本发明涉及一种检测方法，具体是一种小肠结肠炎耶尔森菌的快速检测方法。
背景技术：
目前对小肠结肠炎耶尔森菌的检测方法，主要基于对病原体的培养、毒素检测、染色镜检、血清学(抗原或抗体)检测等，但这些方法均不适合早期快速侦检，难以适应疫情控制的需要。虽然近年来也发展了常规PCR及DNA探针杂交技术、胶体金技术、基因芯片技术等，但常规PCR及DNA探针杂交技术存在特异性和敏感性的问题；胶体金技术敏感性较差，假阳性和假阴性偏高；基因芯片技术的检测成本及硬件要求均较高，并且重复性较差(一般一个样品需重复3次才能做出综合评价)，难于推广，目前仅适合学术性科研。此外，这些检测方法均属开放式方法，检测烈性传染病病原体时均存在严重的生物安全与传播隐患，而且对实验仪器和环境造成交叉污染的危险性较大，易导致假阳性结果等。目前文献所报道的这些方法，除基因芯片外均为单重检测方法，所需设备、试剂、反应参数迥异，难于整合，不能同时检测和预警上述三种病原体，耗时较长。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种小肠结肠炎耶尔森菌的快速检测方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种小肠结肠炎耶尔森菌的快速检测方法，包括如下步骤：①选取引物对和探针：从由SEQIDNo：1-SEQIDNo：36组成的引物、探针序列中选取引物对和探针，用荧光染料在各探针序列的5′端标记报告荧光基团，用非荧光染料在各探针序列的3′端标记淬灭荧光基团；所述荧光染料包括FAM、JOE、TRAMA、TET、ROX、HEX；所述非荧光染料包括ECLIPSE、BHQ；将所述各引物对分别制成引物对工作液，并将所述各探针分别制成探针工作液；②制备目标基因的质粒标准品：从灭活的小肠结肠炎耶尔森菌中提取基因组DNA；按常规方法，从由SEQIDNo：1-SEQIDNo：36组成的引物、探针序列中分别选取一组capa引物对、一组pa引物对、一组pla引物对、一组f1引物对、一组mip引物对、及一组pile引物对进行PCR扩增，获得对应的各目标基因扩增产物；将各扩增产物分别回收、纯化，并分别连接到PGEM-Teasy质粒，转化，提取质粒DNA，从而获得所述各目标基因的质粒标准品；测定所述各目标基因的质粒标准品的浓度后，根据需要稀释分装，置-20℃备用；③建立反应体系：A.dNTPs浓度的优化；B.镁离子浓度的优化；C.耐热性RNaseH酶——TliRNaseHII用量的优化；D.TaqDNA聚合酶——ExTaqHS用量的优化；E.引物浓度的优化；F.探针浓度的优化；G.目标基因的质粒标准品线性范围的确定；④选择荧光检测通道：根据标记在步骤①所选各探针上的报告荧光基团选择荧光检测通道。
作为本发明进一步的方案：所述步骤①中，选取的引物对和探针由六组引物对和六个探针构成：一组capa引物对和一个capa探针、一组pa引物对和一个pa探针、一组pla引物对和一个pla探针、一组f1引物对和一个f1探针、一组mip引物对和一个mip探针、及一组pile引物对和一个pile探针。
作为本发明再进一步的方案：所述步骤③中，所述反应体系由以下组分构成：反应体系终浓度为0.3mmol/L的各dNTP，反应体系终浓度为5mmol/L的镁离子，反应体系终浓度为4U/μl的TliRNaseHII，反应体系终浓度为1.25U/25μl的ExTaqHS，反应体系终浓度为0.4μmol/L的各引物，反应体系终浓度为0.2μmol/L的各探针，各目标基因质粒标准品拷贝数为10～108copy/每反应体系，Buffer适量，双蒸水适量；整个反应体系的总体积为25μl。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明方法能克服传统检测方法存在的检测周期长、步骤繁琐、费时费力等缺点，使检测时间大大缩短，操作步骤和劳动强度也大为缩减，达到省时省力、快速灵敏的要求。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
本发明实施例中，一种小肠结肠炎耶尔森菌的快速检测方法，包括如下步骤：①选取引物对和探针：从由SEQIDNo：1-SEQIDNo：36组成的引物、探针序列中选取引物对和探针，用荧光染料在各探针序列的5′端标记报告荧光基团，用非荧光染料在各探针序列的3′端标记淬灭荧光基团；所述荧光染料包括FAM、JOE、TRAMA、TET、ROX、HEX；所述非荧光染料包括ECLIPSE、BHQ；将所述各引物对分别制成引物对工作液，并将所述各探针分别制成探针工作液；②制备目标基因的质粒标准品：从灭活的小肠结肠炎耶尔森菌中提取基因组DNA；按常规方法，从由SEQIDNo：1-SEQIDNo：36组成的引物、探针序列中分别选取一组capa引物对、一组pa引物对、一组pla引物对、一组f1引物对、一组mip引物对、及一组pile引物对进行PCR扩增，获得对应的各目标基因扩增产物；将各扩增产物分别回收、纯化，并分别连接到PGEM-Teasy质粒，转化，提取质粒DNA，从而获得所述各目标基因的质粒标准品；测定所述各目标基因的质粒标准品的浓度后，根据需要稀释分装，置-20℃备用；③建立反应体系：A.dNTPs浓度的优化；B.镁离子浓度的优化；C.耐热性RNaseH酶——TliRNaseHII用量的优化；D.TaqDNA聚合酶——ExTaqHS用量的优化；E.引物浓度的优化；F.探针浓度的优化；G.目标基因的质粒标准品线性范围的确定；④选择荧光检测通道：根据标记在步骤①所选各探针上的报告荧光基团选择荧光检测通道。所述步骤①中，选取的引物对和探针由六组引物对和六个探针构成：一组capa引物对和一个capa探针、一组pa引物对和一个pa探针、一组pla引物对和一个pla探针、一组f1引物对和一个f1探针、一组mip引物对和一个mip探针、及一组pile引物对和一个pile探针。所述步骤③中，所述反应体系由以下组分构成：反应体系终浓度为0.3mmol/L的各dNTP，反应体系终浓度为5mmol/L的镁离子，反应体系终浓度为4U/μl的TliRNaseHII，反应体系终浓度为1.25U/25μl的ExTaqHS，反应体系终浓度为0.4μmol/L的各引物，反应体系终浓度为0.2μmol/L的各探针，各目标基因质粒标准品拷贝数为10～108copy/每反应体系，Buffer适量，双蒸水适量；整个反应体系的总体积为25μl。
实施例1：
本发明小肠结肠炎耶尔森菌的快速检测方法，包括如下步骤：①选取引物对和探针：从由SEQIDNo：1-SEQIDNo：36组成的引物、探针序列中选取引物对和探针，用荧光染料在各探针序列的5′端标记报告荧光基团，用非荧光染料在各探针序列的3′端标记淬灭荧光基团；所述荧光染料包括FAM、JOE、TRAMA、TET、ROX、HEX；所述非荧光染料包括ECLIPSE、BHQ；将所述各引物对分别制成引物对工作液，并将所述各探针分别制成探针工作液；②制备目标基因的质粒标准品：从灭活的小肠结肠炎耶尔森菌中提取基因组DNA；按常规方法，从由SEQIDNo：1-SEQIDNo：36组成的引物、探针序列中分别选取一组capa引物对、一组pa引物对、一组pla引物对、一组f1引物对、一组mip引物对、及一组pile引物对进行PCR扩增，获得对应的各目标基因扩增产物；将各扩增产物分别回收、纯化，并分别连接到PGEM-Teasy质粒，转化，提取质粒DNA，从而获得所述各目标基因的质粒标准品；测定所述各目标基因的质粒标准品的浓度后，根据需要稀释分装，置-20℃备用；③建立反应体系：A.dNTPs浓度的优化；B.镁离子浓度的优化；C.耐热性RNaseH酶——TliRNaseHII用量的优化；D.TaqDNA聚合酶——ExTaqHS用量的优化；E.引物浓度的优化；F.探针浓度的优化；G.目标基因的质粒标准品线性范围的确定；④选择荧光检测通道：根据标记在步骤①所选各探针上的报告荧光基团选择荧光检测通道。所述步骤①中，选取的引物对和探针由六组引物对和六个探针构成：一组capa引物对和一个capa探针、一组pa引物对和一个pa探针、一组pla引物对和一个pla探针、一组f1引物对和一个f1探针、一组mip引物对和一个mip探针、及一组pile引物对和一个pile探针。所述步骤③中，所述反应体系由以下组分构成：反应体系终浓度为0.3mmol/L的各dNTP，反应体系终浓度为5mmol/L的镁离子，反应体系终浓度为4U/μl的TliRNaseHII，反应体系终浓度为1.25U/25μl的ExTaqHS，反应体系终浓度为0.4μmol/L的各引物，反应体系终浓度为0.2μmol/L的各探针，各目标基因质粒标准品拷贝数为10copy/每反应体系，Buffer适量，双蒸水适量；整个反应体系的总体积为25μl。
实施例2：
本发明小肠结肠炎耶尔森菌的快速检测方法，包括如下步骤：①选取引物对和探针：从由SEQIDNo：1-SEQIDNo：36组成的引物、探针序列中选取引物对和探针，用荧光染料在各探针序列的5′端标记报告荧光基团，用非荧光染料在各探针序列的3′端标记淬灭荧光基团；所述荧光染料包括FAM、JOE、TRAMA、TET、ROX、HEX；所述非荧光染料包括ECLIPSE、BHQ；将所述各引物对分别制成引物对工作液，并将所述各探针分别制成探针工作液；②制备目标基因的质粒标准品：从灭活的小肠结肠炎耶尔森菌中提取基因组DNA；按常规方法，从由SEQIDNo：1-SEQIDNo：36组成的引物、探针序列中分别选取一组capa引物对、一组pa引物对、一组pla引物对、一组f1引物对、一组mip引物对、及一组pile引物对进行PCR扩增，获得对应的各目标基因扩增产物；将各扩增产物分别回收、纯化，并分别连接到PGEM-Teasy质粒，转化，提取质粒DNA，从而获得所述各目标基因的质粒标准品；测定所述各目标基因的质粒标准品的浓度后，根据需要稀释分装，置-20℃备用；③建立反应体系：A.dNTPs浓度的优化；B.镁离子浓度的优化；C.耐热性RNaseH酶——TliRNaseHII用量的优化；D.TaqDNA聚合酶——ExTaqHS用量的优化；E.引物浓度的优化；F.探针浓度的优化；G.目标基因的质粒标准品线性范围的确定；④选择荧光检测通道：根据标记在步骤①所选各探针上的报告荧光基团选择荧光检测通道。所述步骤①中，选取的引物对和探针由六组引物对和六个探针构成：一组capa引物对和一个capa探针、一组pa引物对和一个pa探针、一组pla引物对和一个pla探针、一组f1引物对和一个f1探针、一组mip引物对和一个mip探针、及一组pile引物对和一个pile探针。所述步骤③中，所述反应体系由以下组分构成：反应体系终浓度为0.3mmol/L的各dNTP，反应体系终浓度为5mmol/L的镁离子，反应体系终浓度为4U/μl的TliRNaseHII，反应体系终浓度为1.25U/25μl的ExTaqHS，反应体系终浓度为0.4μmol/L的各引物，反应体系终浓度为0.2μmol/L的各探针，各目标基因质粒标准品拷贝数为108copy/每反应体系，Buffer适量，双蒸水适量；整个反应体系的总体积为25μl。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。