一种里氏木霉表达盒及其重组菌株和应用的制作方法

专利名称：一种里氏木霉表达盒及其重组菌株和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种里氏木霉表达盒及其重组菌株和应用。
背景技术：
里氏木霉(7Hc/20^/77^ a^/)是高效的纤维素酶产生菌，其纤维素酶系
包括五种内切-卩-葡萄糖苷酶(EGI 、 EGII、 EGIII、 EGIV和EGV)、两种纤维二糖水解酶(CBHI禾口CBHII)和两种纤维二糖酶(BGI和BGII)，其中CBHI的含量最高，其表达量可达里氏木霉胞外分泌性蛋白总量的50%，而在诱导的情况下里氏木霉合成和分泌蛋白的总量最高可达到40 g/L。
里氏木霉的CBHI由单拷贝的^W基因编码，由此可见，调控其表达的AW启动子是一个很强的丝状真菌启动子，因此，利用^W基因启动子构建的里氏木霉表达系统被认为是一种有效的表达系统。
目前，国内外所构建的里氏木霉表达系统均使用c6W启动子调节外源基因的表达。芬兰的VTT生物技术实验室于1990年代率先构建了基于c^/启动子的里氏木霉表达系统，并进行了异源和同源蛋白的一系列表达(HaakanaH，Miettinen-oinonen A, Joutsjoki V. Enzyme Microb Technol. 2004, 34(2):159-167) 。 Mantyla等将真菌Chaetomium thermophilum中编码三个木聚糖酶的基因置于强启动子的控制之下，用此表达盒转化里氏木霉后获得了高效表达木聚糖酶的工程菌种。替换染色体的c6/27位点之后，EG1的产量是通常强纤维素分解菌所产CBHI量的2 或者与其一样多(Mantyla A, PaloheimoM， Haskola S. Appl Microbiol Biotechnol. 2007, 76(2): 377-386 )。Miettinen-Oinonen等用"2置换c6/z7，使其位于c6W启动子的下游表达(Miettinen-Oinonen A, Suominen PL. Appl Environ Microbiol 2002, 68(8):3956-3964)，结果发现，内切葡萄糖苷酶的活力比出发菌株增加2.3倍；再增加一个转化到里氏木霉中的g2表达盒的拷贝数，内切葡萄糖苷酶的活力比出发菌株增加3倍。汪天虹等构建了 P舰-《3-TebM表达盒，用《3基因替换了c6W基因，成功地实现了 EG 3在c6W启动子控制下的表达(Wang TH, Liu T，Wu ZH. ACTA Biochim Biophysica Sin. 2004, 36(10): 667-672)。
里氏木霉被广泛用来表达同源蛋白和异源蛋白(如来源于动物的基因)，而且里氏木霉在大规模生产条件中(高达3601113发酵液)的表现良好，特别适于蛋白的大量生产。然而，在里氏木霉中使用cM7基因启动子表达蛋白时必须使用纤维素、乳糖或槐二糖等进行诱导，而诱导不仅使WW基因启动子被激活，而且会使其它纤维素酶组分的启动子被激活。这将使表达液中杂蛋白的含量高， 一方面造成原料的浪费，另一方面不利于对表达产物进行分离纯化。
使用强的组成型启动子，利用里氏木霉高效的合成和分泌能力进行蛋白的表达可能是解决这一问题的有效手段。组成型启动子在以葡萄糖为碳源的培养基中不受阻遏，不需要诱导就可以启动目的基因的转录。对于里氏木霉而言，使用组成型启动子将可以避免产生过多的杂蛋白，因为里氏木霉所产生的胞外蛋白多是经诱导后产生的纤维素酶组分。
JoutsjokiVV等人就将酿酒酵母DPMl基因(编码甘露糖基磷酸多萜醇合成酶)的编码区插入到pLMRS3质粒中，在瑞氏木霉pki启动子和cbh2终止子控制下表达。在pFGl质粒(含有瑞氏木霉pyr4基因)存在下，与pLMRS3质粒一起对瑞氏木霉的一种pyr4阴性突变株TU-6进行共转化，然后筛选pyr4阳性转化子，得到4株多拷贝DPM1基因串联整合的稳定转化子。与受体菌株TU-6相比，转化子的甘露糖基磷酸多萜醇合成酶活力提高了 15-19倍，分泌的蛋白总量也提高了 4倍(JoutsjokiVV， KuittinenM， TorkkeliTK，Suominen PL. FEMS Microbiol Lett. 1993, 112(3): 281-286)。
甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GPD)是糖酵解和糖异生途径的关键酶，其编码基因在真菌中是被大量表达的管家基因。甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(g;^/)的启动子在一些真菌中被用于进行外源基因的表达，如毕赤酵母、酿酒酵母、构巢曲霉等。
木聚糖酶在食品工业、饲料工业、造纸工业和生物质能源工业中都得到广泛的运用。在生物质能源工业中，通过木聚糖酶可将半纤维素水解为可发酵糖，提高过程的效率。然而在有些工业应用过程，如造纸工业，需要使用不含纤维素酶的木聚糖酶。
里氏木霉不仅可以大量合成并分泌纤维素酶，而且也能分泌XYNI、XYNII 、 XYN m禾Q XYN IV等4种内切木聚糖酶，其中XYN I和XYNII的酶活力占发酵液总活力的90 %以上。？:中木聚糖酶的合成受木质纤维素、乳糖等的诱导，而且其合成过程与纤维素酶的合成同步，因此使用7>^^/野生菌株生产木聚糖酶时其中必定混有纤维素酶。XYNII作为Z ^M^主要的两禾中木聚糖酉每之——，已经在爿5pergz'〃us "/ger、5b/7/zasacc/zaram^ycas pom6e禾口 P/c/z/fl
幼^fe等宿主菌中实现了异源表达。由于表达后修饰的差异，使用7>^化/进
行XYNII的同源表达是理想的选择。然而，XYNlI在r ^"e/本身诱导型启动子的调控下表达时，表达量较低，而且混有纤维素酶，不能适用于某些工业应用过程。
迄今为止，利用里氏木霉的S^基因的启动子构建组成型表达系统在国内外尚未见报道，由此方法所构建的能高效表达不含纤维素酶的木聚糖酶的里氏木霉重组菌株在国内外亦未见报道。

发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种无需诱导即可表达来源于动物、植物或真菌的基因，且表达产物中杂蛋白少的里氏木霉表达盒。
本发明的另一个目的在于提供一种含有上述表达盒的表达载体。
本发明的另一个目的在于提供一种由上述表达盒和带有筛选标记的载体共转化里氏木霉制备而得的重组菌株。
本发明的另一个目的在于提供上述重组菌株的应用。
本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的
本发明的里氏木霉表达盒，是由里氏木霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的启动子序列(Pgpd)、外源目的基因和里氏木霉纤维二糖水解酶终止子序列(Tcbhl)组成。
上述里氏木霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的启动子序列(Pgpd)，其GeneBank的登录号为EF043568。
上述里氏木霉纤维二糖水解酶终止子序列(Tebhl)，其GeneBank的登录号为1405332。
本发明的里氏木霉表达盒，其制备方法如下(1)将Pgpd和TebM依次连接到表达载体中，构建得到重组表达载体l;这里所述的表达载体主要起大量拷贝本发明表达盒的作用，所以可以选择任何一种常用的表达载体，如原核表达载体pUC18等；
(2)将外源目的基因插入到上述重组表达载体1中，使外源目的基因位于
Pgpd和T删之间，得到重组表达载体2，然后以该重组表达载体2为模板，通过PCR扩增得到本发明的里氏木霉表达盒，该表达盒中含有Pgpd、外源目的基因和Tebhl，且外源目的基因位于Pgpd和Tebhl之间。
上述步骤(2)中，PCR扩增的扩增引物为上游引物P1，其核苷酸序列如SEQIDNO:l所示；下游引物P2，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。PCR扩增的反应条件以及反应液配方均可以参考本领域常用的试剂盒配方。
上述步骤(1)中，所述的将Pgpd和Tebw依次连接到表达载体中，可采用
限制性内切酶酶切和连接酶连接的方法将Pgpd和Tcbhl这两个片段依次连接到表达载体中；所述的限制性内切酶酶切以及连接酶连接都是本领域的常规做法。
上述步骤(2)中，所述将外源目的基因插入到上述重组表达载体1中，可采用限制性内切酶酶切和连接酶连接的方法将外源目的基因插入到重组表达载体1中；所述的限制性内切酶酶切以及连接酶连接都是本领域的常规做法。
一种重组菌株，该重组菌株是将本发明的里氏木霉表达盒和带有筛选标记的载体共转化里氏木霉原生质体，培养并筛选转化子制备而得，其具体制备步骤如下
(1) 将本发明的里氏木霉表达盒和带有筛选标记的载体一起共转化里氏木霉原生质体；
(2) 将上述转化后的原生质体进行筛选、再生后即可得到高效表达木聚糖酶的重组里氏木霉菌株，而且该重组菌株所表达的木聚糖酶不含纤维素酶。
上述步骤(1)中，带有筛选标记的载体其作用主要是用于后期阳性转化子的筛选，所以可以选择任何一种常用的筛选标记载体，对于里氏木霉来说，
本领域的人常用潮霉素进行筛选，所以这里可选择质粒pAN7-l (pAN7-l是本领域技术人员常用的带潮霉素抗性的真菌表达质粒)作为带有筛选标记的载体，和本发明的表达盒一起共转化，在后期进行筛选时，可采用潮霉素B作
为筛选剂，即可筛选出阳性转化子
上述步骤(1)中，所用到的共转化为本领域的常规做法。
上述步骤(2)中所述的筛选、再生均可参考本领域的通用做法。
上述重组菌株可用于制备蛋白质药物、工业酶制剂或饲料添加剂等，当用
于制备木聚糖酶时，为了得到好的产酶效果，可选择如下优化的培养基配方
将葡萄糖60.0g、蛋白胨6.0g、 (NH4)2S04 1.4g、 KH2P04 2.0 g、尿素0.3 g、CaCl20.3g、 Mandels营养盐溶液lOOml、拧檬酸缓冲液50ml和Mandels微量元素溶液lml混合后，用蒸馏水溶解并定容至1L;所述Mandels营养盐浓縮液的配方为将14 g (NH4)2S04、 3g尿素、20gKH2PO4、 4 g CaCl2.2H20禾口 3gMgS04.7H20混合后，用蒸馏水溶解并定容至1L;所述柠檬酸缓冲液的配方为将一水合柠檬酸210.0 g和NaOH 78.0g混合后，用蒸馏水溶解并定容至1L;所述Mandels微量元素浓縮液的配方为将FeSCV7H20 5.0 g、 MnS04.H201.6 g、 ZnS04.7H20 1.4 g和CoCl2.6H20 3.7 g混合后，用蒸馏水溶解并定容至1L。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果
1.本发明的表达盒采用将里氏木霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的启动子序列(Pgpd)和里氏木霉纤维二糖水解酶终止子序列(Tebhl)构成组成型启动子，不但可以利用里氏木霉高效的合成和分泌能力进行蛋白的表达，且蛋白表达量高，而且可以避免表达产物中产生过多的杂蛋白；
2. 本发明的表达盒采用将里氏木霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的启动子序列(Pgpd)和里氏木霉纤维二糖水解酶终止子序列(Tebhl)构成组成型启动子，无需诱导即可表达来源于动物、植物或真菌的基因，且可以对表达产物进行合适的修饰；
3. 本发明的重组菌株可高效表达不含纤维素酶的木聚糖酶，这类木聚糖酶在造纸工业中具有很重要的应用。


图1为里氏木霉组成型表达载体pUC-PT的物理图谱；
图2为含Pgpd-GFP-Tebhl表达盒的重组载体pUC-PGT的物理图谱；图3为重组菌株r. reesez'-XYNl表达产物的SDS-PAGE电泳图；图4为重组菌株T. reesei-XYNl表达木聚糖酶的时间曲线；其中，l为蛋白分子量标记，2为野生型里氏木霉菌株在表达培养基中培养的发酵上清液，3为野生型里氏木霉在含纤维素酶诱导物中培养的上清液，4为重组菌株T. reesei-XYNl在表达培养基中培养的上清液。
具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步地描述，但具体实施例并不对本发明做任何限定。
实施例l里氏木霉组成型表达载体的构建
1、里氏木霉基因组DNA的提取及检验将里氏木霉7Hc/zo&，a ^"e/ QM9414 (本领域常用菌种)接种于PDA 培养基上，于28。C恒温培养7天至孢子成熟。制备适量孢子悬液接种于液体 种子培养基中，于30。C， 180rpm条件下培养2天至菌丝体浓度达到4 5g/L 用于提取基因组DNA。
上述液体种子培养基的配方为将葡萄糖20.0g、蛋白胨2.0g、 (NH4)2S04 1.4 g、 KH2PO42.0g、尿素0.3g、 CaCl20.3g、 Mandels营养液浓縮液lOOml、 柠檬酸缓冲液(pH4.5， lmol/L) 50ml和Mandels微量元素浓縮液lml混合 后，用蒸馏水溶解并且定容至1L。
上述Mandels营养液浓縮液的配方为将14 g (NH4)2S04、 3 g尿素、20 g KH2P04、 4 g CaCl2.2H20和3 g MgS04.7H20混合后，用蒸馏水溶解并且定容 至1L。
上述Mandels微量元素浓縮液的配方为将5g FeS(V7H20、 1.7g ZnS04.7H20、 3.7gCoCl2.6H20和1.6gMnS04.H20混合后，用蒸馏水溶解并 且定容至1L。
上述柠檬酸缓冲液(pH4.5， lmol/L)的配方为取一水合柠檬酸210g， NaOH约78g，加水750ml，混合溶解后定容至1L。
本实施例采用本领域常用的2-巯基乙醇/CTAB法提取里氏木霉基因组 DNA，提取完毕后用琼脂糖凝胶(含1X琼脂糖和0.5吗/ml溴化乙锭)电泳检 验所提取基因组DNA。
2、里氏木霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的启动子序列(Pgpd)的分离
根据GeneBank上发布的gpd启动子的序列(EF043568)，以上述提取的里 氏木霉基因组DNA为模板，以上游引物G1和下游引物G2进行特异的PCR扩增分离Pgpd。
上游引物G1，其核苷酸序列如SEQIDNO:3所示，其中含有i^'/^III的酶切 位点；
下游引物G2，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，其中含尸wl的酶切位点。
PCR扩增反应条件以及反应体系参考试剂盒说明书，PCR扩增产物的分子 大小为1500bp，该扩增产物经琼脂糖凝胶电泳和DNA序列分析，结果表明所 获得的扩增产物为目的片段。
3、 里氏木霉纤维二糖水解酶终止子序列(Tebhl)的分离 根据GeneBank上发布的cbhl终止子的序列(1405332)，以上述提取的里
氏木霉基因组DNA为模板，以上游引物T1和下游引物T2进行特异的PCR扩增
分尚丁cbhl。
上游引物T1，其核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，其中含&cl的酶切 位点；
下游引物T2，其核苷酸序列如SEQIDNO:6所示，其中含I的酶切位点。
PCR扩增反应条件以及反应体系参考试剂盒说明书，PCR扩增产物的分子 大小为340bp，该扩增产物经琼脂糖凝胶电泳和DNA序列分析，结果表明所获
得的扩增产物为目的片段。
4、 里氏木霉组成型表达载体pUC-PT的构建
用限制性内切酶酶切(历""ni与尸W I ，及^c I与&oi I )和连接酶将Tcbh！ 与Pgpd这两个片段依次连接到质粒pUC18 (市售)中，即得到可表达外源基因的里氏木霉组成型表达载体pUC-PT (如图l所示)。
实施例2利用里氏木霉组成型表达系统表达绿色荧光蛋白
1、 绿色荧光蛋白基因GFP的获得
以质粒pCAMBIA1302 (市售)为模板，使用引物Fl和F2经PCR扩增 得到了 750 bp的绿色荧光蛋白GFP基因。
上游引物F1 ，其核苷酸序列如SEQIDNO:7所示，其中含力al的酶切 位点；
下游引物F2 ，其核苷酸序列如SEQIDNO:8所示，其中含尺/ "I的酶切位点。
扩增产物的长度为750bp，长度及序列分析的结果均与预期相符。
2、 Pgpd-GFP-T,表达盒的构建
将她基因通过限制性酶切位(力a I与i^w I )和连接酶连接到表达载 体pUC-PT中，得到含Pgpd-GFP-Tcbhl表达盒的重组载体pUC-PGT (如图2所示)。
3、 里氏木霉原生质体的制备与再生
采用5mg/ml的溶壁酶(市售)对24h左右菌龄的里氏木霉菌丝进行酶解， 过滤除去未酶解的菌丝，离心得到白色的原生质体沉淀，经1 mol/LMgS04和 STC (1.2M山梨醇、pH7.5的10mmol/LTris-Cl和50mmol/LCaCl2)溶液洗涤， 最后将里氏木霉原生质体沉淀溶于lmlSTC溶液中，血球计数板计数，原生质 体的浓度大约为109个/ml l(T个/ml。取100iLil，稀释至1()3个/ml，分别涂100jil 于3个固体再生平板上。三天后观察，平均再生率为20%。
4、 表达盒Pgpd-GFP-Tebhl的获得
13使用引物P1 (其核苷酸序列如SEQIDNO:l所示)和P2 (其核苷酸序列 如SEQIDNO:2所示)，以重组质粒pUC-PGT为模板，通过PCR扩增获得表 达盒Pgpd-GFP-Tebhl，其长度为2.5 kb。
5、 表达盒Pgpd-GFP-T,与质粒pAN7-l对里氏木霉原生质体的共转化 采用本领域的常规做法将上述表达盒Pgpd-GFP-Tebhl和质粒pAN7-l共转
化里氏木霉原生质体，转化后的原生质体在原生质体液体再生培养基中进行再 生，培养24 h后球状原生质体再生并长出芽管，呈短丝状，有些则凝集在一 起。上述液体再生培养基的成分为里氏木霉液体种子培养基+STC (1.2M山梨 醇-10mMpH7.5的Tris《l-50mMCaCl2)，其中里氏木霉液体种子培养基的 成分如实施例1中步骤(1)所述。
将液体再生的原生质体均匀涂布在含100 pg/ml潮霉素B的筛选平板上， 28'C培养2天后得到具有潮霉素抗性的转化子10株，转化效率为2株/pgDNA。 在对照实验中，未转化质粒的r. w"e/原生质体在100 |ag/ml潮霉素B的筛选 平板上不生长。
6、 转化子的鉴定及目的基因的表达
提取具有潮霉素B抗性的转化子的基因组DNA作为模板，用引物F1 (其 核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示)和F2 (其核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示) 进行PCR扩增。结果显示，10株抗性转化子的扩增产物经琼脂糖凝胶电泳均 得到大小约750 bp的她基因的特异带，而用原菌株r. re"e/QM9414的基因 组DNA为模板进行同样的PCR反应，没有出现扩增产物。
使用里氏木霉的液体种子培养基，取10株抗性转化子进行液体培养，48 h 后进行观察，发现其中有8株转化子的菌丝中表达绿色荧光蛋白。相对应的QM9414原菌株，菌丝不表达绿色荧光蛋白，表明在转化子中GFP的表达是 受g/^启动子调控的。
取一株表达绿色荧光蛋白的转化子进行基因型鉴定，结果发现用引物Fl (其核苷酸序列如SEQIDNO:7所示)和F2 (其核苷酸序列如SEQ ID NO:8 所示)扩增出750bp的片段，对应于基因GF户的大小；用引物P1 (其核苷酸 序列如SEQIDNO:l所示)和P2 (其核苷酸序列如SEQIDNO:2所示)可以 扩增出2.5 kb左右的片段，对应于表达盒Pgpd-GFP-Tebhl的大小。
实施例3利用里氏木霉组成型表达系统表达木聚糖酶基因
1、 x，2基因的分离
以里氏木霉的基因组DNA为模板，以引物X1和X2进行PCR扩增，得 到；qy"2基因。
上游引物X1 ，其核苷酸序列如SEQIDNO:9所示，其中含力"I的酶切 位点；
下游引物X2 ，其核苷酸序列如SEQIDNO:10所示，其中含《p"I的酶 切位点。
扩增产物经琼脂糖电泳检测，其分子大小为800bp，与预期结果相符合； 经DNA序列分析，其序列与GeneBank上发布的序列具有100%的同源性。
2、 Pgpd-XYN-Tewu表达盒的构建
将上述所获得的矽W基因经Wfl I和I酶切后与经同样酶切的表达 载体pUC-PT连接，经转化大肠杆菌、筛选，获得含表达盒Pgpd-XYN-Tebhl的 重组质粒pUC-PXT。将重组质粒中的表达盒进行DNA测序分析，结果表明表 达盒中各元素包括启动子、目的基因以及终止序列的结构正确。3、 表达盒Pgpd-XYN-Tebhl与质粒pAN7-l对里氏木霉原生质体的共转化 使用引物P1 (其核苷酸序列如SEQIDNO:l所示)和P2 (其核苷酸序列
如SEQ ID NO:2所示)，以重组质粒pUC-PXT为模板，通过PCR扩增获得表 达盒Pgpd-XYN-Tcbhl。使用实施例2的转化方法，以表达盒Pgpd-XYN-Tcbhl和质 粒pAN7-l对里氏木霉的原生质体进行共转化。经筛选，获得含Pgpd-XYN-Tcbhl 表达盒的重组里氏木霉菌株。
4、 重组菌株的鉴定
取一株重组菌株进行进行基因型鉴定。以重组菌株的基因组DNA为模板， 用引物X1 (其核苷酸序列如SEQIDNO:9所示)和X2 (其核苷酸序列如SEQ ID NO:IO所示)扩增出800bp的片段，对应于基因；qy"2的大小；用引物Pl (其核苷酸序列如SEQIDNO:l所示)和P2 (其核苷酸序列如SEQ ID NO:2 所示)可以扩增出2.5kb左右的片段，对应于表达盒Pgpd-XYN-Tc磁的大小， 该重组菌株命名为r. "e^/-XYNl，用于后续的实施方案。
实施例4重组菌株r. mm"'-XYN1表达产物的分析
将在含潮霉素抗性的PDA平板上生长良好的重组菌株r. ^"d-XYNl接 种于里氏木霉液体种子培养基中，培养48h后按5%的接种量转接到重组里氏 木霉表达培养基中，培养84h后分析XYN的表达情况。
上述里氏木霉液体种子的配方为100ml/L Mandels营养液浓縮液，1.0 ml/LMandels微量元素浓縮液，10g/L葡萄糖，1.0g/L蛋白胨，50 ml/L的柠檬 酸缓冲液(pH4.5， lmol/L)， 1.0 2.0g/L吐温80。
上述重组里氏木霉表达培养基配方为100ml/L Mandels营养液浓縮液， 1.0ml/LMandels微量元素浓縮液，20g/L葡萄糖，5.0g/L蛋白胨，50ml/L的柠檬酸缓冲液(pH4.5， lmol/L)， 1.0 2.0g/L吐温80。
上述Mandels营养液浓縮液、Mandels微量元素浓縮液和柠檬酸缓冲液的 配方同实施例1。
以桦木木聚糖(birch xylan， Sigma)为底物，根据一个活力单位(IU) 定义为在体系中反应中每分钟形成lpmol的还原糖(以木糖计)所需要的酶 量来检测重组菌株T. reesei-XYNl表达产物(木聚糖酶)活性，经测定重组菌 株T. reesei-XYNl在不诱导的情况下产木聚糖的活性为172 IU/ml。
将发酵液经常规处理后进行SDS-PAGE分析，分析表明，组成型的重组 菌株T. reesei-XYNl直接将蛋白分泌到胞外，而原菌在没有诱导的情况下没有
表达，而且用稻草粉诱导的原菌的表达量也明显小于重组木聚糖酶菌，r.
mm^-XYN1所表达木聚糖酶的表达分子量为21KD，如图3所示。
对重组菌株T. reesei-XYN的表达产物采用Applied Biosystems Voyager DE-STR MALDI-TOF-MS生物质谱仪进行质谱分析，使用MALDI-TOF-MS 质谱仪进行分析，。经质谱分析后所得到的实验数据与Matrixscience的数据库 进行比较，质谱分析结果显示检测到6个肽段与里氏木霉所产生的XYN2 中肽段的氨基酸序列完全一致，提示所表达的蛋白为重组XYN2。 实施例5重组菌株T. reesei-XYNl表达木聚糖酶的条件优化 本实施例选择初始培养基中不同的碳源浓度以及氮源浓度对重组菌株表 达产酶的培养基进行优化，结果表明，使用的葡萄糖初始浓度为60g/L、蛋白 胨初始浓度为6g/L时效果最佳。表达结束后发酵上清液中的木聚糖酶活性达 到194.8 IU/ml。
本实施例的重组菌株产木聚糖酶优选培养基为将葡萄糖60.0g、蛋白胨6.0 g、 (NH4)2S04 1.4g、 KH2PO42.0g、尿素0.3 g、 CaCl2 0.3 g、 Mandels营养 盐溶液lOOml、柠檬酸缓冲液50ml和Mandels微量元素溶液1ml混合后，用 蒸馏水溶解并定容至1L;所述Mandels营养盐浓縮液的配方为将14 g (NH4)2S04、 3g尿素、20gKH2PO4、 4 g CaCl2'2H20和3 g MgS04'7H20混合
后，用蒸馏水溶解并定容至1L;所述柠檬酸缓冲液的配方为将一水合拧檬 酸210.0 g和NaOH 78,0g混合后，用蒸馏水溶解并定容至1L;所述Mandels 微量元素浓縮液的配方为将FeS04.7H20 5.0 g、MnS04-H20 1.6 g、ZnS04.7H20 1.4 g和CoClr6H20 3.7 g混合后，用蒸馏水溶解并定容至1L。
在该优选培养条件下，重组菌株r w^eZ-XYNl产木聚糖酶具有组成型产 酶的特性，进入对数生长期即开始产酶，并一直持续到84 h，最该酶活达到 194.8 IU/ml，在发酵末期发酵液中的酶活性略有下降，如图4所示。
实施例6重组菌株TT wm"'-XYN1的稳定性实验
将重组菌株7: mm^-XYNI在不含潮霉素抗性的PDA平板上连续传代五 次，分别测定各次传代的重组菌株在表达培养基中的产酶活性，发现各次传代 的重组菌株的产木聚糖酶的能力没有显著差异，说明本发明所构建的重组菌株 具有遗传稳定性。
18一种里氏木霉表达盒及其重组菌株和应用序列表 SEQUENCE LISTING
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<160>
<170>
<210> <211〉 <212> <213>
邢，苗 刘，刚
一种里氏木霉表达盒及其重组菌株和应用 10
Patentin version 3.5 1
22 DNA
人工序列
<400〉 1
gacgcagaag 33ggaaatcg cc 22
<210> <211> <212〉 <213〉
2
21 腿
人工序列
〈400> 2
tggtactggg atacacgaag a 21
<210> 3
<211> 31
<212〉 DNA <213〉人工序列
〈400> 3
gctaagcttg acgcagaaga aggaaatcgc c 31
<210> 4
<211〉 30
<212> 腿 〈213〉人工序列
〈400> 4
tgactgcagt ttgtatctgc gaattgagct 30
<210> 5
<211> 28
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<400> 5
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<400〉 6
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<211> 34
<212> DNA <213〉人工序列
<400〉 7
gc3tct3gaa tggtagatct gaxtagt朋a ggsg 34一种里氏木霉表达盒及其重组菌株和应用序列表
〈210> 8 <211〉 32 <212> DNA <213>人工序列
<400> 8
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<400> 9
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<210〉 10
<211> 29
<212> DNA <213>人工序列
<400> 10
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权利要求
1、一种里氏木霉表达盒，其特征在于该表达盒是由里氏木霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子、外源目的基因和里氏木霉纤维二糖水解酶终止子组成。
2、 根据权利要求l所述里氏木霉表达盒，其特征在于所述表达盒的PCR扩增引物为(1) 上游引物P1，其核苷酸序列如SEQIDNO:l所示；(2) 下游引物P2，其核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。
3、 一种表达载体，其特征在于该表达载体含有权利要求1所述里氏木霉表达盒。
4、 一种重组菌株，其特征在于该重组菌株是由权利要求1所述表达盒和带有筛选标记的载体共转化里氏木霉原生质体，培养并筛选转化子制备而得。
5、 根据权利要求4所述重组菌株，其特征在于所述带有筛选标记的载体为pAN7-l。
6、 根据权利要求4所述重组菌株，其特征在于所述筛选是以潮霉素B作为筛选剂。
7、 权利要求4所述重组菌株在制备蛋白质药物、工业酶制剂或词料添加剂中的应用。
8、 根据权利要求7所述应用，其特征在于所述工业酶制剂为木聚糖酶。
9、 根据权利要求8所述应用，其特征在于重组菌株生产木聚糖酶时所用葡萄糖蛋白胨发酵培养基的配方为将葡萄糖60.0g、蛋白胨6.0g、 (NH4)2S04，1.4g、 KH2PO42.0g、尿素0.3g、 CaCl20.3g、 Mandels营养盐溶液lOOml、拧檬酸缓冲液50ml和Mandds微量元素溶液1ml混合后，用蒸馏水溶解并定容至1L;所述Mandels营养盐浓縮液的配方为将14 g (NH4)2S04、 3 g尿素、20gKH2PO4、 4gCaCl2.2H20和3gMgS(V7H20混合后，用蒸馏水溶解并定容至1L;所述拧檬酸缓冲液的配方为将一水合柠檬酸210.0 g和NaOH 78.0g混合后，用蒸馏水溶解并定容至1L;所述Mandels微量元素浓縮液的配方为将FeS04.7H20 5.0 g、 MnS04H20 1.6 g、 ZnS04.7H20 1.4 g和CoClr6H20 3.7 g混合后，用蒸馏水溶解并定容至1L。
全文摘要
本发明公开一种里氏木霉表达盒及其重组菌株和应用，该表达盒是由里氏木霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子、外源目的基因和里氏木霉纤维二糖水解酶终止子组成。本发明的表达盒采用将里氏木霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的启动子序列和里氏木霉纤维二糖水解酶终止子序列构成组成型启动子，无需诱导即可表达来源于动物、植物或真菌的基因，且可以对表达产物进行合适的修饰，不但可以利用里氏木霉高效的合成和分泌能力进行蛋白的表达，且蛋白表达量高，而且可以避免表达产物中产生过多的杂蛋白。本发明的重组菌株可高效表达不含纤维素酶的木聚糖酶，这类木聚糖酶在造纸工业中具有很重要的应用。
文档编号C12P21/02GK101560513SQ20091003953
公开日2009年10月21日 申请日期2009年5月15日 优先权日2009年5月15日
发明者刚 刘, 康 康, 云 李, 苗 邢 申请人:邢 苗;刘 刚