一种检测过氧化氢新型荧光探针的合成与应用的制作方法

本发明涉及化学分析检测技术领域，具体涉及一种识别过氧化氢新型红光-近红外荧光探针的制备方法及其在体外和活细胞内检测过氧化氢方面的应用。

背景技术：

活性氧包括超氧化物自由基(O₂·)，过氧氢自由基(HO₂·)，羟自由基(HO·)，过氧自由基(RO₂·)，单线态氧(¹O₂)和次氯酸(HOCl)等。过氧化氢作为活性氧家族中不可或缺的一员，在生物体的生理学，新陈代谢和病理学中发挥着重要的作用。细胞中过氧化氢含量升高有可能导致DNA损害，变异和遗传不稳定。其还是与老化和疾病相关的氧化应激的指示剂，细胞信号传递的第二信使，免疫细胞与细菌做斗争过程中产生的脱氧剂。在生命系统中，过氧化氢的产生，积累和消除都会产生迥然不同的生理学和病理学结果，正因为如此过氧化氢的检测技术在化学，生物学，以及医学领域都尤为重要。但是由于过氧化氢的瞬时存在性，直接检测的技术发展举步维艰，目前过氧化氢的检测技术大多是利用其与底物反应，然后用一系列手段检测底物转变为产物的过程或者产物本身，以实现过氧化氢检测的目地。这些检测技术包括电化学法，比色法，气体检测法，荧光法等等。其中由于荧光探针具有操作简单，无辐射，高灵敏度和高分辨率的优势，成为检测过氧化氢的有效手段。近些年，过氧化氢应答激发的荧光探针已经被报道了很多，然而多数探针具有短发射波长和小斯托克斯位移(Stokes shifts)的缺点。众所周知，长发射波长和大斯托克斯位移对细胞荧光成像是非常有利的，因为具有长波长的光子能够减少环境诱导的光散射，从而减少检测过程中内生发色团的影响，并且能够减少活细胞的光损伤，大斯托克斯位移能够提高检测的灵敏度。具有大斯托克斯位移用于检测过氧化氢的红光-近红外荧光探针现在还鲜有报道。

技术实现要素：

针对目前过氧化氢检测的现状，本发明的目的一是提供一种原料廉价易得，合成步骤简单、反应条件温和、产率较高的荧光探针合成方法；二是提供一种能够对过氧化氢进行特异性识别的荧光探针，且其具有好选择性、高灵敏度，强抗干扰能力，大斯托克斯位移(Stokes shifts)和长发射波长的优势。

本发明解决问题采取的技术方案如下，一种特异性识别过氧化氢的新型荧光探针，具有如下分子结构式：该荧光探针的合成路线如下：制备方法详情如下：(1)取3-硝基邻苯二甲腈(1.0g，5.8mmol)，碳酸钾(0.9g，6.35mmol)和亚硝酸钠(0.4g，5.8mmol)于25mL圆底烧瓶中，加入15mL二甲基亚砜溶解，油浴升温至130℃搅拌回流，TLC薄层色谱分析检测反应进度，30分钟反应完成后冷却至室温，缓慢加入蒸馏水(45mL)稀释反应液，稀盐酸(2M)调PH至3，沉淀析出，然后减压抽滤，滤饼用蒸馏水洗三次，于冰醋酸中重结晶得到棕色针状晶体，抽滤得都晶体，置于真空干燥器中干燥一晚，得到产物3-羟基邻苯二甲腈。产量：0.51g。产率60％。(2)取3-羟基邻苯二甲腈(288mg，2mmol)，2-氨基吡啶(385mg，4.1mmol)和氯化钙(46mg，0.41mmol)于25mL圆底烧瓶中，加入6mL正丁醇溶解。在氩气保护下，油浴升温至110℃搅拌回流，TLC薄层色谱分析检测反应进度，5天后反应完成，反应液冷却至室温，减压蒸馏除去溶剂，固体用蒸馏水洗三次，过滤，滤饼置于真空干燥器中过夜，柱层析进一步纯化，所得橘黄色粉末真空干燥过夜。产量：150.8mg。产率26.6％。(3)取上步所得产物(48mg，0.15mmol)，碳酸钾(400mg，3mmol)，碘化钾(80mg，0.5mmol)于100mL圆底烧瓶中，加入30mL乙腈溶解，常温搅拌30分钟后加入4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯(47.6mg，1.6mmol)，然后油浴升温至61℃搅拌回流，TLC薄层色谱分析检测反应进度，30分钟后反应完成，反应液冷却至室温，减压旋蒸除去溶剂乙腈，快速柱层析纯化得到黄色粉末。产量：59mg。产率：73.8％。

本发明的荧光探针对过氧化氢的检测机理详情如下所述，染料分子的酚羟基被4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯取代后，其激发态分子内质子转移(ESIPT)被阻断，由此所得探针分子没有荧光。而在过氧化氢的作用下，甲基苯硼酸频哪醇酯部分离去，染料分子得以恢复，发射很强的红色荧光。响应过程如下所示：

高效液相色谱很好的验证了本发明荧光探针对过氧化氢的作用机理，液相色谱图中，探针分子在23.32分钟时出现了单峰，而染料分子单峰出现在15.55分钟，当加入5倍量过氧化氢，37℃反应1小时后，染料分子15.55分钟的单峰出现的同时探针分子23.32分钟的单峰强度减弱。当加入80倍量过氧化氢，37℃反应1小时后，只有染料分子15.55分钟的单峰，探针分子23.32分钟的峰消失。此结果与预测的响应机理相符合。

本发明的荧光探针发射波长在近红外，其本身不发射荧光，在与过氧化氢作用后有很强的荧光，最大发射波长为585nm。

本发明的荧光探针的斯托克斯位移高达217nm，其最大吸收波长为368nm，与过氧化氢反应后最大发射波长为585nm。

本发明的荧光探针对过氧化氢有很好的选择性，在PH等于7.4的PBS缓冲溶液中，探针溶液不发射荧光，加入80倍量的过氧化氢，荧光强度逐渐增强，60分钟后增大到0分钟的77.8倍，同样条件下分别加入其他可能干扰的化学物质，包括TBHP，·OH，·O_tBu，ClO^-，NO，ROO^-，ONOO^-，O₂^-，¹O₂，Na⁺，K⁺，Mg²⁺，Ca²⁺，HS^-，SO₃^2-，S₂O₃^2-，GSH，Hcy，Cys，探针的荧光强度并没有明显变化。

本发明的荧光探针具有很强的抗干扰能力，其他可能干扰的化学物质(TBHP，·OH，·O_tBu，ClO^-，NO，ROO^-，ONOO^-，O₂^-，¹O₂，Na⁺，K⁺，Mg²⁺，Ca²⁺，HS^-，SO₃^2-，S₂O₃^2-，GSH，Hcy，Cys)的存在不影响探针分子对过氧化氢的响应。

本发明的荧光探针对过氧化氢的检测表现出很高的灵敏度，探针溶液的荧光强度随过氧化氢浓度而递增，大约在加入80倍量过氧化氢时达到峰值。在0到20倍量过氧化氢的区间内，探针溶液荧光强度与过氧化氢浓度有很好的线性关系。本发明荧光探针的检出限为6.6nM。

本发明的荧光探针的PH适用范围较宽，在7到13的范围内都不影响探针分子对过氧化氢的检测。

本发明的优点：探针分子原料廉价易得，合成过程操作简单，产率较高，检测过氧化氢时具有发射波长长，斯托克斯位移大，选择性好、抗干扰能力强，灵敏度高，检测限低，检测范围宽的优点。因此，本发明的荧光探针是一种简单，灵敏，能在体外和活细胞内部检测过氧化氢的试剂，在化学分析检测领域具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为本发明的荧光探针的高效液相色谱图。(1)荧光探针分子(5μM)的液相色谱。(2)荧光探针分子(5μM)与5倍量过氧化氢作用后的液相色谱。(3)荧光探针分子(5μM)与80倍量过氧化氢作用后的液相色谱。(4)染料分子(5μM)的液相色谱。

图2为本发明荧光探针对不同离子和分子选择性的柱状图。其中从1到16分表代表H₂O₂，TBHP，·OH，·O_tBu，ClO^-，NO，ROO^-，ONOO^-，O₂^-，¹O₂，Na⁺，K⁺，Mg²⁺，Ca²⁺，HS^-，SO₃^2-，S₂O₃^2-，GSH，Hcy，Cys。

图3为本发明荧光探针对不同离子和分子抗干扰能力的柱状图。与其他离子和分子共存时，过氧化氢与荧光探针(5μM)作用后的荧光强度比值(I/I₀)柱状图。I表示其他离子和分子与过氧化氢共存时的荧光强度，I₀表示只有过氧化氢时的荧光强度。

图4为本发明的荧光探针(5μM)在PBS缓冲溶液(10mM，pH＝7.4，1.0Mm溴化十六烷基三甲铵)中，加入递增浓度过氧化氢(0–400μM)，37℃保温1小时后的荧光光谱图。

图5为本发明的荧光探针(5μM)在PBS缓冲溶液(10mM，pH＝7.4，1.0Mm溴化十六烷基三甲铵)中，与过氧化氢浓度(0–100μM)的线性关系图。

图6为本发明的荧光探针(5μM)在PBS缓冲溶液(10mM，pH＝7.4，1.0Mm溴化十六烷基三甲铵)中，与过氧化氢(400μM)作用荧光随时间的变化的图谱。

图7为本发明的荧光探针(5μM)在不同pH(2-13)缓冲溶液中，加入过氧化氢(400μM)前后的荧光光谱图。

图8为本发明的荧光探针(10μM)在不同条件下的细胞(Hela细胞)成像(a)探针在过氧化氢溶液处理的细胞中明场成像，(b)探针在过氧化氢溶液处理的细胞中荧光成像，(c)探针在细胞中明场成像(d)探针在细胞中荧光成像。

具体实施实例

实施例1：3-羟基邻苯二甲腈的制备

取3-硝基邻苯二甲腈(1.0g，5.8mmol)，碳酸钾(0.9g，6.35mmol)和亚硝酸钠(0.4g，5.8mmol)于25ml圆底烧瓶中，加入15mL二甲基亚砜中溶解，油浴升温至130℃搅拌回流，TLC薄层色谱分析检测反应进度，30分钟反应完成后冷却至室温，缓慢加入蒸馏水(45mL)稀释反应液，稀盐酸(2M)调PH至3，沉淀析出，然后减压抽滤，滤饼用蒸馏水洗三次，于冰醋酸中重结晶得到棕色针状晶体，抽滤得都晶体，置于真空干燥器中干燥一晚，得到产物3-羟基邻苯二甲腈。产量：0.51g。产率60％。

实施例2：染料的制备

取3-羟基邻苯二甲腈(288mg，2mmol)，2-氨基吡啶(385mg，4.1mmol)和氯化钙(46mg，0.41mmol)于25mL圆底烧瓶中，加入6mL正丁醇溶解。在氩气保护下，油浴升温至110℃搅拌回流，TLC薄层色谱分析检测反应进度，5天后反应完成，反应液冷却至室温，减压蒸馏除去溶剂，固体用蒸馏水洗三次，过滤，滤饼置于真空干燥器中过夜，柱层析进一步纯化，所得橘黄色粉末真空干燥过夜。产量：150.8mg。产率26.6％。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ_H 13.70(s，1H)，8.62(m，2H)，7.78(t，J＝7.9Hz，2H)，7.60(s，1H)，7.52(d，J＝7.3Hz，2H)，7.38(d，J＝8.0Hz，1H)，7.19-7.09(m，3H)。¹³C NMR(101MHz，CDCl₃)δ_c 160.10，159.34，155.81，155.59，153.70，147.98，147.76，138.12，138.08，135.66，133.58，123.43，122.31，120.50，120.27，118.98，118.29，114.52。

实施例3：探针分子的制备

取上步所得染料(48mg，0.15mmol)，碳酸钾(400mg，3mmol)，碘化钾(80mg，0.5mmol)于100mL圆底烧瓶中，加入30mL乙腈溶解，常温搅拌30分钟后加入4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯(47.6mg，1.6mmol)，然后油浴升温至61℃搅拌回流，TLC薄层色谱分析检测反应进度，30分钟后反应完成，反应液冷却至室温，减压旋蒸除去溶剂乙腈，快速柱层析纯化得到黄色粉末。产量：59mg。产率：73.8％。

实施例4：本发明荧光探针的应用

取探针分子母液(1.0×10^-3mol/L)于PBS缓冲溶液(10mM，pH＝7.4，1.0Mm溴化十六烷基三甲铵)中配成待测溶液，再分别加入各种粒子和分子(叔丁基过氧化氢，羟自由基，叔丁氧自由基，次氯酸，一氧化氮，钠离子，钾离子，镁离子，钙离子，巯基，亚硫酸根，硫代硫酸根，谷胱甘肽，同型半胱氨酸，半胱氨酸)37℃保温1小时后测量，溶液荧光几乎没有明显变化，而只加人过氧化氢的探针溶液荧光大幅度增强，可见该荧光探针能够对过氧化氢实现选择性识别。当其他离子与分子(叔丁基过氧化氢，羟自由基，叔丁氧自由基，次氯酸，一氧化氮，钠离子，钾离子，镁离子，钙离子，巯基，亚硫酸根，硫代硫酸根，谷胱甘肽，同型半胱氨酸，半胱氨酸)各自与过氧化氢同时加入，37℃保温1小时后测量，探针溶液荧光依然显著增强，本发明的荧光探针对过氧化氢的检测表现出来很强的抗干扰能力。该探针分子检测限低，可以达到6.6nM，适合微量检测。PH在7至13都不影响探针分子对过氧化氢的检测，可见本发明的荧光探针具有良好的生物适应能力。