一种猪肺炎支原体的实时荧光PCR检测试剂盒及其用途的制作方法

文档序号:12056589阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种猪肺炎支原体的实时荧光PCR检测试剂盒,其特征在于,包括扩增引物和特异性荧光探针,所述扩增引物和特异性荧光探针的序列如下所示:

上游扩增引物P46-f:5’-TTCGCTTGCATCAATTATTG-3’,其为SEQ ID NO:1序列;

下游扩增引物P46-r:5’-CGGATTGTGGTTTAGAATC-3’,其为SEQ ID NO:2序列;

特异性荧光探针P46-p:FAM-5’-TGATTCTGTCTGTCCACAACCTGCTGC-3’-TAMRA,其为SEQ ID NO:3序列,其中FAM为荧光报告基团,TAMRA为荧光淬灭基团。

2.根据权利要求1所述的猪肺炎支原体的实时荧光PCR检测试剂盒,其特征在于,所述上游扩增引物P46-f、所述下游扩增引物P46-r和所述特异性荧光探针P46-p的摩尔比为2:2:1。

3.根据权利要求2所述的猪肺炎支原体的实时荧光PCR检测试剂盒,其特征在于,所述上游扩增引物P46-f、所述下游扩增引物P46-r和所述特异性荧光探针P46-p在所述试剂盒中的使用终浓度均为0.1~0.4μM。

4.根据权利要求1所述的猪肺炎支原体的实时荧光PCR检测试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括阴性对照、阳性对照、荧光PCR反应液(含酶)、裂解液及说明书。

5.根据权利要求4所述的猪肺炎支原体的实时荧光PCR检测试剂盒,其特征在于,所述阴性对照为无RNA酶与DNA酶的ddH2O;所述阳性对照为克隆有猪肺炎支原体p46基因序列的克隆质粒pEASY-p46,克隆质粒pEASY-p46的终浓度为1.0×105copies/μL~1.0×107copies/μL;所述裂解液的成分及配比如下:①盐酸胍4-6M;②十二烷基磺酸钠SDS 0.1-0.2%;③吐温20 1-2%;④乙基苯基聚乙二醇NP40 1-2%。

6.根据权利要求5所述的猪肺炎支原体的实时荧光PCR检测试剂盒,其特征在于,所述猪肺炎支原体p46基因序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

7.根据权利要求6所述的猪肺炎支原体的实时荧光PCR检测试剂盒,其特征在于,所述克隆质粒pEASY-p46采用以下方法制备得到:提取猪肺炎支原体DNA,利用引物p46-f和p46-r扩增得到猪肺炎支原体p46基因片段,通过TA克隆将猪肺炎支原体p46基因片段连接至pEASY-T1载体,转化后筛选阳性克隆,测序正确的克隆质粒命名为pEASY-p46。

8.一种如权利要求1-7任一项所述的猪肺炎支原体的实时荧光PCR检测试剂盒的使用方法,其特征在于,包括以下步骤:

(1)使用权利要求1-7任一项所述的实时荧光PCR试剂盒进行PCR扩增时,实时荧光PCR反应体系以20μL计为:

10μM的SEQ ID NO:1所示的上游扩增引物P46-f:0.4~0.8μL;

10μM的SEQ ID NO:2所示的下游扩增引物P46-r:0.4~0.8μL;

10M的SEQ ID NO:3所示的特异性荧光探针P46-p:0.2~0.4μL;

荧光PCR反应液(含酶):16μL;

DNA模板:2~3μL;

ddH2O:补足至20μL;

(2)实时荧光PCR的反应条件为:50℃UNG酶激活2min;95℃预变性5min;95℃变性15Sec,60℃退火30Sec并收集荧光,共40个循环;结束反应;

(3)结果分析:

质量控制:阴性对照FAM通道检测无Ct值;阳性对照FAM通道检测Ct值≤30;上述条件同时满足,检测结果有效;

结果判定:FAM通道检测Ct值≤40,则判定样品为猪肺炎支原体感染阳性;FAM通道检测无Ct值,则判定样品为猪肺炎支原体感染阴性。

9.根据权利要求8所述的猪肺炎支原体的实时荧光PCR检测试剂盒的使用方法,其特征在于,所述DNA模板采用以下方法制备得到:

(1)全血、病料组织等可使用商品化DNA提纯试剂盒进行提取,方法参照所使用试剂盒说明书;或者

(2)拭子、空气样品、血清或血浆可使用本发明试剂盒中提供的裂解液进行DNA释放,将上述类型样品进行瞬时离心后,微量取样品上清1-2μL置PCR反应管中,加入等体积的裂解液,混匀室温静置5min,加入反应体系进行扩增。

10.权利要求1-7任一项所述的试剂盒在制备检测猪肺炎支原体试剂中的用途。

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