本发明涉及纤维二糖的制备方法，尤其涉及多酶分子机器催化将蔗糖转化为纤维二糖的方法，属于纤维二糖的酶催化生产领域。
背景技术：
纤维二糖（cellobiose），学名4-o-β-d-葡萄吡喃苷基-d-葡萄吡喃糖，分子式c12h22o11，它是由两分子葡萄糖单元通过β-1,4糖苷键构成。它是纤维素水解的产物，也是纤维素的基本结构单元。纤维二糖被认为是“零热量”的甜味剂，其甜度约为蔗糖的30%左右。近年来，研究证明纤维二糖作为益生元可促进人体自身肠道内益生菌的生长与增殖，从而促进体内微生态的正向平衡，全面提高人体免疫力，因此其具有很好的医用开发前景。纤维二糖一定程度上还可以预防高脂血症、高血压病、心脏病、糖尿病、肥胖病等多种疾病。此外，纤维二糖还可作为饲料添加剂应用在水产养殖、畜牧业、家禽饲养业等领域，可以有效地降低饲料中抗生素的用量，提高了养殖效率。近年来，纤维二糖应用领域不断拓展，使得纤维二糖的消费量逐年上升，具有很大的市场潜力。随着世界经济状况的逐渐好转，生活水平的提高，纤维二糖的消费量还有继续增加的趋势。然而，由于目前纤维二糖的高售价，使得其市场前景还未得到充分的开发。中国是生产纤维二糖的主要国家之一，欧洲是目前主要的消费市场，主要用于保健品和食品饲料行业。预计今后一段时间内，纤维二糖的供应将更为紧缺，市场行情继续看好。
目前纤维二糖的生产主要还是通过传统的高温水解或生物酶解纤维素类原料。其中，高温水解工艺设备材质要求严格，一次性投资大，且水解反应选择性低，水解产物组成复杂（含有纤维多糖等），粗产品精制工艺复杂，损失较多，生产成本较高，因此限制了原材料利用率的提高；同时，该工艺会产生大量的酸污染物，对水源，环境污染严重。目前研究纤维二糖生产的热点集中在微生物法、生物酶解法等，然而上述工艺均不同程度的存在原料成本高、产率低等问题。
因此，亟待开发一种低成本、低污染、高产率的生产纤维二糖的新方法。针对上述问题，本专利提出了一种纤维二糖的酶催化转化方法，利用来源广泛且价廉的蔗糖作为底物，通过体外多酶分子机器催化的方法生产纤维二糖。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是提供一种纤维二糖的酶催化转化方法，通过多酶分子机器将蔗糖生产纤维二糖的方法，该方法具有纤维二糖产率和原料转化率高，生产成本低，无污染等优点。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
本发明首先公开了一种纤维二糖的制备方法，包括以下步骤：
（1）以蔗糖为底物，加入蔗糖磷酸化酶（sucrosephosphorylase，ec2.4.1.7），葡萄糖异构酶（glucoseisomerase，ec5.3.1.5）和纤维二糖磷酸化酶（cellobiosephosphorylase，ec2.4.1.20）建立多酶分子机器反应体系，进行多酶分子机器催化反应。
其中，步骤（1）中蔗糖的浓度为100mm；所述蔗糖磷酸化酶的用量为1.0u/ml，所述葡萄糖异构酶的用量为1.0u/ml，所述纤维二糖磷酸化酶的用量为1.0u/ml；所述酶催化反应的条件是在40~60℃下反应10~50小时。
由于所述多酶反应体系涉及用酶均具有较好的热稳定性，因此所述多酶分子机器催化反应温度可提高到45℃以上，能够有效提高纤维二糖的得率和原料的转化效率；优选的，所述底物的浓度为100mm；所述蔗糖磷酸化酶的用量为1.0u/ml，所述葡萄糖异构酶的用量为1.0u/ml，所述纤维二糖磷酸化酶的用量为1.0u/ml；所述酶催化反应的条件是在45℃反应25小时。更优选的，为了进一步提高多酶分子机器催化反应的转化效率，可以通过优化催化体系的酶量比，提高中间产物转化效率，最终提高纤维二糖的转化效率；其中，所述优化的蔗糖磷酸化酶的用量为0.5u/ml，所述葡萄糖异构酶的用量为1.0u/ml，所述纤维二糖磷酸化酶的用量为1.5u/ml；所述酶催化反应的条件是在45℃反应15小时。
所述多酶分子机器反应体系还含有以下各成分：缓冲液、无机磷酸盐、二价镁离子和锌离子或锰离子；各成分的用量为：优选的ph7.2的缓冲液100mm，无机磷酸根10~50mm，二价镁离子5mm；其中，所述无机磷酸根优选为10mm；所述缓冲液优选为hepes缓冲液。
所属多酶体系中蔗糖磷酸化酶和纤维二糖磷酸化酶均通过在大肠杆菌中重组表达获得。其中，蔗糖磷酸化酶来源于t.thermosaccharolyticum；纤维二糖磷酸化酶来源于c.thermocellum；优选的，为了提高重组蔗糖磷酸化酶在大肠杆菌bl21(de3)中的表达，可以通过对该基因进行全序列稀有密码子优化（序列信息见附件），其整体表达量相较野生型表达提高近4倍；更优选的，为了进一步提高蔗糖磷酸化酶在大肠杆菌bl21(de3)中的可溶性表达，可以通过向优化的蔗糖磷酸化酶基因的特异性位点选择性插入同义稀有密码子（序列信息见附件），该优选基因的可溶性表达相较野生型提高了近5倍，这也为重组蔗糖磷酸化酶的表达纯化提供便利。
本发明以蔗糖为底物，加入蔗糖磷酸化酶，葡萄糖异构酶和纤维二糖磷酸化酶，配制多酶反应体系，多酶分子机器催化途径包括：由蔗糖磷酸化酶将蔗糖中的一个葡萄糖单元转化为葡萄糖-1-磷酸并产生果糖；由葡萄糖异构酶将果糖转化为葡萄糖；由纤维二糖磷酸化酶将一个葡萄糖单元与葡萄糖-1-磷酸结合并转化为纤维二糖。该催化过程可以将蔗糖中所有的糖单元转化为纤维二糖，从而可以提高纤维二糖的得率和转化率。由于该催化体系反应可在高温条件（40~60℃）下进行，因此反应平衡偏向纤维二糖合成方向进行，相较常温酶催化体系该多酶体系能够实现更高的纤维二糖合成效率。
本发明多酶反应体系中的任何一种酶还可以为任何一种具有同等功能的酶所替换，优选为通过蛋白质工程改造所获得的具有同等功能的赖高温突变酶。
本发明体外多酶分子机器催化将蔗糖转化为纤维二糖试验中，在一个反应体系中，以蔗糖为原料，加入蔗糖磷酸化酶，葡萄糖异构酶和纤维二糖磷酸化酶，30℃进行催化反应25小时，最终蔗糖转化率为26.8%。在上述反应温度提高至45℃反应25小时，最终蔗糖的转化率达到61.2%，原料利用率显著提高。另外，通过调节多酶分子机器催化体系的酶量，优选的多酶反应体系蔗糖磷酸化酶、葡萄糖异构酶、纤维二糖磷酸化酶的酶量比0.5:1.0:1.5，可显著缩短整体反应时间至12小时，从而进一步提高纤维二糖的合成效率。
本发明技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：
本发明在一个多酶反应体系中，以蔗糖以及其衍生物为原料，通过体外多酶分子机器催化转化为纤维二糖，并通过新型高温酶制剂的选择、过程优化以及改变反应进程，使原料转化效率显著提高，高得率和高转化率又大大降低纤维二糖的分离成本。本发明方法具有简便，原料利用率高、纤维二糖转化率高，生产成本低，污染低等优点，可以实现纤维二糖的规模化生产。
本发明所涉及到的术语及定义
除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。
术语“酶催化反应”意指在生物催化剂-酶作用下进行的化学反应。
附图说明
图1为转化蔗糖生成纤维二糖的体外多酶分子机器催化途径的示意图；其中，sp，蔗糖磷酸化酶；gi，葡萄糖异构酶；cbp，纤维二糖磷酸化酶；
图2为sds-page检测优选的蔗糖磷酸化酶基因表达情况；其中wt-tthe_sp，野生型蔗糖磷酸化酶基因；co-tthe_sp，密码子优化的蔗糖磷酸化酶基因；m-tthe_sp，插入特异性同义稀有密码子的蔗糖磷酸化酶基因；t为全细胞破碎液，s为可溶性蛋白组分，p为不可溶蛋白组分；
图3为sds-page检测2个关键酶的表达纯化情况；其中，tthe_sp,蔗糖磷酸化酶；cthe_cbp，纤维二糖磷酸化酶；t为全细胞破碎液，p为纯化蛋白；
图4为转化蔗糖生成纤维二糖的体外多酶分子机器催化体系在不同反应温度下纤维二糖过程产率示意图；
图5为优选的转化蔗糖生成纤维二糖的体外多酶分子机器催化体系模拟与实际生产纤维二糖的过程分析图；
图6为优选的转化蔗糖生成纤维二糖的体外多酶分子机器催化体系在不同无机磷酸根浓度下模拟与实际的纤维二糖转化效率示意图；
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
实验材料
蔗糖（sucrose），sigma-aldrich公司产品，产品编号：424490020；
pet20b载体，novagen，madison，wi，usa；
大肠杆菌表达菌bl21(de3)，invitrogen，carlsbad，ca，usa；
本发明中的大部分酶能在sigma-aldrich公司购买得到；但是都可以按照基因工程方法通过原核表达获得；
实验例1体外多酶分子机器催化将蔗糖转化为纤维二糖
通过一个体外多酶分子机器催化体系将蔗糖转化为纤维二糖（图1）。这些关键酶包括：（1）蔗糖磷酸化酶（sp，ec2.4.1.7），催化蔗糖分解成为葡萄糖-1-磷酸和果糖；（2）葡萄糖异构酶（gi，ec5.3.1.5），催化葡萄糖转化为果糖；（3）纤维二糖磷酸化酶（cbp，ec2.4.1.20），其催化葡萄糖和葡萄糖-1-磷酸转化为纤维二糖。由于所述多酶分子机器催化体系所用酶热稳定较好，因此该体系可以在较高温度条件下进行，相较常（低）温催化过程该体系能够实现更高的纤维二糖转化效率。
在本发明中，蔗糖磷酸化酶来源于菌株thermoanaerobacteriumthermosaccharolyticum，基因在kegg上的编号为tthe_1921；葡萄糖异构酶来源于streptomycesmurinus；纤维二糖磷酸化酶来源于clostridiumthermocellum，基因在kegg上的编号为cthe_0275，这些基因组dna都可从atcc的官方网站（www.atcc.org）上获得。其中，蔗糖磷酸化酶sp和纤维二糖磷酸化酶cbp基因分别用不同的引物从相应的基因组dna中通过pcr获取，并通过simplecloning（you,c.,etal.(2012)."simplecloningviadirecttransformationofpcrproduct(dnamultimer)toescherichiacoliandbacillussubtilis."appl.environ.microbiol.78(5):1593-1595.）的方法克隆至pet20b载体((novagen,madison,wi)中，获得相应的表达载体pet20b-ttsp和pet20b-ctcbp。优选的，为了提高蔗糖磷酸化酶在大肠杆菌中的表达，对野生型蔗糖磷酸化酶基因进行密码子优化，得co-tthe_sp基因，该基因整体蛋白表达水平相较野生型提高近4倍（图2）。更优选的，为了进一步提高优化的蔗糖磷酸化酶在大肠杆菌中的可溶性表达，通过向co-tthe_sp基因中特异性位点选择性插入同义稀有密码子（m-tthe_sp，序列信息见附件），该优选基因的可溶性表达相较野生型提高了近5倍（图2）。最终，将重组质粒pet20b-mttsp和pet20b-ctcbp都转化至大肠杆菌表达菌bl21(de3)(invitrogen,carlsbad,ca)中，并进行蛋白质表达与纯化，结果如图3所示。另外，葡萄糖异构酶gi购于sigma-aldrich公司，其产品编号为g4166。
在一个1.0毫升的反应体系中含有100mm的hepes缓冲液（ph7.2），10mm的无机磷酸根，5mm的二价镁离子，1.0u/ml的蔗糖磷酸化酶，1.0u/ml的葡萄糖异构酶和1.0u/ml纤维二糖磷酸化酶，100mm的蔗糖，在30℃条件下进行催化反应，反应25个小时。反应结束后，纤维二糖的浓度是26.8mm，蔗糖转化率为26.8%（图4）。
实验例2体外多酶分子机器催化将蔗糖转化为纤维二糖
蔗糖磷酸化酶、葡萄糖异构酶和纤维二糖磷酸化酶的制备同实验例1。
在一个1.0毫升的反应体系中含有100mm的hepes缓冲液（ph7.2），10mm的无机磷酸根，5mm的二价镁离子，1.0u/ml的蔗糖磷酸化酶，1.0u/ml的葡萄糖异构酶和1.0u/ml纤维二糖磷酸化酶，100mm的蔗糖，在60℃条件下进行催化反应，反应25个小时。反应结束后，纤维二糖的浓度是10.6mm，蔗糖转化率为10.6%（图4）。相同的催化体系于45~50℃下进行纤维二糖合成反应，25个小时反应后，纤维二糖的浓度是61.2mm，蔗糖转化率为61.2%（图4）。
实验例3通过过程优化，利用体外多酶分子机器催化将蔗糖转化为纤维二糖
由于本专利所述的多酶分子机器催化体系所用酶均催化双向可逆反应，因此整体催化过程会受到很多因素的影响，尤其是酶量对于整体催化效率起到至关重要的作用。为了提高纤维二糖的转化效率，本发明针对性地对该多酶体系的酶量比进行优化以实现纤维二糖的高效率转化。
结合过程催化动力学模拟最终确定优化的反应体系为：在一个1.0毫升的反应体系中含有100mm的hepes缓冲液（ph7.2），10mm的无机磷酸根，5mm的二价镁离子，0.5u/ml的蔗糖磷酸化酶，1.0u/ml的葡萄糖异构酶和1.5u/ml纤维二糖磷酸化酶，100mm的蔗糖；该催化体系在45℃条件下反应12个小时，反应结束后，纤维二糖的终浓度为61.5±1.2mm，蔗糖转化率达到了61.5%，如图5所示。
实验例4通过条件优化，利用体外多酶分子机器催化将蔗糖转化为纤维二糖
由于所述的多酶分子机器催化体系反应始末均有无机磷酸根的参与，因此磷酸根（作为sp催化底物和cbp催化产物）的浓度也会对整体催化过程产生影响。为了提高纤维二糖的转化效率，本发明针对性地对该催化体系所用无机磷酸根浓度进行优化以实现纤维二糖的高效率转化。
在一个1.0毫升的反应体系中含有100mm的hepes缓冲液（ph7.2），5mm的二价镁离子，0.5u/ml的蔗糖磷酸化酶，1.0u/ml的葡萄糖异构酶和1.5u/ml纤维二糖磷酸化酶，100mm的蔗糖；其中，所述体系中无机磷酸根浓度控制在10~100mm，各组催化过程分别在45℃条件下进行直至反应达到平衡。反应结束后，发现优选的10mm无机磷酸根可以实现100mm蔗糖的最高转化效率，结果如图6所示。
sequencelisting
<110>中国科学院天津工业生物技术研究所
<120>多酶催化制备纤维二塘的方法
<130>
<160>3
<170>patentinversion3.3
<210>1
<211>1467
<212>dna
<213>thermoanaerobacteriumthermosaccharolyticum
<400>1
atggctctgaaaaataaagtgcaactgattacctacccggatagcctgggcggtgaccta60
aaaaccctgaacgatgtgctggaaaaatacttcagcgacgtttttggcggtgtccatatt120
ctgccgccgttcccgagctctggtgatcgtggttttgcgccgattacctactctgaaatc180
gaaccgaaattcggcacgtggtacgatattaagaaaatggccgaaaacttcgacatcctg240
ctggatctgatggtcaatcacgtgagtcgtcgctccatttactttcaggattttctgaag300
aaaggccgcaaaagtgaatatgcggatatgtttattaccctggacaaactgtggaaagat360
ggcaaaccggtgaaaggtgatatcgaaaaaatgttcctgcgtcgcaccctgccgtactcc420
acgtttaaaattgaagaaaccggcgaagaagaaaaagtttggaccacgttcggtaaaacg480
gatccgtcagaacagatcgacctggatgtgaactcgcatctggcaaaagaatttctgctg540
ggcgttttcaaaaccttctcaaacttcggtgttaatattgtccgtctggatgctgtgggc600
tatgttattaagaaaattggcacgtcgtgctttttcgtggaaccggaaatttacgaattt660
ctggattggatcaaaggccaggcggccagttatggtattgaactgctgctggaagtccac720
tcccagttcgaagtgcaatataaactggccgaacgtggctttctgatttacgacttcatc780
ctgccgtttaccgttctgtatacgctgatcaacaaaagtaacgaaatgctgtacgattac840
ctaaaaaaccgcccgattaatcagtttaccatgctggactgccatgatggcattccggtc900
aaaccggacctggatggtctgatcgacaccaagaaagcgaaagaagtggttgatatttgt960
gttcagcgtggcgccaacctaagcctgatctatggtgataaatacaaatctgaagacggc1020
ttcgatgtgcaccaaatcggttgcacctattacagcgcgctgaattgtgatgacgatgcg1080
tatctggcagctcgcgccattcagtttttcacgccgggcatcccgcaagtctattacgtg1140
ggcctgctggcaggtgttaatgattttgaagctgtcaaacgtaccaaagaaggccgtgaa1200
attaaccgccataattacggtctgaaagaaatcgaagaatctgtgcagaagaaagcggtt1260
caacgcctgctgaaactgattcgtttccgcaacgaatatgaagctttcaatggtgaattt1320
atggtgcaggactgccaaaaagatgaaattcgtctgacctggaagaaagatgataaacgc1380
tgtagcctgtttatcgatctgaaaacctacaaaacgacgattgactacattaacgaaaac1440
ggcgaagaagtgaaatacctggtgtaa1467
<210>2
<211>1527
<212>dna
<213>人工序列
<400>2
atggctctgaaaaataaagtgcaactgattacctacccggatagcctgggcggtgacctg60
atggctctgaaaaataaagtgcaactgattacctacccggatagcctgggcggtgacctg120
aaaaccctgaacgatgtgctagaaaaatacttcagcgacgtttttggcggtgtccatatt180
ctgccgccgttcccgagctctggtgatcgtggttttgcgccgattacctactctgaaatc240
gaaccgaaattcggcacgtggtacgatattaagaaaatggccgaaaacttcgacatcctg300
ctggatctgatggtcaatcacgtgagtcgtcgctccatttactttcaggattttctgaag360
aaaggccgcaaaagtgaatatgcggatatgtttattaccctggacaaactgtggaaagat420
ggcaaaccggtgaaaggtgatatcgaaaaaatgttcctgcgtcgcaccctgccgtactcc480
acgtttaaaattgaagaaaccggcgaagaagaaaaagtttggaccacgttcggtaaaacg540
gatccgtcagaacagatcgacctggatgtgaactcgcatctggcaaaagaatttctgctg600
ggcgttttcaaaaccttctcaaacttcggtgttaatattgtccgtctggatgctgtgggc660
tatgttattaagaaaattggcacgtcgtgctttttcgtggaaccggaaatttacgaattt720
ctggattggatcaaaggccaggcggccagttatggtattgaactgctgctggaagtccac780
tcccagttcgaagtgcaatataaactggccgaacgtggctttctgatttacgacttcatc840
ctgccgtttaccgttctgtatacgctgatcaacaaaagtaacgaaatgctgtacgattac900
ctgaaaaaccgcccgattaatcagtttaccatgctggactgccatgatggcattccggtc960
aaaccggacctggatggtctgatcgacaccaagaaagcgaaagaagtggttgatatttgt1020
gttcagcgtggcgccaacctgagcctgatctatggtgataaatacaaatctgaagacggc1080
ttcgatgtgcaccaaatcggttgcacctattacagcgcgctgaattgtgatgacgatgcg1140
tatctggcagctcgcgccattcagtttttcacgccgggcatcccgcaagtctattacgtg1200
ggcctgctggcaggtgttaatgattttgaagctgtcaaacgtaccaaagaaggccgtgaa1260
attaaccgccataattacggtctgaaagaaatcgaagaatctgtgcagaagaaagcggtt1320
caacgcctgctgaaactgattcgtttccgcaacgaatatgaagctttcaatggtgaattt1380
atggtgcaggactgccaaaaagatgaaattcgtctgacctggaagaaagatgataaacgc1440
tgtagcctgtttatcgatctgaaaacctacaaaacgacgattgactacattaacgaaaac1500
ggcgaagaagtgaaatacctggtgtaa1527
<210>3
<211>1527
<212>dna
<213>人工序列
<400>3
atggctctgaaaaataaagtgcaactgattacctacccggatagcctgggcggtgacctg60
atggctctgaaaaataaagtgcaactgattacctacccggatagcctgggcggtgacctg120
aaaaccctgaacgatgtgctagaaaaatacttcagcgacgtttttggcggtgtccatatt180
ctgccgccgttcccgagctctggtgatcgtggttttgcgccgattacctactctgaaatc240
gaaccgaaattcggcacgtggtacgatattaagaaaatggccgaaaacttcgacatactg300
ctagatctaatggtcaatcacgtgagtcgtcgctccatttactttcaggattttctgaag360
aaaggccgcaaaagtgaatatgcggatatgtttattaccctggacaaactgtggaaagat420
ggcaaaccggtgaaaggtgatatcgaaaaaatgttcctgcgtcgcaccctgccgtactcc480
acgtttaaaattgaagaaaccggcgaagaagaaaaagtttggaccacgttcggtaaaacg540
gatccgtcagaacagatcgacctggatgtgaactcgcatctggcaaaagaatttctgctg600
ggcgttttcaaaaccttctcaaacttcggtgttaatatagtccgactagatgctgtgggc660
tatgttattaagaaaattggcacgtcgtgctttttcgtggaaccggaaatttacgaattt720
ctggattggatcaaaggccaggcggccagttatggtatagaactactgctagaagtccac780
tcccagttcgaagtgcaatataaactggccgaacgtggctttctgatttacgacttcatc840
ctgccgtttaccgttctgtatacgctgatcaacaaaagtaacgaaatgctgtacgattac900
ctgaaaaaccgcccgattaatcagtttaccatgctggactgccatgatggcattccggtc960
aaaccggacctggatggtctgatcgacaccaagaaagcgaaagaagtggttgatatttgt1020
gttcagcgtggcgccaacctgagcctgatctatggtgataaatacaaatctgaagacggc1080
ttcgatgtgcaccaaatcggttgcacctattacagcgcgctgaattgtgatgacgatgcg1140
tatctggcagctcgcgccattcagtttttcacgccgggcatcccgcaagtctattacgtg1200
ggcctgctggcaggtgttaatgattttgaagctgtcaaacgtaccaaagaaggccgtgaa1260
attaaccgccataattacggtctgaaagaaatcgaagaatctgtgcagaagaaagcggtt1320
caacgcctgctgaaactgattcgtttccgcaacgaatatgaagctttcaatggtgaattt1380
atggtgcaggactgccaaaaagatgaaattcgtctgacctggaagaaagatgataaacgc1440
tgtagcctgtttatcgatctgaaaacctacaaaacgacgattgactacattaacgaaaac1500
ggcgaagaagtgaaatacctggtgtaa1527