专利名称：：一株过表达β-葡萄糖苷酶的斜卧青霉工程菌及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于微生物工程领域；具体地说，本发明涉及一株过表达β-葡萄糖苷酶的斜卧青霉工程菌，及其在生产β-葡萄糖苷酶及降解纤维素中的应用。
背景技术：
：β_葡萄糖苷酶(β-glucosidase，Ε.C.3.2.1.21),又名纤维二糖酶(cellobiase)，是纤维素降解过程中的重要酶组分。β-葡萄糖苷酶对于纤维素糖化水解具有关键性作用，它能够降解纤维二糖，解除纤维二糖过量积累对纤维二糖水解酶和内切葡聚糖酶产生的反馈抑制作用，提高整个纤维素酶系降解纤维素底物的效率。但对产纤维素酶丝状真菌的纤维素酶系组分分析表明，葡萄糖苷酶在纤维素酶系中所占比例很低，这种低的葡萄糖苷酶含量使其成为真菌纤维素酶系降解纤维素成为单糖的限速步骤(MarkkuSaloheimo,JuhaKuja-Panula,Ylosmaki,MichaelWard,andMerjaPenttila(2002).EnzymaticPropertiesandIntracelIularLocalizationoftheNovelTrichodermareeseiβ-GlucosidaseBGLII(CellA).AppliedandEnvironmentalMicrobiology,68(9):4546_4553)。除被应用于生物质转化过程，由于具有转糖基作用，葡萄糖苷酶还被广泛的应用于食品和制药行业。例如，葡萄糖苷酶在酒的香味增强上起到很重要的作用，并被应用于葡萄酒香味提升(C.Lasanta,I.Caro,L.Perez(2009).β-glucosidaseimmobilizationonionexchangeresinsforusingasaromaticenhancementofwines.ChemicalEngineeringTransactions,Vol.17897~902)；对于心脏病禾口癌症有治疗作用的异黄酮可以由β-葡萄糖苷酶催化异黄酮苷产生(ChimzhiZhang,HongshanYu,MingchunLu,JingLiandFengxieJin(2005).EnzymicsynthesisofsalidrosidePurificationandcharacterizationofsalidrosidasefromAspergillasniger.ProcessBiochemistry,40(9):3143_3147)。斜卧青霉(Penicilliumdecumbens)具有较强的纤维素酶生产能力，但是现有的生产方法中其葡萄糖苷酶产量并不能满足需求，且其纤维素酶系中的较低的葡萄糖苷酶含量仍是限制斜卧青霉(Penicilliumdecumbens)降解纤维素的关键因素。有目的的通过过表达β-葡萄糖苷酶构建工程菌有望克服上述的缺陷，然而，检索结果还未见有相关工作的报道。
发明内容针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一株能够高产β-葡萄糖苷酶的斜卧青霉工程菌及其在产β“葡萄糖苷酶和降解纤维素中的应用。本发明所述过表达葡萄糖苷酶的斜卧青霉工程菌，其特征在于所述菌株含有瑞氏木霉的β-葡萄糖苷酶I(bgll)cDNA基因，其命名为斜卧青霉(PenicilliumdeCUmbens)Gi31-2，已于2010月5日7日保藏于“中国典型培养物保藏中心”，保藏号为CCTCCM2010111。上述斜卧青霉工程菌的特征为含有瑞氏木霉bgllcDNA基因过表达载体pTBG-1，该工程菌株的0-葡萄糖苷酶活力最高达到3.47IU/ml，是出发菌株(1.20IU/ml)的2.90倍(见图5)；最高滤纸酶活为3.32IU/ml，是出发菌株(2.71IU/ml)的1.23倍(见图7)。其菌落形态小而均勻，质地紧密，呈毛毡状；菌落与培养基间的连接紧密，不易挑取；在麸皮培养基上划线培养，菌丝体为初期白色，呈不扩散式蔓延，培养4天左右，菌丝体表面出现淡粉色孢子，继续培养，孢子颜色逐渐加深为粉色，深红色(图8)。上述斜卧青霉工程菌的构建方法参照常规的丝状真菌基因转化方法，将含有瑞氏木霉bgllcDNA基因的过表达载体pTBG-1(图1)与抗硫胺素基因表达盒ptrA共转化斜卧青霉(PeniciIliumdecumbens)JU-A10原生质体，在含1yg/ml抗硫胺素的选择培养基上筛选得到转化子。提取转化子染色体DNA，经过PCR和southern验证得到转化子Gi24_2，Gi31-2,Gi53-2，Gi54_2，Gi55_l，Gi72_3，Gi78_2，验证转化子结果见图2和图3。对以上斜卧青霉转化子进行液体发酵并对其葡萄糖苷酶活力进行测定，其中Gi31-2的葡萄糖苷酶活力最高，可以达到3.47IU/ml，是出发菌株(1.20IU/ml)的2.90倍(见图5)，其最高滤纸酶活为3.32IU/ml，是出发菌株(2.71IU/ml)的1.23倍，该菌株即为目标工程菌株，将其命名为斜卧青霉(Penicilliumdecumbens)Gi31_2。上述斜卧青霉工程菌在生产0-葡萄糖苷酶酶液中的应用。其中所述斜卧青霉工程菌生产葡萄糖苷酶酶液的形式是以液体发酵方法实施；其中所述发酵方法是将斜卧青霉(Penicilliumdecumbens)Gi31_2CCTCCM2010111接种到装有50-90ml葡萄糖基本培养基的300_500ml三角瓶中，28_30°C，在80-100rpm往复式摇床上培养24-48h，得发酵种子液；将得到的种子液先抽滤收集湿菌丝，再按lg150ml的比例将湿菌丝接种到发酵培养基中，继续培养100-116h，然后以6000-8000rpm，4°C离心10-15min，收集的上清液即为0-葡萄糖苷酶酶的酶液。其中，上述葡萄糖基本培养基(g/L)葡萄糖20，(NH4)2S045,KH2P0415,MgS040.6，CaCl20.6，FeS047H200.005，MnS04H200.0016，ZnS047H200.0014，CoCl20.002，pH5.5。发酵培养基(w/v):MandelS盐溶液，2%木糖渣，的微晶纤维素，5%的麸皮汁。本发明所述斜卧青霉工程菌所生产的纤维素酶酶液在降解天然纤维素底物麦秸粉中的应用，其中包括酶液制备和麦秸粉降解。酶液制备将斜卧青霉(Penicilliumdecumbens)Gi31_2CCTCCM2010111接种到装有70ml葡萄糖基本培养基的300ml三角瓶中，30°C往复式摇床上90rpm培养36h后，得发酵种子液；将得到的种子液先进行抽滤收集湿菌丝，再将lg抽滤得到的种子菌丝接种到150ml发酵培养基中继续培养108h，然后以6000rpm，4°C离心15min，收集上清即为所需的含有纤维素酶的酶液。麦秸粉降解以每克麦秸粉加入5ml上述纤维素酶酶液的比例将酶液与底物混合，于pH5.0，温度50°C，转速200-300rpm条件下降解48_56h。本发明首次采用过表达瑞氏木霉的0_葡萄糖苷酶I(bgl1)cDNA基因的策略得到工程菌斜卧青霉(Penicilliumdecumbens)Gi31_2CCTCCM2010111，其具有很高的葡萄糖苷酶活力，液体发酵情况下0-葡萄糖苷酶活力最高可以达到3.47IU/ml，是出发菌株的2.90倍。该菌株的最高滤纸酶活为3.32IU/ml，是出发菌株斜卧青霉(Penicilliumdecumbens)JU-A10(2.71IU/ml)1.23倍，对纤维素的降解能力也有较高提高。预示该工程菌在生产3-葡萄糖苷酶和降解纤维素中有着非常广泛的应用。图1.pTBG-1载体的构建过程。图2.PCR扩增Gi系列斜卧青霉转化子中bgll基因电泳结果。其中:M,DL2000；1，阳性对照pTBG-1；2，Gi24_2；3，Gi31-2；4，Gi53-2；5，Gi54-2；6，Gi55-1；7，Gi72_3；8，Gi78_2；CK,出发菌株。图3.Gi系列斜卧青霉转化子与1.69kbbgll探针的Southern杂交结果。其中:M,lkbLadder；CK,出发菌株；1，Gi24_2；2，Gi31_2；3，Gi53_2；4，Gi54_2；5，Gi55-1；6，Gi72-3；7，Gi78_l；8，阳性对照(pTBG-1/XhoI)。图4.对硝基酚(pNP)标准曲线。图5.斜卧青霉(Penicilliumdecumbens)Gi31_2CCTCCM2010111和出发菌株的3-葡萄糖苷酶酶活酶活测定结果。其中▲，斜卧青霉(Penicilliumdecumbens)Gi31_2CCTCCM2010111；，出发菌株。图6.葡萄糖标准曲线。图7.斜卧青霉(Penicilliumdecumbens)Gi31_2CCTCCM2010111和出发菌株的滤纸酶活测定结果。其中▲，斜卧青霉(Penicilliumdecumbens)Gi31_2CCTCCM2010111；，出发菌株。图8.斜卧青霉(Penicilliumdecumbens)Gi31_2CCTCCM2010111菌落形态。具体实施例方式实施例1.葡萄糖苷酶过表达载体pTBG-1转化斜卧青霉(Penicilliumdecumbens)JU-A10首先采用Double-jointPCR(DJ-PCR)技术(Jae-HyukYuetal.(2004).Double-jointPCR:aPCR—basedmoleculartoolforgenemanipulationsinfilamentousfungi.FungalGeneticsandBiology.41973-981)克隆瑞氏木霉的bgllcDNA基因(GenBank序列U09580.1)。分别以B1S/B1A、B2S/B2A和B3S/B3A为引物对，抽提的瑞氏木霉QM9414(ATCC26921)染色体DNA为模板，扩增bgll基因的3个外显子片段，凝胶回收89bp、1760bp和442bp的扩增片段，再利用嵌合引物对3个回收片段进行组装。最后以B1S和B3A为引物，以自行组装的PCR产物为模板，扩增bgllcDNA。凝胶回收约2.3kb的PCR产物，将其连接到pMD18-T中，送上海生物工程有限公司进行序列测定，序列测定结果显示瑞氏木霉的bgllcDNA基因被成功克隆。上述引物对具体如下(其中下划线表示相应酶切位点)BIS:ccgctcgaggaaatgcgttaccgaacagc(Xhol)B1A:ctcagccgaggcccccgatgttgagtgactgtctgccctagcaaaB2S:ctcaacatcgggggcctcggB2A:acagtccatagccgaactcgB3S:cggtacgagttcggctatggactgtcttacaccaagttcaactacB3A:gctctagactacgctaccgacagagtgct(XbaI)然后用Xhol/Xbal双酶切带有bgllcDNA的载体pMD18-T_bgll，将得到的bgllcDNA基因片段和经过同样酶处理载体pTHP进行连接，构建诱导型表达载体pTBG-Ι(载体构建过程如图1)。其中上述含4拷贝cbhl启动子的载体pTHP的构建方法参照LiuTiWangT，LiX，LiuX.(2008).ImprovedheterologousgeneexpressioninTrichodermareeseibycbhlpromoteroptimization.ActaBiochimBiophysSin.40(2)，158-165介绍。上述强cbhl启动子为在cbhl启动子基础上构建的4拷贝(每拷贝序列长200bp，含有CCAAT盒、转录激活因子Ace2结合位点、XlnR结合位点)人工启动子。将纯化的质粒pTBG-Ι和ptrA表达盒各5μg(lμg/μ1)混合后共转化斜卧青霉(Penicilliumdecumbens)JU-A10(QuY,ZhaoX,GaOP.ApplBiochemBiotechnol,1991，28/29=363-368)，转化过程采用常规的原生质体转化法，方法参照TainaKarhunen,etal.(1993).Highfrequencyone-stepgenereplacementinTrichodermareesei.I.Endoglucanase!overproduction.MolGenGenet,241:515_522.介绍。其中上述含抗硫胺素标记基因的ptrA表达盒由PCR扩增得到。以pPTRII质f立TakafumiKUB0DERA,etal.(2000).PyrithiamineResistanceGene(ptrA)ofAspergillusoryzae:Cloning,CharacterizationandApplicationasaDominantSelectableMarkerforTransformation.Biosci.Biotechnol.Biochem.,64(7)1416-1621为模板，Ptra-S和Ptra-A为引物，PCR扩增得到长约2.2Kb的抗硫胺素标记基因PtrA表达盒。PCR程序为95°C2min；95°C30s,55°C30s,72°Clmin30s，30个循环；72°C5min。上述所需引物如下Ptra-S,5_ccccaggctttacactttat_3；Ptra-A,5-ccgctcttgcatctttgtt_3。上述原生质体转化的具体方法如下原生质体的制备①在PDA培养基平板上放置一张玻璃纸，其上涂布斜卧青霉(Penicilliumdecumbens)JU-AlO孢子悬液，30°C培养20hr。②将平板中玻璃纸上的菌丝转移，悬浮于1.2mol/L山梨醇-lOmmol/L磷酸钾溶液(ρΗ5·6，含5mg/ml-10mg/mlLysingEnzymes)中，30°C温浴1.52hr。在此过程中不时镜检，观察原生质体的生成情况。③通过G3烧结漏斗过滤，将原生质体与未被消化的菌丝体分离开，并用1.2mol/L山梨醇-10mmol/LTris·HCl(pH7.5)洗涤2次。④4000rpm离心15min，弃上清，收集原生质体，并用lmol/L山梨醇-IOmmol/LTris·HCl(pH7.5)洗涤2次。最后重悬于lmol/L山梨醇-10mmol/LCaCI2-IOmmo1/LTris‘HCKpH7.5)中，使原生质体浓度为5X106_5X107/ml。其中上述PDA培养基去皮土豆200g切成块加水IOOOml煮20min后用纱布过滤取滤液，加20g葡萄糖至滤液中溶解后定容至1000ml。加1.5%琼脂成固体培养基。pH为天然PH。原生质体的转化将纯化后的质粒pTBG-1和ptrA表达盒各5iig与斜卧青霉(PeniciIliumdecumbens)JU-A10原生质体(100yl)混合，加入50ii125%PEG6000-50mmol/LCaCl2-10mmol/LTrisHC1(pH7.5)，冰浴20min,后加入lml60%PEG4000_50mmol/LCaCl2-10mmol/LTrisHC1(pH7.5)(加入体积为原生质的10倍)，室温放置5min。最后加入2mllmol/L山梨醇-10mmol/LCaCl2-10mmol/LTrisHC1(pH7.5)，混勻。再生和选择将适量(100ill200ill)上述转化液涂布于转化培养基，转化培养基为含有浓度IPg/ml的抗硫胺素的山梨醇基本培养基，30°C培养3-4d，挑选在转化培养基上生长较快菌落较大的转化子。同时对于没有加入目的质粒的原生质体按同样的方法进行，按相同的量涂布在相同的转化培养基上作为原生质体再生情况检测以及阴性对照。以上转化基本培养基山梨醇lmol/L，(NH4)2S045g/L，KH2P0415g/L，MgS040.6g/L,CaCl20.6g/L,FeS047H200.005g/L,MnS04H200.0016g/L,ZnS047H200.0014g/L,CoCl20.002g/L，1ug/ml的抗硫胺素(pH5.5)。将选择平板上长出的转化子进一步挑取到转化基本培养基平板上进行复筛，将复筛培养基上挑选到的转化子转接于PDA培养基斜面，30°C培养3-5d左右，洗孢子，进行分单孢，依次传代5次使转化子性状得到稳定。之后收集孢子并加入80%甘油等体积混合保藏。经初筛、复筛及单孢分离，最终从初筛的62株转化子中得到7株稳定遗传的斜卧青霉pTBG-1转化子Gi24-2、Gi31-2、Gi53-2、Gi54-2、Gi55-l、Gi72-3、Gi78-2。实施例2.PCR验证斜卧青霉pTBG-1转化子以抽提的转化子染色体DNA为模板，B1S/B3A为引物对(祥见实施例1)进行PCR扩增。PCR反应体系(20ill):10XEFTaqbuffer2.0u1；dNTPmix(lOmmol/L)0.4u1；BIS和B3A(10nmol/ml)各1yl；EF_Taq(2.5U/u1)0.lu1；模板1ii1；用无菌水补足体积至20ii1。PCR循环程序如下94°C5min；94°C30sec,56.3°C30sec,72°C70sec，30个循环；72°ClOmin。经上述对斜卧青霉转化子(Gi24-2、Gi31-2、Gi53_2、Gi54_2、Gi55_l、Gi72_3、Gi78-2)的PCR验证发现其均能扩增到片段大小约2.3kb的bgllcDNA基因片段，与瑞氏木霉bgll的cDNA片段大小相符，而出发菌株没有出现相应的条带，结果如图2，说明瑞氏木霉bgll基因已整合到Gi系列斜卧青霉转化子染色体基因组上。实施例3.Southernblot验证斜卧青霉pTBG-1转化子Southernblot分析转化子bgll拷贝数。以B4S/B3A为引物对(其中，B3A参见实施例1，B4S为GAGCAACCCAGATGACCG)，瑞氏木霉染色体DNA为模板进行PCR扩增，得到的基因片段经过凝胶回收试剂盒纯化标记后作为探针(详见DIGHighPrimerDNALabelingandDetectionStarterKitI,Roche的说明书)。PCR反应程序为94°C5min；94°C30s,59°C30s，72°C53s，30个循环；72°ClOmin。扩增片段1688bp。将出发菌株和Gi系列斜卧青霉转化子分别接种到50ml基本培养基中，200rpm30°C培养2d，抽滤菌丝，大量提取染色体，将抽提的染色体用限制性内切酶Xhol酶切过夜，30V电泳。按照DIGHighPrimerDNALabelingandDetectionStarterKitI(Roche)说明书进行转化子的Southernblot分析。Southern分析结果见图3。结果进一步证明瑞氏木霉bgll基因已整合到Gi系列斜卧青霉转化子染色体基因组上，由Southern分析结果还可以看出bgll基因以不同拷贝数整合到Gi系列斜卧青霉转化子染色体基因组上。实施例4.工程菌斜卧青霉(Penicilliumdecumbens)Gi31_2CCTCCM2010111β-葡萄糖苷酶活力测定将Gi系列斜卧青霉转化子和出发菌株的孢子悬液分别接种到70ml(300ml的三角瓶)葡萄糖基本培养基中，30°CIOOrpm(往复式摇床)培养36h后，对菌丝进行抽滤，每株取Ig菌丝分别转接到150ml(500ml的三角瓶)发酵培养基中继续培养，每隔24h取发酵液，离心测定酶活。将发酵液以6000r/min离心15min，取上清即为粗酶液。取100μ1适当稀释的粗酶液，加入50μ110mmol/L对硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)醋酸Buffer溶液(pH4.8)，混勻，50°C水浴30min后加入150μ110%Na2CO3终止反应。405nm测OD值。同时以未加酶液的管为空白对照。酶活的定义在50°C、pH4.8条件下，每毫升酶液每分钟产生对硝基酚(pNP)的微摩尔数。β-葡萄糖苷酶活力测定结果显示其中Gi31_2的葡萄糖苷酶活力最高，可以达到3.47IU/ml，是出发菌株(1.20IU/ml)的2.90倍(见图5)，将其命名为斜卧青霉(PeniCilliumdeCumbens)Gi31-2，并于2010月5日7日将其保藏于“中国典型培养物保藏中心”，保藏号为CCTCCM2010111。上述斜卧青霉工程菌的特征为菌落形态小而均勻，质地紧密，呈毛毡状；菌落与培养基间的连接紧密，不易挑取；在麸皮培养基上划线培养，菌丝体为初期白色，呈不扩散式蔓延，培养4天左右，菌丝体表面出现淡粉色孢子，继续培养，孢子颜色逐渐加深为粉色，深红色(图8)。其中，上述葡萄糖基本培养基(g/L)葡萄糖20，(NH4)2S045,KH2PO415,MgSO4O.6,CaCl2O.6，FeSO4·7H200.005，MnSO4·H2O0.0016，ZnSO4·7H200.0014，CoCl2O.002，ρΗ5·5。发酵培养基(w/v)=Mandels盐溶液，2%木糖渣，的微晶纤维素，5%的麸皮汁。上述酶活力测定所需试剂如下醋酸-醋酸钠缓冲液甲液(0.2mol/L的NaAC溶液)称取27.22gNaAC·3H20在200ml烧杯中，然后蒸馏水溶解定容至1L;乙液(0.2mol/l的HAC溶液)移液管量取11.8ml冰乙酸(99.0%)，定容至IOOOml；待用时，甲乙溶液按比例混合(甲液乙液=590410，pH4.8)。pNP:300ng/μ1的pNP(产物)标准溶液储存液。使用时稀释到60ng/μ1。对硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)将pNPG溶于0.2mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液中，配成10mmol/L反应液。10%Na2CO3准确称量IOgNa2CO3,加入100ml的双蒸水，充分溶解后混勻。DNS(3，5二硝基水杨酸)的配制①NaOH104g溶于1300ml蒸馏水中；②3，5_二硝基水杨酸30g加入①中混勻，加热溶解；③酒石酸钾钠910g溶于2500ml蒸馏水中；④25g重蒸酚，加25g无水亚硫酸钠，加入③中；将以上各步骤的溶液混合，加入1200ml蒸馏水(总体积5000ml)，放在棕色瓶中，暗处放置一周后即可使用。上述所需pNP标准曲线的制作如下按表1所示取不同体积的对-硝基苯酚(60ng/yl)，用0.2M醋酸-醋酸钠缓冲溶液(pH4.8)稀释成一系列浓度，加入10%的Na2C03中止反应。用SPECTRAMAX190微板光谱仪在405nm测反应液的光吸收值。以pNP浓度为横坐标，光吸收值为纵坐标作标准曲线。表lpNP标准曲线的制备根据上述所述过程及表1所示结果，以pNP浓度为横坐标，以0D4Q5光吸收值为纵坐标作图即为PNP标准曲线，如图4。实施例5.工程菌斜卧青霉(Penicilliumdecumbens)Gi31_2CCTCCM2010111纤维素酶活力测定将斜卧青霉(Penicilliumdecumbens)Gi31_2CCTCCM2010111和出发菌株的孢子悬液分别接种到70ml(300ml的三角瓶)葡萄糖基本培养基中，30°ClOOrpm(往复式摇床)培养36h后，对菌丝进行抽滤，每株取lg菌丝分别转接到150ml(500ml的三角瓶)发酵培养基中继续培养，每隔24h取发酵液，将发酵液以6000r/min离心15min取上清做为粗酶液。其中，上述葡萄糖基本培养基(g/L)葡萄糖20，(NH4)2S045,KH2P0415,MgS040.6,CaCl20.6，FeS047H200.005，MnS04H200.0016，ZnS047H200.0014，CoCl20.002，pH5.5。发酵培养基(w/v):MandelS盐溶液，2%木糖渣，的微晶纤维素，5%的麸皮汁。将lX6cm(50+lmg)滤纸折叠放入试管底部，加入lmlpH4.8的醋酸缓冲液和0.5ml适当稀释的粗酶液，混勻。50°C水浴60min后加入1.5mlDNS，漩涡震荡混勻后煮沸5min，静置冷却后加蒸馏水定容到25ml，摇勻，540nm测0D值。空白对照中未加入滤纸条。酶活定义在50°C、pH4.8条件下，将每分钟产生1Pmol葡萄糖所需的酶量定为一个酶活力单位。滤纸酶活测定结果显示斜卧青霉(Penicilliumdecumbens)Gi31_2CCTCCM2010111的最高滤纸酶活为3.32IU/ml，是出发菌株(2.71IU/ml)1.23倍(见图7)。其中上述葡萄糖标准曲线的制备如下取lOOmg葡萄糖(105°C烘干至恒重)，加到100ml容量瓶中，加dH20溶解，定容至100ml,即lmg/ml的葡萄糖溶液，摇勻，过夜。取10支25ml刻度试管，洗净，烘干，按表2操作。0D值的测定采用美国产型号为SPECTRAMAX190的“微板光谱仪”。表2葡萄糖标准曲线的制备冷却立即放入冷水中，加dH20至25ml_OD540_0.0000.04720.10900.16610.22890.28590.33760.4254根据上述所述方法和表2所示结果，以葡萄糖浓度(mg/ml)为横坐标，OD540为纵坐标作图即为葡萄糖标准曲线。葡萄糖标准曲线如图5。实施例6.工程菌斜卧青霉(Penicilliumdecumbens)Gi31_2CCTCCM2010111在生产葡萄糖苷酶酶液中的应用。将斜卧青霉(Penicilliumdecumbens)Gi31_2CCTCCM2010111接种到装有50ml葡萄糖基本培养基的300ml三角瓶中，28°C，在80rpm往复式摇床上培养24h，得发酵种子液；将得到的种子液先抽滤收集湿菌丝，再按lg150ml的比例将湿菌丝接种到发酵培养基中，继续培养100h，然后以6000rpm，4°C离心lOmin，收集的上清液即为0-葡萄糖苷酶酶的酶液。其中，上述葡萄糖基本培养基(g/L)葡萄糖20，(NH4)2S045,KH2P0415,MgS040.6,CaCl20.6，FeS047H200.005，MnS04H200.0016，ZnS047H200.0014，CoCl20.002，pH5.5。发酵培养基(w/v):MandelS盐溶液，2%木糖渣，的微晶纤维素，5%的麸皮汁。实施例7.工程菌斜卧青霉(Penicilliumdecumbens)Gi31_2CCTCCM2010111在生产葡萄糖苷酶酶液中的应用。将斜卧青霉(Penicilliumdecumbens)Gi31_2CCTCCM2010111接种到装有70ml葡萄糖基本培养基的300ml三角瓶中，30°C，在90rpm往复式摇床上培养36h，得发酵种子液；将得到的种子液先抽滤收集湿菌丝，再按lg150ml的比例将湿菌丝接种到发酵培养基中，继续培养108h，然后以7000rpm，4°C离心15min，收集的上清液即为0-葡萄糖苷酶酶的酶液。其中，上述葡萄糖基本培养基(g/L)葡萄糖20，(NH4)2S045,KH2P0415,MgS040.6,CaCl20.6，FeS047H200.005，MnS04H200.0016，ZnS047H200.0014，CoCl20.002，pH5.5。发酵培养基(w/v):MandelS盐溶液，2%木糖渣，的微晶纤维素，5%的麸皮汁。实施例8.工程菌斜卧青霉(Penicilliumdecumbens)Gi31_2CCTCCM2010111在生产葡萄糖苷酶酶液中的应用。将斜卧青霉(Penicilliumdecumbens)Gi31_2CCTCCM2010111接种到装有90ml葡萄糖基本培养基的500ml三角瓶中，30°C，在lOOrprn往复式摇床上培养48h，得发酵种子液；将得到的种子液先抽滤收集湿菌丝，再按lg150ml的比例将湿菌丝接种到发酵培养基中，继续培养116h，然后以SOOOrpm，4°C离心15min，收集的上清液即为0-葡萄糖苷酶酶的酶液。10其中，上述葡萄糖基本培养基(g/L)葡萄糖20，(NH4)2S045,KH2P0415,MgS040.6,CaCl20.6，FeS047H200.005，MnS04H200.0016，ZnS047H200.0014，CoCl20.002，pH5.5。发酵培养基(w/v):MandelS盐溶液，2%木糖渣，的微晶纤维素，5%的麸皮汁。实施例9.工程菌斜卧青霉(Penicilliumdecumbens)Gi31_2CCTCCM2010111所生产的纤维素酶酶液在降解天然纤维素底物麦秸粉中的应用。斜卧青霉工程菌所生产的纤维素酶酶液在降解天然纤维素底物麦秸粉中的应用包括酶液制备和麦秸粉降解。酶液制备将斜卧青霉(Penicilliumdecumbens)Gi31_2CCTCCM2010111接种到装有70ml葡萄糖基本培养基的300ml三角瓶中，30°C往复式摇床上90rpm培养36h后，得发酵种子液；将得到的种子液先进行抽滤收集湿菌丝，再将lg抽滤得到的种子菌丝接种到150ml发酵培养基中继续培养108h，然后以6000rpm，4°C离心15min，收集上清即为所需的含有纤维素酶的酶液。麦秸粉降解以每克麦秸粉加入5ml上述纤维素酶酶液的比例将酶液与底物混合，于pH5.0，温度50°C，转速200-300rpm条件下降解48_56h。其中，上述葡萄糖基本培养基(g/L)葡萄糖20，(NH4)2S045,KH2P0415,MgS040.6，CaCl20.6，FeS047H200.005，MnS04H200.0016，ZnS047H200.0014，CoCl20.002，pH5.5。发酵培养基(w/v):MandelS盐溶液，2%木糖渣，的微晶纤维素，5%的麸皮汁。权利要求一株过表达β-葡萄糖苷酶的斜卧青霉工程菌株，其特征在于所述菌株含有瑞氏木霉的β-葡萄糖苷酶I(bgl1)cDNA基因，其命名为斜卧青霉(Penicilliumdecumbens)Gi31-2，已于2010月5日7日保藏于“中国典型培养物保藏中心”，保藏号为CCTCCM2010111。2.权利要求1所述的斜卧青霉工程菌在生产β-葡萄糖苷酶酶液中的应用。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述斜卧青霉工程菌生产β-葡萄糖苷酶酶液的形式是以液体发酵方法实施；其中所述发酵方法是将斜卧青霉(Penicilliumdecumbens)Gi31-2CCTCCM2010111接种到装有50_90ml葡萄糖基本培养基的300-500ml三角瓶中，28_30°C，在80_100rpm往复式摇床上培养24_48h，得发酵种子液；将得到的种子液先抽滤收集湿菌丝，再按Ig150ml的比例将湿菌丝接种到发酵培养基中，继续培养100-116h，然后以6000-8000rpm，4°C离心10-15min，收集的上清液即为β-葡萄糖苷酶酶的酶液。全文摘要本发明公开了一株过表达β-葡萄糖苷酶的斜卧青霉工程菌，其含有过表达的β-葡萄糖苷酶基因，该菌命名为斜卧青霉(Penicilliumdecumbens)Gi31-2，并于2010月5日7日保藏于“中国典型培养物保藏中心”，保藏号为CCTCCM2010111。本发明还公开了所述菌株在生产β-葡萄糖苷酶和降解纤维素中的应用。本发明所述工程菌株的β-葡萄糖苷酶活力最高达到3.47IU/ml，是原始宿主菌株的2.90倍；最高滤纸酶活为3.32IU/ml，是原始宿主菌株的1.23倍，预示该菌株在β-葡萄糖苷酶生产中有广泛应用。文档编号C12R1/80GK101845399SQ20101017052公开日2010年9月29日申请日期2010年5月13日优先权日2010年5月13日发明者张艳美,李忠海,杜春梅,汪天虹,钟耀华申请人:山东大学