用于检测黄瓜枯萎病菌的LAMP引物组合物及其应用的制作方法

文档序号:12249968阅读:来源:国知局

技术特征:

1.用于检测黄瓜枯萎病菌的LAMP引物组合物,其特征在于,所述引物组合物由1对外侧引物F3/B3和1对内侧引物FIP/BIP组成,其核苷酸序列如下:

F3: 5’-GCGTTTGCCCTCTTACCATT-3’,

B3: 5’-GCATGAGCGACAACATACCA-3’,

FIP: 5’-CGAGCTCAGCGGCTTCCTATTCACAACCTCAATGAGTGCGT-3’,

BIP: 5’-TTCTTGACAAGCTCAAGGCCGAAGGAGTCTCGAACTTCCAGA- 3’。

2.一种利用权利要求1所述引物进行黄瓜枯萎病菌LAMP检测的方法,其特征在于包括以下具体步骤:

(1)提取待测样品基因组DNA;

(2)LAMP反应体系的建立:LAMP检测反应体系为25 μL,以步骤(1)提取的DNA为模板,反应体系包括5 μM外侧引物F3和B3各1.0 μL,40 μM内侧引物FIP和BIP各1.0 μL,LAMP反应混合液12.5μL,8 U Bst聚合酶1.0 μL,DNA模板1.0 μL,用灭菌超纯水补足至25μL;

(3)LAMP反应条件:63 ℃温育60 min;

(4)反应结果的测定:采用荧光染料目测观察法或琼脂糖凝胶电泳法进行测定;

采用荧光染料目测观察法,待LAMP反应结束后,在LAMP反应的扩增产物中加入显色剂SYBR greenⅠ1.0 μL,显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性,存在黄瓜枯萎病菌,橙色或橘黄色判断为阴性,不存在黄瓜枯萎病菌;

采用琼脂糖凝胶电泳法,取2.0 μL LAMP扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测,如出现梯形条带判断为阳性,存在黄瓜枯萎病菌,没有出现条带则判断为阴性,不存在黄瓜枯萎病菌。

3. 如权利要求2所述的一种黄瓜枯萎病菌LAMP检测方法,其特征在于,所述LAMP反应混合液由以下组分组成:40 mM Tris-HCl,20 mM (NH4)2SO4,20 mM KCl,16 mM MgSO4,1.6 mol/L甜菜碱,2.0 mM dNTPs,0.2% Trion X-100。

4.利用权利要求1所述的黄瓜枯萎病菌LAMP检测引物在黄瓜炭疽病菌的早期诊断和病菌的监测、鉴定上的应用。

5.利用权利要求2所述的黄瓜枯萎病菌LAMP检测方法在黄瓜炭疽病菌的早期诊断和病菌的监测、鉴定上的应用。

当前第2页1 2 3 
网友询问留言 已有0条留言
  • 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞!
1