尼达尼布的潜在杂质化合物、制备方法、应用及其检测方法与流程

本发明涉及药物化学领域，具体涉及一种尼达尼布的潜在杂质化合物、制备方法、应用及其检测方法。

技术背景

尼达尼布乙磺酸盐(NintedanibEsylate)由勃林格殷格翰(BoehringerIngelheim)研发，于2014年10月15日获美国食品药品管理局(FDA)批准上市，后于2014年11月21日获得欧洲药物管理局(EMA)批准上市，再之后又于2015年7月3日获日本药品与医疗器械管理局(PMDA)批准上市，由勃林格殷格翰上市销售。

NintedanibEsylate是一种多重酪氨酸激酶抑制剂，通过抑制与特发性肺纤维化(IPF)的发病机制相关的生长因子受体而起作用。先后获批治疗特发性肺纤维化(IPF)和非小细胞肺癌(NSCLC)。

在中国尚未上市，2016年7月6日勃林格殷格翰的尼达尼布软胶囊被药品审评中心(CDE)纳入新一批拟优先审评的药品清单。

在药物质量控制中，活性物质含量和有关物质是非常关键的一环，其杂质主要来源于合成过程和降解。

目前，国内外文献中均无该杂质的公开报道。

技术实现要素：

本发明的目的提供了一种尼达尼布的潜在杂质化合物、制备方法、应用及其检测方法，能够通过该杂质的研究来提高尼达尼布质量标准，为尼达尼布的安全用药提供保证。本发明通过合成，制备得到较纯的尼达尼布杂质化合物，为尼达尼布成品检测提供定性及定量分析的对照品。

本发明所述的一种尼达尼布的潜在杂质化合物，其结构如下：

尼达尼布的潜在杂质化合物的制备方法如下：

所述杂质化合物由与N‐甲基哌嗪反应，或由与N‐甲基哌嗪反应后在碱性条件下脱保护生成杂质化合物，再经过后处理、纯化得到产品；其中R为乙酰基或氯乙酰基。

其中，(1)与N-甲基哌嗪反应式为：

(2)与N-甲基哌嗪反应式为：

所述化合物其中

-R为-H时，化合物为3-[甲氧基(苯基)亚甲基]-2-氧代二氢吲哚-6-甲酸甲基酯；

-R为乙酰基时，化合物为N-乙酰基-3-[甲氧基(苯基)亚甲基]-2-氧代二氢吲哚-6-甲酸甲基酯；

-R氯乙酰基时，化合物为N-氯乙酰基-3-[甲氧基(苯基)亚甲基]-2-氧代二氢吲哚-6-甲酸甲基酯。

脱保护的碱性条件由添加哌啶或KOH来实现。

所述反应溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇和N,N‐二甲基甲酰胺中的一种或几种混合；

所述反应在60℃‐80℃温度下进行加热；

所述后处理为直接析出或以二氯甲烷萃取，以再以水洗涤后在醇类溶剂中析出。

反应溶剂为甲醇、乙醇和异丙醇的一种或几种混合时，产物直接析出。当反应溶剂为N,N-二甲基甲酰胺或N,N-二甲基甲酰胺与醇类溶剂的混合时，产物直接析出。或以二氯甲烷萃取，并以水洗涤后再在醇类溶剂中析出，所述醇类溶剂指甲醇、乙醇或异丙醇。

纯化方式为重结晶；

后处理所用的醇类溶剂为甲醇、乙醇或异丙醇。

所述重结晶为以醇类溶剂或醇类溶剂加有机不良溶剂结晶的方法进行纯化；

所述重结晶所用醇类溶剂为甲醇、乙醇或异丙醇；所述有机不良溶剂为二氯甲烷或乙酸乙酯。

尼达尼布的潜在杂质化合物在尼达尼布或乙磺酸尼达尼布制备过程中控制所述杂质化合物的含量不高于0.1％。

所述的尼达尼布的潜在杂质化合物的检测方法，采用高效液相色谱法，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为磷酸二氢钾溶液和乙腈，进行梯度洗脱，检测波长为245nm。

取尼达尼布，流动相A‐流动相B的质量比为45:55，超声使溶解并稀释成0.4mg/ml的供试品溶液。

取杂质化合物，流动相A‐流动相B的质量比为45:55，超声使溶解并稀释成20μg/ml的对照品溶液。

本发明所得到的杂质化合物，其纯度大于95％，满足作为杂质对照品的要求，用作杂质定性及定量研究。重结晶纯化后其纯度不低于99％。

通过控制尼达尼布反应条件与纯化，对尼达尼布进一步精制，使该杂质含量降低至检测限以下，即未检出该杂质，精制方法包括采用醇、醇/水、丙酮/水、DMSO/醇重结晶的方式，其中醇类为甲醇、乙醇、异丙醇或叔丁醇。

本发明一种尼达尼布中杂质化合物的检测方法，具体方法为：

取尼达尼布，流动相A‐流动相B的质量比为45:55，超声使溶解并稀释成0.4mg/ml的供试品溶液。

取杂质化合物，流动相A‐流动相B的质量比为45:55，超声使溶解并稀释成20μg/ml的对照品溶液。

按照高效液相色谱法(中国药典2015年版四部通则0512)试验，色谱条件为：

(1)色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶。

(2)流动相：流动相A为20mmol/L磷酸二氢钾溶液(磷酸调pH值至3.0)，流动相B为乙腈，进行梯度洗脱；0-35min，流动相A 45％，流动相B 55％；35-50min，流动相A 30％，流动相B 70％；50min-60，流动相A 25％，流动相B 75％；

(3)流速：1ml/min。

(4)检测波长：245nm。

(5)柱温：30℃。

(6)进样量：20μl。

本发明所涉及尼达尼布及该杂质的含量与纯度以高效液相色谱法测定，按外标法以峰面积计算得到。

本发明在对尼达尼布质量研究中，发现了尼达尼布的合成过程中一个潜在的相关杂质，其来源于前合成步骤中N-甲基哌嗪的残留，在后续步骤中反应，产生本发明所述杂质化合物。通过控制相应杂质限度来获得高纯度的尼达尼布，满足药用需要。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明尼达尼布的潜在杂质化合物、制备方法、应用及其检测方法，通过该杂质的研究来提高尼达尼布质量标准，为尼达尼布的安全用药提供保证。本发明通过合成，制备得到较纯的尼达尼布杂质化合物，为尼达尼布成品检测提供定性及定量分析的对照品。

附图说明

图1杂质化合物的MS测试结果。

图2杂质化合物的H-NMR测试结果。

图3杂质化合物的C-NMR测试结果。

图4杂质化合物的HPLC测试结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明。

实施例1

将3-[甲氧基(苯基)亚甲基]-2-氧代二氢吲哚-6-甲酸甲基酯(8.8g，28mol)和N-甲基哌嗪(5.6g，57mmol)加入甲醇80mL中，于60℃搅拌反应，2-5小时反应毕，反应液冷却，析出固体，将固体过滤，甲醇淋洗，得到浅红色固体的杂质化合物8.9g。

HPLC检测，产品纯度96.2％。

HPLC方法为：取杂质化合物5mg，加入25mL容量瓶中，流动相A-流动相B(45:55)适量超声使溶解并稀释至刻度，作为供试品溶液。

色谱条件为：

(1)色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶。

(2)流动相：流动相A为为20mmol/L磷酸二氢钾溶液(磷酸调pH值至3.0)，流动相B为乙腈，进行梯度洗脱；0-35min，流动相A45％，流动相B55％；35-50min，流动相A30％，流动相B70％；50-60min，流动相A25％，流动相B75％。

(3)流速：1ml/min。

(4)检测波长：245nm。

(5)柱温：30℃。

实施例2

将N-乙酰基-3-[甲氧基(苯基)亚甲基]-2-氧代二氢吲哚-6-甲酸甲基酯(10g，28mmol)和N-甲基哌嗪(5.6g，57mmol)加入甲醇50mL和N,N-二甲基甲酰胺5mL中，于68℃回流反应，2-4小时反应后，添加哌啶(4.8g，57mmol)，继续反应2小时。反应液冷却，降温析出固体，过滤，残留物加甲醇30mL打浆，过滤得浅红色固体的杂质化合物5.7g。HPLC检测，杂质化合物纯度97.4％。

实施例3

将N-氯乙酰基-3-[甲氧基(苯基)亚甲基]-2-氧代二氢吲哚-6-甲酸甲基酯(10g，28mmol)和N-甲基哌嗪(5.6g，57mmol)加入N,N-二甲基甲酰胺30mL中，于80℃反应，2小时反应后，添加哌啶(4.8g，57mmol)，继续反应2小时。反应液冷却，加入水100mL,二氯甲烷100mL萃取，饱和氯化钠溶液50mL×3洗涤。无水硫酸钠干燥有机相，过滤，滤液减压蒸馏除去二氯甲烷，残留物加异丙醇50mL析晶，过滤，得浅红色固体的杂质化合物7.4g。HPLC检测，杂质化合物纯度98.5％。

实施例4-6

分别将实施例1、2或3得到的杂质化合物5.0g，加入乙醇80mL中，加热回流至全溶，搅拌下缓慢降温析出固体，温度降至室温后过滤，得到纯化的杂质化合物3.1g。HPLC检测，所纯化的杂质化合物纯度均为99.8％。

实施例1-3中的的原料采用下列方法制备得到。

N-乙酰基-3-[甲氧基(苯基)亚甲基]-2-氧代二氢吲哚-6-甲酸甲基酯的制备步骤：

将2-氧化吲哚-6-甲酸甲酯6.9g加入到甲苯15mL中搅拌，加入乙酸酐15mL、原苯甲酸三甲酯11g，120-125℃加热，回流反应5h。反应毕，加甲苯7mL，降温；析晶，降温至25℃，过滤。得N-乙酰基-3-[甲氧基(苯基)亚甲基]-2-氧代二氢吲哚-6-甲酸甲基酯6.2g。

3-[甲氧基(苯基)亚甲基]-2-氧代二氢吲哚-6-甲酸甲基酯的之别步骤如下：

将N-乙酰基-3-[甲氧基(苯基)亚甲基]-2-氧代二氢吲哚-6-甲酸甲基酯6.2g悬浮于25mL甲醇中，搅拌，加热回流；于2min内将KOH的甲醇溶液(0.6g，5ml)添加至反应液中。反应10min。降温，过滤，得3-[甲氧基(苯基)亚甲基]-2-氧代二氢吲哚-6-甲酸甲基酯4.3g。

尼达尼布的制备步骤如下：

将N-(4-氨基苯基)-N,4-二甲基-1-哌嗪乙酰胺17.6g和将N-乙酰基-3-[甲氧基(苯基)亚甲基]-2-氧代二氢吲哚-6-甲酸甲基酯19g添加至DMF 15mL和甲醇75mL中，回流反应1.5h以上。反应液中加入N-甲基哌嗪9.4g，反应1h，降温，至5℃过滤。得产品尼达尼布25.1g。将尼达尼布加甲醇250mL重结晶，得到纯化后的尼达尼布HPLC纯度99.58％。

检测尼达尼布中杂质化合物的含量，HPLC方法为：

取尼达尼布10mg，加入25mL容量瓶中，流动相A-流动相B(45:55)适量超声使溶解并稀释至刻度，作为供试品溶液。

取该杂质化合物，流动相A-流动相B(45:55)适量超声使溶解并稀释成20μg/ml的对照品溶液。

色谱条件为：

(1)色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶。

(2)流动相：流动相A为为20mmol/L磷酸二氢钾溶液(磷酸调pH值至3.0)，流动相B为乙腈，进行梯度洗脱；0-35min，流动相A45％，流动相B55％；35-50min，流动相A30％，流动相B70％；50-60min，流动相A25％，流动相B75％。

(3)流速：1ml/min。

(4)检测波长：245nm。

(5)柱温：30℃。

(6)进样量：20μl。

尼达尼布中杂质化合物未检出。