅助过滤制备和厚朴酚与厚朴酚混合物的方法中，步骤4)所述的有机溶剂为乙醇、乙酸乙酯、二氯甲烷或丙酮中的任意一种。所述乙醇的质量浓度为70～100％。

上述羟基磷灰石辅助过滤制备和厚朴酚与厚朴酚混合物的方法中，步骤4)所述有机溶剂的体积为滤饼质量的5～10倍。即为滤饼1g，用5～10L的溶剂量进行提取。

上述羟基磷灰石辅助过滤制备和厚朴酚与厚朴酚混合物的方法中，步骤4)所述加热提取的温度为60～90℃；所述加热提取的时间为0.5～3h。

本发明提供的方法中，使用CaO进行碱提取，提取液中主要含有离子状态的和厚朴酚、厚朴酚以及大量的Ca²⁺和OH^-离子。当加入磷酸进行酸化时，和厚朴酚、厚朴酚析出形成颗粒微小的沉淀，同时Ca²⁺和PO4^3-结合，生成不溶于水的Ca3(PO4)2沉淀：

3Ca²⁺+2PO4^3-＝Ca3(PO4)2↓。

Ca3(PO4)2沉淀颗粒颗粒比和厚朴酚、厚朴酚更大，能够部分为滤纸保留，同时能够部分吸附和厚朴酚、厚朴酚，起到助滤作用。但是Ca3(PO4)2沉淀不稳定，其存在形态易受pH值影响，当继续加入磷酸时，Ca3(PO4)2沉淀会溶解，而使提取液显浑浊状而无明显沉淀：

Ca3(PO4)2+H3PO4＝3CaHPO4；

CaHPO4+H3PO4＝Ca(H2PO4)2。

缓慢加入碱液调节提取液pH＝3～6，待沉淀析出完全。这个过程中，再在提取液中加入碱液，新的OH^-离子能够与溶液中的HPO4^2-和H2PO4^-离子逐步生成热力学稳定的羟基磷灰石(Ca5(PO4)3(OH)，hydroxy apatite，HA)。首先形成HA晶核，然后晶核慢慢长大经缺陷型成长为完整的晶体物质，HA沉淀稳定，颗粒较大，不溶于水和碱，微溶于酸，有良好的吸附作用，并提供助滤效果。同时由于HA为溶液内部反应生成，因此少量即可完全吸附提取液中的和厚朴酚、厚朴酚。HA还是一种内源性物质，无毒，生物相容性高。

整个反应的方程式如下：

5Ca(OH)2+3H3PO4＝Ca5(PO4)3(OH)↓+9H2O。

实施例1

1)厚朴饮片粉碎，过2～5目筛。

2)厚朴粗粉50g，加入250mL水，加入氧化钙2.5g，搅拌，常温提取3h，过滤，提取3次后，滤液合并。

3)加入磷酸调节pH至3，后加入3mol/L的氢氧化钠调节pH至4.8，静置1小时，过滤，滤饼用水洗至中性，真空干燥过夜。

4)用滤饼质量的10倍体积的体积乙酸乙酯提取滤饼三次，合并乙酸乙酯提取液，后浓缩干燥，至于真空干燥箱中干燥过夜，得到和厚朴酚与厚朴酚混合物。取样，用HPLC检测。

表1中的出膏率为粗提物重量/厚朴粗粉的重量，即1.18/50＝2.37％。下同。

表1

以上厚朴酚及和厚朴酚检测都经过标准品对比鉴定。

实施例2

1)厚朴饮片粉碎，过2～5目筛。

2)厚朴粗粉50g，加入500mL水，加入氧化钙5g，搅拌，煮沸3h，过滤，提取3次后，滤液合并。

3)加入稀磷酸调节pH至2.5，后加入5mol/L的氢氧化钠调节pH至5.5，静置1小时，过滤，滤饼用水洗至中性，真空干燥过夜。

4)用滤饼质量的10倍体积的70％乙醇提取滤饼三次，合并乙醇提取液，后浓缩干燥，至于真空干燥箱中干燥过夜，得到和厚朴酚与厚朴酚混合物。取样，用HPLC检测，计算提取率。

表2

以上厚朴酚及和厚朴酚检测都经过标准品对比鉴定。

实施例3

1)厚朴饮片粉碎，过2～5目筛。

2)厚朴粗粉50g，加入750mL水，加入氧化钙1g，搅拌，煮沸6h，过滤，提取3次后，滤液合并。

3)加入稀磷酸调节pH至2.9，后加入饱和氢氧化钙调节pH至5.9，静置1小时，过滤，滤饼用水洗至中性，真空干燥过夜。

4)用滤饼质量的10倍体积的无水乙醇提取滤饼三次，合并乙醇提取液，后浓缩干燥，至于真空干燥箱中干燥过夜，得到和厚朴酚与厚朴酚混合物。取样，用HPLC检测。

表3

以上厚朴酚及和厚朴酚检测都经过标准品对比鉴定。

实施例4

1)厚朴饮片粉碎，过2～5目筛。

2)厚朴粗粉50g，加入250mL水，加入氧化钙0.75g，搅拌，室温静置24h，过滤，提取3次后，滤液合并。

3)加入稀磷酸调节pH至2.3，后加入3mol/L的氢氧化钾调节pH至5.3，静置1小时，过滤，滤饼用水洗至中性，真空干燥过夜。

4)用滤饼质量的8倍体积的70％乙醇提取滤饼三次，合并乙醇提取液，后浓缩干燥，至于真空干燥箱中干燥过夜，得到和厚朴酚与厚朴酚混合物。取样，用HPLC检测。

表4

以上厚朴酚及和厚朴酚检测都经过标准品对比鉴定。

实施例5

1)厚朴饮片粉碎，过2～5目筛。

2)厚朴粗粉50g，加入750mL水，加入氧化钙1.5g，搅拌，煮沸6h，过滤，提取3次后，滤液合并。

3)加入稀磷酸调节pH至2.5，后加入饱和的氢氧化钙调节pH至6.0，静置1小时，过滤，滤饼用水洗至中性，真空干燥过夜。

4)用滤饼质量的10倍体积的乙酸乙酯提取滤饼三次，合并乙酸乙酯提取液，后浓缩干燥，至于真空干燥箱中干燥过夜，得到和厚朴酚与厚朴酚混合物。取样，用HPLC检测。

表5

以上厚朴酚及和厚朴酚检测都经过标准品对比鉴定。

实施例6

1)厚朴饮片粉碎，过2～5目筛。

2)厚朴粗粉50g，加入550mL水，加入氧化钙4g，搅拌，煮沸3h，过滤，提取3次后，滤液合并。

3)加入稀磷酸调节pH至2.0，后加入8mol/L的氢氧化钠调节pH至5.7，静置1小时，过滤，滤饼用水洗至中性，真空干燥过夜。

4)用滤饼质量的10倍体积的无水乙醇提取滤饼三次，合并乙醇提取液，后浓缩干燥，至于真空干燥箱中干燥过夜，得到和厚朴酚与厚朴酚混合物。取样，用HPLC检测。

表6

以上厚朴酚及和厚朴酚检测都经过标准品对比鉴定。

本发明提供的方法极大地提高了目标化合物的提取效率，大量减少了杂质的存在，极大地提高了厚朴酚及和厚朴酚在浸膏中的含量，提取物中厚朴酚及和厚朴酚含量大于90％。