本发明涉及一种噻唑类化合物，尤其涉及一种抗变形链球菌的新型噻唑类化合物XQH-3-6及其应用。该化合物可以抑制口腔中牙周细菌的生长，可用于防治龋齿，属于口腔疾病防治药物制备技术领域。
背景技术：
龋病(Dental caries)俗称蛀牙，是口腔中的一种常见慢性疾病。龋病慢性发展进而对牙体硬组织造成不可逆的损坏，其分布范围广泛，发病率高，不仅给个人带来疼痛，也造成了巨大的医疗资源浪费，已成为威胁人类口腔健康的全球性问题，世界卫生组织(WHO)将其列为人类重点防治的三大非传染性疾病(心血管疾病、癌症和龋病)之一(Petersen.,2003)。
目前公认的龋病病因学说是“四联因素学说”，即细菌、口腔环境、宿主和时间四种因素共同导致了龋病。口腔温度适宜，含有弱碱性唾液，食物残渣等，为口腔中菌群的繁衍提供了适宜的环境(Loesche.,1986)。细菌是龋病发生的必要因素，口腔中细菌与食物残渣以及唾液混合，牢固的粘附在牙齿表面以及窝沟中，形成菌斑生物膜，成为龋病发生的初始条件。国内外许多学者已经证实变形练球菌(Streptococcus mutans)是导致龋齿最主要的病原菌。变形链球菌是一种革兰氏阳性厌氧细菌，其致龋性与它的粘附、产酸、耐酸以及胞外多糖合成等过程有关(Hamad and Slade.,1980)。变形链球菌产生葡聚糖转移酶代谢糖并将葡萄糖和果糖聚合成葡聚糖和果聚糖，葡聚糖分子量高、粘度大，其吸附在牙齿上并介导变形链球菌和口腔中其他菌群聚集并粘附于牙齿表面形成菌斑，在菌斑环境中变形链球菌产生有机酸，降低口腔环境的pH值，使牙釉质和牙质脱钙从而形成龋病(Lemos et al.,2013)。同时，变形链球菌在低pH值环境中仍然可以生存并代谢碳水化合物，相对于口腔中其他细菌有生长优势。
二十世纪中叶起，氟化物就被用来防龋，氟化物可以通过减少牙釉质脱矿，促进再次矿化，对微生物产生抑制及杀灭作用等机制来预防龋齿。因此氟化物被广泛应用于龋病的临床治疗，但是导致了耐氟菌株的选择性生长。变形链球菌耐氟菌株的产酸和耐酸能力都比亲代菌株强，致龋能力也增强(Van Loveren et al.,1993)。耐氟菌株的出现给氟化物预防治疗龋齿提出新的问题，预防及治疗龋齿的新措施及药物的研发变得十分紧迫。
技术实现要素：
针对现有技术的需求，本发明的目的是提供一种可以抑制变形链球菌的新型噻唑类化合物及其应用。
本发明所述抗变形链球菌的噻唑类化合物XQH-3-6，其特征在于：该化合物化学分子式为C16H16ClN5O4S，中文名称为N1-(3-氯苯基-N4-(5-硝基噻唑-2-基))哌啶-1，4-二甲酰胺，英文名称为N1-(3-chlorophenyl)-N4-(5-nitrothiazol-2-yl)piperidine-1，4-dicarboxamide，分子量为409.85，其化学结构如式(1)所示：
上述化合物易溶于二甲基亚砜(DMSO)，难溶于水。
上述化合物XQH-3-6的合成路线见如下反应式
其中：(a)1-羟基苯并三唑(HOBT)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)，三乙胺，室温；(b)乙酸乙酯氯化氢饱和溶液，室温；或者三氟乙酸/二氯甲烷；(d)三光气，无水乙酸乙酯，0℃到回流；(e)三乙胺，无水四氢呋喃，0℃到室温。
本发明所述噻唑类化合物XQH-3-6在制备抑制和杀伤变形链球菌(Streptococcus mutans)模式菌株和临床菌株的浮游细胞药物中的应用。
本发明所述噻唑类化合物XQH-3-6在制备抑制变形链球菌(Streptococcus mutans)模式菌株和临床菌株生物膜的形成药物中的应用。
本发明所述噻唑类化合物XQH-3-6在制备口腔变形链球菌(Streptococcus mutans)生物膜抑制剂中的应用。
本发明所述噻唑类化合物XQH-3-6在制备防治龋齿的靶向药物中的应用。
本发明所述噻唑类化合物XQH-3-6作为抑菌添加成分在制备牙膏、漱口水或消毒液中的应用。
将粉末状的化合物XQH-3-6用二甲基亚砜溶解，并配成终浓度为1024mg/L的母液贮存。
本发明测定了化合物XQH-3-6对变形链球菌模式菌株和临床菌株的抑制效果。
结果显示，化合物XQH-3-6对浮游状态下的变形链球菌具有很好的抑菌活性和杀菌活性，其对变形链球菌UA159菌株的最小抑菌浓度(MIC)为4mg/L，最小杀菌浓度(MBC)为8mg/L，半数最大抑制浓度(IC50)为0.963mg/L。当培养基中化合物XQH-3-6终浓度达到4mg/L时对变形链球菌UA159菌株生物膜的抑制率为97.69％。化合物XQH-3-6对变形链球菌UA246菌株的最小抑菌浓度(MIC)为4mg/L，最小杀菌浓度(MBC)为32mg/L，半数最大抑制浓度(IC50)为1.505mg/L。当培养基中化合物XQH-3-6终浓度达到4mg/L时对变形链球菌UA246菌株生物膜的抑制率为97.93％。
其中，所使用的变形链球菌UA159菌株为模式菌株，在NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中的参考基因组编号为NC_004350。本发明所使用的变形链球菌UA246菌株为分离自患有龋齿病人的口腔当中的临床菌株。其最适的培养基优选脑心浸液(Brain Heart Infusion)培养基(Brain infusion solids 12.5g/L，Beef heart infusion solids 5.0g/L，Proteose peptone 10.0g/L，Glucose 2.0g/L，Sodium chloride 5.0g/L，Di-sodium phosphate 2.5g/L，pH 7.4±0.2)，在37℃，厌氧培养的最适宜条件下静置培养。
本发明公开的噻唑类化合物XQH-3-6分子量小、结构相对简单，抑菌实验证实具有抑制性强、杀伤效果好等特点，能够显著抑制龋病的主要致病菌——变形链球菌浮游细胞的生长和生物膜的形成，具有预防龋病的潜力，可以作为预防龋齿的新型靶向候选药物。
具体实施方式
下面结合本发明提供的一种抗变形链球菌的新型噻唑类化合物，进一步描述其在杀伤、抑制变形链球菌浮游细胞及其生物膜形成过程中的应用。所述内容是对本发明的解释而不是限定。
实施例1：化合物XQH-3-6的制备
化合物XQH-3-6的合成路线见如下反应式：
其中：(a)1-羟基苯并三唑(HOBT)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)，三乙胺，室温；(b)乙酸乙酯氯化氢饱和溶液，室温；或者三氟乙酸/二氯甲烷；(d)三光气，无水乙酸乙酯，0℃到回流；(e)三乙胺，无水四氢呋喃，0℃到室温。
反应过程中所涉及的溶剂如需干燥，则根据常用的标准干燥方法进行干燥处理。具体反应过程：
(1)中间体4-叔丁基-((5-硝基噻唑-2-基)氨基甲酰-1-羧酸(1)的制备。
将1-Boc-4-哌啶甲酸(1eq)溶解于N,N二甲基甲酰胺，再分别加入HOBt(1.2eq)和EDCI(1.2eq)，滴加三乙胺(1.2eq)，滴加完毕，再加入5-硝基2-氨基噻唑(1.2eq)，在常温下反应过夜，向反应液中加200ml的蒸馏水，水相用乙酸乙酯萃取三次(3×200ml)，合并有机相用饱和NaCl洗两次(2×100ml)，无水硫酸镁干燥，然后用旋转蒸发仪蒸发浓缩得粗品。粗品经硅胶色谱柱柱纯化分离(二氯甲烷:甲醇＝v:v,200:1)得到黄色固体，产率75％。
(2)中间体2-(4-氨基-1-基)-N-(5-硝基噻唑-2-基)哌啶-4-甲酰胺(2)的制备。
方法1：将乙酰氯慢慢滴入无水乙醇中(v:v,4:5)，生成HCl和乙酸乙酯，再将上一步中间体溶于其中,在常温下搅拌15分钟，用TLC检测反应完全，蒸干溶剂，得黄色固体，粗产品产率100％，未经处理直接进行下一步。
方法2：冰浴下，将上一步中间体溶于少量的无水二氯甲烷中，逐滴滴加三氟乙酸溶液(2eq)，该溶液自然升温至室温后，继续反应3小时，至TLC监测反应已经完毕。整除有机溶剂，所得的粗产品未经处理直接投入到下一步中。
(3)N1-(3-氯苯基-N4-(5-硝基噻唑-2-基)哌啶-1,4-二甲酰胺(XQH-3-6)制备。
在0℃将中间体3(1eq)和三乙胺(1.2eq)溶解于无水四氢呋喃中，再逐滴滴加3-氯苯基异氰酸酯(1.2eq)，搅拌3h，用TLC检测反应，蒸出四氢呋喃，向反应液中加50ml的蒸馏水，水相用乙酸乙酯萃取三次(3×50ml)，合并有机相用饱和氯化钠溶液洗两次(2×50ml)，无水硫酸镁干燥30分钟，然后经真空蒸发浓缩得粗品。粗品经硅胶色谱柱(200～300目)纯化分离，(二氯甲烷:甲醇＝50:1)作为洗脱剂，得到类白色固体，产率67％，1H NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ13.15(s,1H),8.72(s,1H),8.64(s,1H),7.66(s,1H),7.40(d,J＝8.2Hz,1H),7.25(t,J＝8.1Hz,1H),6.97(d,J＝7.8Hz,1H),4.16(d,J＝13.3Hz,2H),2.95-2.77(m,3H),1.91(d,J＝11.3Hz,2H),1.59(m,2H).ESI-MS:409.9[M+H].
实施例2：变形链球菌的制备
(1)培养变形链球菌的培养基为脑心浸液(Brain Heart Infusion)培养基(品牌OXOID，货号CM1135)，培养基主要成分为Brain infusion solids 12.5g/L，Beef heart infusion solids 5.0g/L，Proteose peptone 10.0g/L，Glucose 2.0g/L，Sodium chloride 5.0g/L，Di-sodium phosphate2.5g/L，pH 7.4±0.2。如需固体培养基，则需再添加1.5％的琼脂粉。115℃湿热灭菌30min，冷却后待用。
(2)培养变形链球菌生物膜的培养基为脑心浸液-蔗糖培养基。配制方法为将蔗糖配成20％贮存液并用0.22μm的无菌滤器过滤除菌，在脑心浸液培养基中添加终浓度为1％的蔗糖。
(3)将变形链球菌模式菌株UA159及临床菌株UA246的菌液接种于脑心浸液固体培养基上并进行划线，于37℃，厌氧倒置培养24小时，出现明显的单菌落。
(4)用无菌的接种环分别挑取一个变形链球菌UA159和UA246菌株的单菌落，接种到装有脑心浸液液体培养基的试管中，于37℃下厌氧静止培养，至试管内液体浑浊。
(5)用紫外可见光分光光度计分别测定变形链球菌UA159及UA246在600nm波长的吸收值(OD600)。
(6)化合物XQH-3-6用分析天平精确称量，加入二甲基亚砜将其溶解，配成浓度为1024mg/L的贮存液，使用0.22μm的无菌滤器过滤除菌，存放于-20℃待用。
实施例3：化合物XQH-2-92对变形链球菌浮游细胞的活性检测
(1)按照实施例2中描述的方法准备变形链球菌菌液和化合物XQH-3-6，将培养制对数期(OD600＝0.8～1.0)的变形链球菌UA159和UA246菌液用脑心浸液液体培养基稀释至终浓度为5×105cfu/ml待用。
(2)化合物XQH-3-6对变形链球菌UA159和UA246浮游细胞的最小抑菌浓度的检测采用微量肉汤稀释法。无菌96孔板的每一个孔中变形链球菌菌液终浓度为5×105cfu/ml，在第一孔加入按上述方法配制的化合物XQH-3-6的贮存液并调整到终浓度为256mg/L，混匀，然后吸取150μl至第2孔，混匀后再吸取150μl至第3孔，如此连续倍比稀释至第11孔，并从第11孔中吸取150μl弃去。至此，第1至第11孔为加药液的实验组，第12孔为不加药作为生长对照组。第1孔至第12孔药物浓度分别为256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0μg/ml。以在小孔内完全抑制细菌生长的最低浓度定位最小抑菌浓度(MIC)。
(3)取孔内的菌液均匀涂布到脑心浸液琼脂固体培养基上后，37℃厌氧倒置培养24小时，以没有细菌生长的最低浓度定位最小杀菌浓度(MBC)。
(4)用酶标仪检测96孔板每个内在600nm波长下的吸光度值，计算每个药物浓度条件下细胞的抑制率，计算公式为抑制率＝(1-实验组/生长对照组)×100％，所得数据使用SPSS统计软件计算半数最大抑制浓度(IC50)，实验结果如表1所示。
表1.化合物XQH-3-6对变形链球菌UA159和UA246浮游细胞的活性检测
表1中，MIC：最小抑菌浓度；MBC：最小杀菌浓度；IC50：半数最大抑制浓度
从表1我们可以看出，化合物XQH-3-6对变形链球菌UA159和UA246浮游细胞具有很好的杀菌和抑菌活性。化合物XQH-3-6对变形链球菌UA159浮游细胞的活性要明显好于变形链球菌UA246。
实施例4：化合物XQH-2-92对变形链球菌生物膜的抑制活性
(1)按照实施例1和2中描述的方法准备变形链球菌菌液和化合物XQH-3-6，用脑心浸液-蔗糖培养基将处于对数期的变形链球菌稀释至终浓度为5×105cfu/ml待用。
(2)向无菌的96孔板中加入(1)中的菌液150μl，并以加入化合物XQH-3-6的孔(终浓度4mg/L)作为实验组，以不加化合物XQH-3-6的孔作为对照组。于37℃厌氧静置培养40小时。
(3)将96孔板每个孔中的浮游细胞移走，并用大量的水冲洗以移走未吸附的细胞。
(4)向每个孔中加入200μl 0.1％的结晶紫溶液在室温下进行染色，静置5min后移走结晶紫溶液，并用大量水冲洗掉除去未吸附的结晶紫溶液。
(5)向每个孔中加入200μl 33％的乙酸溶液来溶解吸附的结晶紫，然后使用酶标仪检测在590nm波长下的吸光度值，计算生物膜的抑制率，计算公式同实施例1。
结果显示，当培养基中化合物XQH-2-6达到4mg/L时对变形链球菌UA159菌株生物膜的抑制率为97.93％，对变形链球菌UA246菌株生物膜的抑制率为97.69％。