唾液酸寡糖-磁纳米粒子及其制备方法与应用与流程

本发明属于生物材料领域，涉及一种唾液酸寡糖-磁纳米粒子及其制备方法与应用。

背景技术：

流行性感冒(流感)是由流感病毒引起的人畜共患传染病，它的宿主累及人、猪、鸟、马和海豚等多种动物。灵敏可靠的流感病毒检测手段变得越来越重要。但是到目前为止，最标准化的流感病毒分离鉴定过程涉及到利用细胞、鸡胚或实验动物扩增病毒，进而再进行一系列实验分离鉴定，整个过程至少需要两周时间，耗时耗力。并且实际待测的样品一般是比较复杂的生物样品，流感病毒含量极低。其他被广泛使用的流感病毒的鉴定方法如酶联免疫反应(ELISA)和聚合酶链式反应(PCR)在检测这种病毒含量极低的复杂的生物样品时，会遇到一定得挑战。比如ELISA通常不足够灵敏，而对于PCR，复杂的生物样品在提取核酸时，RNA极易降解以及常常会受到假阳性的干扰等。

因此，在检测这种病毒含量极低的复杂的生物样品时，对流感病毒进行一步富集分离就显得极为重要。磁纳米粒子因为具有如下优点，所以在富集分离方面得到了广泛的应用：(1)比表面积比较高，容易结合更多的靶标；(2)粒径均一，单分散；(3)具有超顺磁性，操作方便，省时省力。

当前应用研究中用于富集分离流感病毒的磁纳米表面都是包被了能特异识别流感病毒的抗体，使得磁纳米具有了特异结合流感病毒的能力，从而能够对病毒含量极低的复杂的生物样品中的流感病毒进行富集分离纯化。但是，抗体属于生物制品，价格昂贵而且容易变性，所以制备出来的抗体-磁纳米粒子代价高且不易保存和应用，更不能重复多次回收利用。并且，由于抗体一般特异性比较高，每种抗体包被的磁纳米一般只能富集分离特异的流感病毒毒株，在广泛使用性上欠缺。

研究证实，流感病毒表面糖蛋白血凝素(hemagglutinin，HA)特异识别宿主细胞表面的糖链受体是流感病毒感染宿主、进而复制并继续传播的生物学基础。流感病毒对唾液酸的识别和结合有偏好型，禽流感病毒倾向于结合Siaα2,3Gal受体，而人流感病毒则主要结合Siaα2,6Gal受体。禽类的肠道主要含Siaα2,3Gal受体，人类的上呼吸道上皮细胞主要有Siaα2,6Gal受体。人流感病毒与人的气管上皮细胞结合紧密，而禽流感病毒与人气管上皮细胞结合很弱。猪既有Siaα2,3Gal受体也有Siaα2,6Gal受体，猪对人流感病毒和禽流感病毒都易感。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种唾液酸寡糖-磁纳米粒子及其制备方法与应用。

本发明是在磁纳米表面通过共价键连接了各种唾液酸寡糖得到了如下结构的唾液酸寡糖-磁纳米粒子。

本发明提供的唾液酸寡糖-磁纳米粒子，其结构通式如式Ⅹ-1或式Ⅹ-2所示：

所述式Ⅹ-1和式Ⅹ-2中，x为1-3的整数；

m为0-11的整数；

Ac为乙酰基；

R¹为羟基或乙酰胺基；

R²为氢或L-岩藻糖基

R³为氢或硫酸酯基；

R⁴为羟基或乙酰胺基。

所述式Ⅹ-1和式Ⅹ-2中，m为2-11的整数或5或11。

本发明提供的制备所述唾液酸寡糖-磁纳米粒子的方法，包括如下步骤：

将式Ⅹ或式Ⅺ所示化合物通过click反应连接到表面带叠氮基团的磁纳米粒子的表面，得到所述唾液酸寡糖-磁纳米粒子；

所述式X至式XI中，m、Ac、R¹至R²的定义与前述定义相同。

具体的，所述式X至式XI中，R¹为乙酰氨基，R²为氢，R³为氢，R⁴为羟基；

上述方法的click反应步骤中，温度为室温；时间为12-48小时，具体可为24小时；

所述式Ⅹ或式Ⅺ所示化合物与所述表面带叠氮基团的磁纳米粒子的质量比为1：5-20，具体可为1：10；

所述click反应是在惰性气氛或氮气气氛中进行；

所用催化剂为Cu2SO4·5H2O和抗坏血酸钠；所述Cu2SO4·5H2O和抗坏血酸钠的质量比具体可为1:10；

所用溶剂为水和DMF或由等体积比的水和DMF组成的混合液。

所述表面带叠氮基团的磁纳米粒子可按照包括如下步骤的方法制得：

将式Ⅻ所示化合物通过酰胺缩合反应连接到表面带羧基的磁纳米粒子表面，得到所述表面带叠氮基团的磁纳米粒子；

N3(CH2CH2O)mCH2CH2NH2

式Ⅻ

具体的，

所述酰胺缩合反应是在缩合剂和溶剂存在的条件下进行的；

所述缩合剂为HATU；

所述溶剂为DMF；

所述缚酸剂为DIPEA；

所述酰胺缩合反应的反应温度为室温；反应时间为12-120小时，具体可为72小时；

所述式Ⅻ所示化合物、缩合剂和表面带羧基的磁纳米粒子的质量比为(8-2):2:1，具体可为4:2:1。

其中，所述表面带羧基的磁纳米粒子具体为Fe3O4@PMAA，更具体可按照如下方法制得：

将MCNCs(0.15g)超声溶解在乙醇(20ml)和纯水(5ml)中,加入氨水(0.75ml)和MPS(0.15g)，60℃下机械搅拌24小时。用磁分离法分离Fe3O4@MPS，用纯水洗涤除去未反应的反应物和副产物，真空干燥后，再利用回流沉淀聚合法在Fe3O4@MPS上包被PMAA(聚丙烯酸)层：在乙腈中，MAA作为单体，MBA作为交联剂，由AIBN引发聚合反应。具体操作如下，Fe3O4@MPS(75mg)超声溶解在ACN(60ml)中，作为纳米核心种子。依次加入MAA(300mg),MBA(75mg)和AIBN(7.5mg),90℃回流1个小时，冷却到常温，用磁分离法分离Fe3O4@PMAA，用乙醇洗涤除去未反应的反应物和副产物，真空干燥而得。

另外，含有上述唾液酸寡糖-磁纳米粒子的溶液，也属于本发明的保护范围；所述溶液中，溶剂为PBST，其中，Tween-20与PBS的体积比为0.05：100；

所述唾液酸寡糖-磁纳米粒子在所述溶液中的浓度为1mg/ml。

本发明还提供了一种富集分离流感病毒及HA蛋白的试剂或试剂盒，该试剂或试剂盒包括独立包装的A试剂和/或B试剂，所述A试剂为式Ⅹ-1所示唾液酸寡糖-磁纳米粒子；所述B试剂为式Ⅹ-2所示唾液酸寡糖-磁纳米粒子。

本发明还提供了一种富集分离流感病毒及HA蛋白的方法，包括如下步骤：将独立包装的A试剂和/或B试剂与待富集分离的流感病毒或HA蛋白样品孵育，磁性分离去上清，洗涤，浓缩，即得高浓度较纯的流感病毒或HA蛋白。

本发明还提供了一种检测流感病毒的宿主特异性的试剂或试剂盒，该试剂或试剂盒包括独立包装的A试剂和/或B试剂，所述A试剂为式Ⅹ-1所示唾液酸寡糖-磁纳米粒子；所述B试剂为式Ⅹ-2所示唾液酸寡糖-磁纳米粒子。

本发明还提供了一种检测流感病毒的宿主特异性的方法，包括如下步骤：将独立包装的A试剂和/或B试剂与待测流感病毒毒株或其HA蛋白孵育，磁性分离，洗涤；再将磁纳米和相应的一抗和酶标二抗孵育，磁性分离，洗涤；最后和底物孵育显色，测OD吸收值。

当所述反应液中所述待测流感病毒或其HA蛋白与A试剂相结合时，所述待测流感病毒候选为可侵染禽源宿主细胞的流感病毒；

当所述反应液中所述待测流感病毒或其HA蛋白与B试剂相结合时，所述待测流感病毒候选为可侵染人源宿主细胞的流感病毒。

本发明将与流感病毒HA蛋白特异性结合的α2,3唾液酸寡糖和α2,6唾液酸寡糖以共价键连接到磁纳米颗粒上制备获得唾液酸寡糖-磁纳米粒子，富集分离了H1、H5等亚型的A型流感病毒的HA蛋白和H1、H3、H5及H7等亚型的A型流感病毒毒株，并分析检测了这些流感病毒的受体特异性。

此方法具有如下优点，

第一，制备简单方便，代价低廉。

第二，唾液酸寡糖-磁纳米粒子表面连接的唾液酸寡糖是小分子化合物，通过化学键连接，所以唾液酸寡糖-磁纳米粒子特别稳定，利于保存和应用，而且可以多次重复回收利用。

第三，唾液酸寡糖-磁纳米粒子表面连接着很多唾液酸寡糖链，而病毒表面分布最多的蛋白是HA，由于多价效应，唾液酸寡糖-磁纳米粒子和流感病毒或HA蛋白的结合能力很强，所以唾液酸寡糖-磁纳米粒子对流感病毒或HA蛋白的捕获率很高。

第四，唾液酸寡糖-磁纳米粒子利用的是流感病毒的受体特异性，富集分离流感病毒或HA蛋白的同时可以获得流感受体特异性的信息。

第五，每一种唾液酸寡糖-磁纳米粒子可以富集分离多种流感病毒亚型，甚至可以利用人流感和禽流感受体特异性的偏好，实现对人流感和禽流感病毒的选择性富集分离纯化。

第六，由于磁分离操作的简便，唾液酸寡糖-磁纳米粒子在富集分离完流感病毒后很容易和其他检测手段结合起来，实现对流感病毒的超灵敏检测。

由于磁纳米良好的磁学特性，唾液酸寡糖-磁纳米粒子能够对浓度较低且成分复杂的样品进行富集分离或受体特异性分析，具有非常好的实用性，对流感病毒的防控具有重要意义。

附图说明

图1中左图为本发明中制备的磁纳米粒子(Fe3O4)的TEM图像，右图为制备的唾液酸寡糖-磁纳米粒子中的Fe3O4@S2,6LN的TEM图像。

图2为本发明中制备唾液酸寡糖-磁纳米粒子过程中，各步骤得到的磁纳米的磁滞曲线变化。

图3为本发明中制备唾液酸寡糖-磁纳米粒子过程中，各步骤得到的磁纳米的红外光谱变化。

图4为本发明用唾液酸寡糖(SLN)-磁纳米粒子富集分离流感病毒vieH5HA蛋白，并检验其宿主特异性的结果。

图5为本发明用唾液酸寡糖(SLN)-磁纳米粒子富集分离流感病毒09H1HA蛋白，并检验其宿主特异性的结果。

图6为本发明用唾液酸寡糖(SLN)-磁纳米粒子富集分离vieH5流感病毒，并检验其宿主特异性的结果。

图7为本发明用唾液酸寡糖(SLN)-磁纳米粒子富集分离09H1流感病毒，并检验其宿主特异性的结果。

图8为本发明用唾液酸寡糖(SLN)-磁纳米粒子分别富集分离vieH5或09H1流感病毒后的TEM图像。

图9为本发明用唾液酸寡糖(SLN)-磁纳米粒子富集分离anhH7流感病毒，并检验其宿主特异性的结果。

图10为本发明用唾液酸寡糖(SLN)-磁纳米粒子富集分离68H3流感病毒，并检验其宿主特异性的结果。

图11为本发明根据流感病毒受体特异性，用唾液酸寡糖(SLN)-磁纳米粒子选择性富集分离09H1流感病毒的结果。

图12为本发明根据流感病毒受体特异性，用唾液酸寡糖(SLN)-磁纳米粒子选择性富集分离vieH5流感病毒的结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所用的Tris-HCl缓冲液(100mM，pH 8.0)的溶剂为水，溶质为Tris，所述溶质Tris在所述Tris-HCl缓冲液中的浓度为12.1g/L；所述Tris-HCl缓冲液的pH值为8.0。

所用PBS缓冲液(10mM，pH 7.4)的溶剂为水，溶质为NaH2PO4、Na2HPO4、KCl和NaCl，所述溶质NaH2PO4、Na2HPO4、KCl和NaCl在所述PBS缓冲液中的浓度分别为0.24g/L、1.42g/L、0.2g/L和8.0g/L；所述PBS缓冲液的pH值为7.4。

所用PBST缓冲液(10mM，pH 7.4)的溶剂为水，溶质为NaH2PO4、Na2HPO4、KCl、NaCl和吐温20，所述溶质NaH2PO4、Na2HPO4、KCl、NaCl和吐温20在所述PBS缓冲液中的浓度分别为0.24g/L、1.42g/L、0.2g/L、8.0g/L和0.5ml/L；所述PBS缓冲液的pH值为7.4。

所用TBS缓冲液(10mM，pH 7.4)的溶剂为水，溶质为Tris、KCl和NaCl，所述溶质Tris、KCl和NaCl在所述TBS缓冲液中的浓度分别为3g/L、0.2g/L和8.0g/L；所述TBS缓冲液的pH值为7.4。

所用TBST缓冲液(10mM，pH 7.4)的溶剂为水，溶质为Tris、KCl、NaCl和吐温20，所述溶质Tris、KCl、NaCl和吐温20在所述TBST缓冲液中的浓度分别为3g/L、0.2g/L、8.0g/L和0.5ml/L；所述TBST缓冲液的pH值为7.4。

本发明使用的流感病毒的毒株信息如下：

毒株A/California/04/2009(H1N1)：简称09H1，文献：W.Zhang,J.Qi,Y.Shi,Q.Li,F.Gao,Y.Sun,X.Lu,Q.Lu,C.J.Vavricka,D.Liu,J.Yan,G.F.Gao，Protein Cell2010，1，459–467.其HA蛋白的氨基酸序列的Genbank号为ACP41105.1；已知该病毒HA蛋白识别的受体为宿主细胞分泌的唾液酸α2,6寡糖。

毒株A/Aichi/2/1968(H3N2)：简称68H3，文献：N.K.Sauter,J.E.Hanson,G.D.Glick,J.H.Brown,R.L.Crowther,S.-J.Park,J.J.Skehel,D.C.Wiley,Biochemistry1992,31,9609–9621.其HA蛋白的氨基酸序列的Genbank号为BAF37221.1；已知该病毒HA蛋白识别的受体为宿主细胞分泌的唾液酸α2,6寡糖。

毒株A/VietNam/1203/2004(H5N1)：简称vieH5，文献：J.Stevens,O.Blixt,T.M.Tumpey,J.K.Taubenberger,J.C.Paulson,I.A.Wilson，Science 2006,312,404–410.其HA蛋白的氨基酸序列的Genbank号为ABW90135.1；已知该病毒HA蛋白识别的受体为宿主细胞分泌的唾液酸α2,3寡糖。

毒株A/Anhui/1/2013(H7N9)：简称AnhH7，文献：D.Liu,W.Shi,Y.Shi,D.Wang,H.Xiao,W.Li,Y.Bi,Y.Wu,X.Li,J.Yan,W.Liu,G.Zhao,W.Yang,Y.Wang,J.Ma,Y.Shu,F.Lei,G.F.Gao,The Lancet,2013,381,1926–1932.其HA蛋白的氨基酸序列的如序列表序列2所示。已知该病毒HA蛋白及其毒株识别的受体为宿主细胞分泌的唾液酸α2,3或α2,6寡糖。

下述实施例中，所用式Ⅻ化合物的合成(m＝5也即N3-PEG6-NH2为例)方法如下：

化合物1的合成：六聚乙二醇(1.41g,5mmol)溶解在三乙胺(3.5mL,25mmol)和干燥二氯甲烷(100mL)中，冰浴，缓慢加入对苯甲磺酰氯(2.4g,15mmol)室温搅拌24小时。TLC(EtOAc)检测反应完成。加入二氯甲烷(200mL)稀释,依次用1MHCl﹑饱和NaHCO3以及饱和NaCl萃洗，有机相用无水Na2SO4干燥。过滤除去无水Na2SO4后，将有机相减压蒸干溶剂，所得混合物经硅胶柱层析分离纯化(2:1EtOAc/hexanes)，得无色油状产物(2.62g,90％).1H NMR(500MHz,chloroform-d)d:2.42(s,6H),3.55(s,8H),3.56–3.62(m,8H),3.63–3.68(m,4H),4.08–4.16(m,4H),7.28–7.36(m,4H),7.73–7.81(m,4H).13C NMR(125MHz,chloroform-d)d:21.56,68.58,69.19,70.42,70.47,70.52,70.65,127.91,129.78,132.89,144.77.

化合物2的合成：化合物1(1g,1.7mmol)溶于DMF(10mL)中，加入叠氮钠(663mg,10.2mmol)80℃搅拌反应24h.TLC(EtOAc)检测反应完成。加水(50mL)稀释，用EtOAc(2*75mL)萃取。合并有机相，用饱和NaCl萃洗(2*30mL)萃洗,有机相用无水Na2SO4干燥。过滤除去无水Na2SO4后，将有机相减压蒸干溶剂。得淡黄色油状产物(510mg,90％)。1H NMR(500MHz,chloroform-d)d:3.61(m,20H),3.34(m,3H).13CNMR(125MHz,chloroform-d)d:70.6.70.5,70.4,70.3,69.1,50.1.

式Ⅻ所示化合物的合成：化合物2(600mg,1.8mmol)溶于10ml乙酸乙酯和2ml1MHCl中，加入Ph3P(520mg,1.98mmol),室温搅拌12h,TLC(EtOAc)检测反应完成。回收水相，并用(3ml*3)萃洗有机相，合并水相，减压蒸干溶剂。经碱性Al2O3层析柱(10:1EtOAc/MeOH)纯化，得淡黄色油状产物(441mg,80％)。1H NMR(500MHz,CD3OD)d3.71–3.68(m,br,10H),3.48(t,1H),3.08–3.04(m,1H)13C NMR(125MHz,CD3OD)d69.4,69.0,68.2,67.8,49.9(CH2N3),39.1(CH2NH3).EIMS calcd for C12H27N4O3(Mt):307.198,found:307.267.

下述实施例中所用式X所示和式XI所示唾液酸寡糖丙炔苷的合成方法如下：

1、式X所示唾液酸寡糖丙炔苷的制备

取化合物3(终浓度为10mM)和197.5毫克CMP-N-乙酰神经氨酸(CMP-Neu5Ac，终浓度为15mM)溶于20毫升的Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液中后，将反应体系温度升至37℃，然后加入500微升Pm2,3-ST(1U)，2-3小时后，薄层色谱(TLC)检测原料已完全消失，将反应液通过超滤膜除去酶蛋白，冷冻干燥浓缩后经凝胶柱G-15纯化后得式Ⅹ化合物。

2、式XI所示唾液酸寡糖丙炔苷的制备

取化合物4(终浓度为10mM)和197.5毫克CMP-N-乙酰神经氨(CMP-Neu5Ac，终浓度为15mM)溶于20毫升的Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液中后，将反应体系温度升至37℃，然后加入500微升Pd2,6-ST(1U)，2-3小时后，薄层色谱(TLC)检测原料已完全消失，将反应液通过超滤膜除去酶蛋白，冷冻干燥浓缩后经凝胶柱G-15纯化后得式Ⅺ化合物。

实施例1、唾液酸寡糖-磁纳米粒子的制备

1、磁纳米粒子(Fe3O4)的制备

聚苯乙烯磺酸-马来酸共聚物钠盐(PSSMA 3:1，1g)加到20mL乙二醇中搅拌溶解,随后加入六水合氯化铁(0.54g)、无水乙酸钠(1g)，搅拌到完全溶解。然后将上述溶液转移到25毫升含聚四氟乙烯内衬的高压水热反应釜中，将反应釜置于预先加热至200℃的烘箱中，加热反应10小时。取出反应釜自然冷却至室温，用磁分离的方法分离出磁性微球，用纯水洗涤除去未反应的反应物和副产物，真空干燥，制备出超顺磁四氧化三铁微球(Fe3O4)。

2、Fe3O4@PMAA的制备

四氧化三铁磁纳米粒子(Fe3O4)表面修饰MPS方法如下：

MCNCs(0.15g)超声溶解在乙醇(20ml)和纯水(5ml)中,加入氨水(0.75ml)和MPS(0.15g)，60℃下机械搅拌24小时。用磁分离法分离Fe3O4@MPS，用纯水洗涤除去未反应的反应物和副产物，真空干燥。

利用回流沉淀聚合法在Fe3O4@MPS上包被PMAA(聚丙烯酸)层：

在乙腈中，MAA作为单体，MBA作为交联剂，由AIBN引发聚合反应。具体操作如下，Fe3O4@MPS(75mg)超声溶解在ACN(60ml)中，作为纳米核心种子。依次加入MAA(300mg),MBA(75mg)和AIBN(7.5mg),90℃回流1个小时，冷却到常温，用磁分离法分离Fe3O4@PMAA，用乙醇洗涤除去未反应的反应物和副产物，真空干燥。

3、唾液酸寡糖-磁纳米粒子的制备

通过酰胺缩合反应将式Ⅻ化合物(以N3-PEG6-NH2为例)连接到Fe3O4@PMAA表面，制备出Fe3O4@PEG6-N3；具体操作如下：

将Fe3O4@PMAA(100mg)超声溶解在干燥DMF(40ml)中，冰浴，加入HATU(200mg),震荡10分钟，加入N3-PEG6-NH2(400mg)和DIPEA(0.5ml)，然后室温振荡反应72小时，用磁分离法分离Fe3O4@PEG6-N3，依次用DMF，纯水和乙醇洗涤，除去未反应的反应物和副产物，真空干燥。

再通过Click反应将式Ⅹ或式Ⅺ化合物(以S2,6SL为例，其中，R¹为乙酰氨基，R²为氢，R³为氢，R⁴为羟基)连接到Fe3O4@PEG6-N3表面；具体操作如下：

N2保护下，将催化剂Cu2SO4·5H2O(1mg)和抗坏血酸钠(10mg)加入到水(6ml)和DMF(6ml)中，超声混匀10分钟，加入S2,6SL(2mg),继续超声10分钟，最后加入Fe3O4@PEG6-N3(20mg),室温震荡反应24小时，用磁分离法分离终产物唾液酸寡糖-磁纳米粒子Fe3O4@S2,6LN，依次用DMF，纯水和乙醇洗涤，除去未反应的反应物和副产物，唾液酸寡糖-磁纳米粒子Fe3O4@S2,6LN用PBST(0.05％Tween-20)溶解,浓度(1mg/ml)，长久保存于4℃备用。

图1中左图为本发明中制备的磁纳米粒子(Fe3O4)的TEM图像，右图为制备的唾液酸寡糖-磁纳米粒子中的Fe3O4@S2,6LN的TEM图像。

图2为本发明中制备唾液酸寡糖-磁纳米粒子过程中，各步骤得到的磁纳米的磁滞曲线变化。

图3为本发明中制备唾液酸寡糖-磁纳米粒子过程中，各步骤得到的磁纳米的红外光谱变化。

由图可知，红外光谱由上到下依次为Fe3O4，Fe3O4@MPS，Fe3O4@PMAA,Fe3O4@PEG6-N3,Fe3O4@S2,6LN的红外吸收。当Fe3O4@PMAA被成功修饰上-N3基团后，在2100cm^-1的位置出现了-N3基团的特征吸收峰。之后，当-N3基团和式Ⅹ或式Ⅺ化合物发生Click反应后，-N3基团的特征吸收峰消失，证明了Click反应的发生，磁纳米粒子表面成功的被修饰上了唾液酸寡糖。

实施例2、唾液酸寡糖-磁纳米粒子富集分离流感病毒HA蛋白，并检验其宿主特异性

1.样品制备：

分别取125μl的实施例1所得唾液酸寡糖-磁纳米粒子PBST溶液(1mg/ml)置于各1.5ml离心管中，用磁分离架分离，再用200μlPBS洗两遍；

用200μl 3％BSA(PBS溶解)封闭，30℃震荡1.5h；

用100μl 1％BSA溶解，加入1μgHA蛋白(流感病毒vieH5HA蛋白或流感病毒09H1HA蛋白)，混匀，4℃孵育1h，用磁分离架分离，200μlPBST(0.05％Tween-20)洗两遍；

加入40μlPBS和10μl5×蛋白上样缓冲液,混匀，煮沸10min，用磁分离架分离，上清保存待用。

2.电泳：

制备10％的分离胶和5％的浓缩胶；

上样。待浓缩胶聚合后，加入1×电泳缓冲液，小心拔出梳子，并用缓冲液清洗上样孔，用加样器缓慢上样；

电泳。首先将电压调整至80V，当样品进入分离胶后，调整电压至120V继续电泳。当溴酚蓝到达底部时结束电泳。

3.转膜(采用湿法转膜系统)

小心撬开玻璃板，根据目的蛋白的位置对凝胶进行切割，裁剪合适尺寸的滤纸和PVDF膜。将凝胶和滤纸放入转膜缓冲液中进行平衡，PVDF膜先用甲醇处理2min后再放入转膜缓冲液中平衡；

从正极到负极的顺序依次三层滤纸，PVDF膜，胶，三层滤纸安装转移装置，小心除去气泡；

接通电源，100V恒压转移70min。

4.抗体孵育及显影

封闭。转移结束后，将PVDF膜用5％脱脂奶粉室温封闭1h；

一抗孵育。用5％脱脂奶粉稀释一抗(抗相应亚型流感病毒HA的兔多抗)，然后将膜放入其中4℃孵育过夜

洗膜。1×TBST漂洗，10min×3次

二抗孵育。辣根过氧化物酶标记的二抗用5％脱脂奶粉稀释，室温孵育2h

洗膜。1×TBST漂洗，10min×3次

显影。用纸巾小心吸干PVDF膜上的液体，与胶接触的一面朝上放在保鲜膜上。将A、B发光也按1：1比例混合后均匀加于PVDF膜上，反应1分钟后将PVDF膜用保鲜膜包好固定于压片盒中；覆以X光片，合夹曝光。根据第一张胶片的显影情况，调整曝光时间。冲洗X光片，晾干。扫描保存与分析。

图4为本发明用唾液酸寡糖(SLN)-磁纳米粒子富集分离流感病毒vieH5HA蛋白，并检验其宿主特异性的结果，结果证明，VieH5HA蛋白只与Fe3O4@S2,3LN结合，Fe3O4@S2,3LN能够富集分离流感病毒vieH5HA蛋白。同时也证明了VieH5流感病毒的宿主特异性为禽源。

图5为本发明用唾液酸寡糖(SLN)-磁纳米粒子富集分离流感病毒09H1HA蛋白，并检验其宿主特异性的结果，结果证明，09H1HA蛋白只与Fe3O4@S2,6LN结合，Fe3O4@S2,6LN能够富集分离流感病毒09H1HA蛋白。同时也证明了09H1流感病毒的宿主特异性为人源。

实施例3、唾液酸寡糖-磁纳米粒子富集分离流感病毒，并检验其宿主特异性的方法

分别取125μl实施例1所得唾液酸寡糖-磁纳米粒子PBST溶液(1mg/ml)置于各1.5ml离心管中，用磁分离架分离，再用200μlTBS洗两遍；

用200μl 3％BSA(TBS溶解)封闭，30℃震荡1.5h；

加入各浓度梯度的待富集分离的某亚型流感病毒(用1％BSA稀释)100μl，混匀，4℃孵育5h，用磁分离架分离，200μlTBST(0.05％Tween-20)洗两遍；

加入抗相应亚型流感病毒HA的兔多抗(用1％BSA稀释)100μl,混匀，4℃孵育过夜，用磁分离架分离，200μlTBST(0.05％Tween-20)洗两遍；

加入碱性磷酸酶标记的山羊抗兔二抗(用1％BSA稀释)100μl,混匀，4℃孵育2h，用磁分离架分离，200μlTBST(0.05％Tween-20)洗4遍；

加入PNPP底物溶液(1.25mg/ml)100μl,37℃震荡30min后,加入3M NaOH终止反应，用酶标仪在405nm波长下读取吸光值。

图6为本发明用唾液酸寡糖(SLN)-磁纳米粒子富集分离vieH5流感病毒，并检验其宿主特异性的结果。结果证明，VieH5流感病毒只与Fe3O4@S2,3LN结合，Fe3O4@S2,3LN能够富集分离vieH5流感病毒，但随着VieH5流感病毒的增多，Fe3O4@S2,3LN的富集分离能力趋于饱和。同时也证明了VieH5流感病毒的宿主特异性为禽源。

图7为本发明用唾液酸寡糖(SLN)-磁纳米粒子富集分离09H1流感病毒，并检验其宿主特异性的结果。结果证明，09H1流感病毒只与Fe3O4@S2,6LN结合，Fe3O4@S2,6LN能够富集分离09H1流感病毒，但随着09H1流感病毒的增多，Fe3O4@S2,6LN的富集分离能力趋于饱和。同时也证明了09H1流感病毒的宿主特异性为人源。

图8为本发明用唾液酸寡糖(SLN)-磁纳米粒子分别富集分离vieH5或09H1流感病毒后的TEM图像。结果也证明，09H1流感病毒只与Fe3O4@S2,6LN结合，而VieH5流感病毒只与Fe3O4@S2,3LN结合。

图9为本发明用唾液酸寡糖(SLN)-磁纳米粒子富集分离anhH7流感病毒，并检验其宿主特异性的结果。结果证明，anhH7流感病毒不仅能与Fe3O4@S2,6LN结合，而且可以和Fe3O4@S2,3LN结合，两种磁纳米粒子都能够富集分离anhH7流感病毒但随着anhH7流感病毒的增多，两种磁纳米粒子的富集分离能力都趋于饱和。同时也证明了anhH7流感病毒的宿主特异性为人源和禽源共患。

图10为本发明用唾液酸寡糖(SLN)-磁纳米粒子富集分离68H3流感病毒，并检验其宿主特异性的结果。结果证明，68H3流感病毒只与Fe3O4@S2,6LN结合，Fe3O4@S2,6LN能够富集分离68H3流感病毒，但随着68H3流感病毒的增多，Fe3O4@S2,6LN的富集分离能力趋于饱和。同时也证明了68H3流感病毒的宿主特异性为人源。

实施例4、利用受体特异性的偏好，实现对人流感和禽流感病毒的选择性富集分离的方法：

分别取125μl实施例1所得唾液酸寡糖-磁纳米粒子PBST溶液(1mg/ml)置于各1.5ml离心管中，用磁分离架分离，再用200μlTBS洗两遍；

用200μl 3％BSA(TBS溶解)封闭，30℃震荡1.5h；

加入各浓度梯度的待富集分离的混合亚型流感病毒(用1％BSA稀释)100μl，混匀，4℃孵育5h，用磁分离架分离，200μlTBST(0.05％Tween-20)洗两遍；

加入抗相应亚型流感病毒HA的鼠单抗(用1％BSA稀释)100μl,混匀，4℃孵育过夜，用磁分离架分离，200μlTBST(0.05％Tween-20)洗两遍；

加入碱性磷酸酶标记的山羊抗鼠二抗(用1％BSA稀释)100μl,混匀，4℃孵育2h，用磁分离架分离，200μlTBST(0.05％Tween-20)洗4遍；

加入PNPP底物溶液(1.25mg/ml)100μl,37℃震荡30min后,加入3M NaOH终止反应，用酶标仪在405nm波长下读取吸光值。

图11为本发明根据流感病毒受体特异性，用唾液酸寡糖(SLN)-磁纳米粒子选择性富集分离09H1流感病毒的结果。结果证明，Fe3O4@S2,6LN能够选择性富集分离09H1流感病毒，vieH5流感病毒的存在并不影响Fe3O4@S2,6LN富集分离09H1流感病毒。

图12为本发明根据流感病毒受体特异性，用唾液酸寡糖(SLN)-磁纳米粒子选择性富集分离vieH5流感病毒的结果。结果证明，Fe3O4@S2,3LN能够选择性富集分离vieH5流感病毒，09H1流感病毒的存在并不影响Fe3O4@S2,3LN富集分离vieH5流感病毒。