本发明在韩国保健福祉部的支援下，通过课题号hi06c0868进行，上述课题的研究管理专门机关为韩国保健产业振兴院、研究项目名称为"先导型特性化研究事业"、研究课题名称为“开发将wnt信号机制用作靶的抗癌剂”、主管机关为首尔牙山医院先导型癌症研究事业团，研究期间为2013年12月01日～2016年11月30日。
本发明涉及与聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(parp，polyadpribosepolymerase)及端锚聚合酶(tankyrase)双重抑制剂相关的灵敏度确定方法。
背景技术：
生物标志被定义为是“可客观地测定且评价与正常的生物学过程、疾病进行状况及治疗方法相关的药物的反应性的指标”。最近，由基因分析技术，随着与特定基因的变异和特定疾病之间的关联性相关的研究增加生物标志被重新定义为均包括基因和遗传性变异、由此引起的核糖核酸(rna)、蛋白质、代谢物质表达的生物学指标。
并且，进行可判断生物标志是否敏感的同伴诊断剂(companiondignosticsdevice，cdx)的开发，从而为了进一步有效的治疗将医药品的治疗效果最大化或分类可将副作用最小化的患者组。
大肠为从小肠末端连接到肛门的长约150cm的长管状消化器官，分为盲肠、结肠、直肠及肛门管，其中发生在结肠及直肠的恶性肿瘤为结肠癌。大多数结直肠癌为腺癌(腺癌)，它是发生在粘膜的腺细胞的癌症，另外原发性地可产生淋巴瘤、恶性类癌瘤、平滑肌肉瘤等。
本说明书全文中，参照了多篇论文及专利文献，并表示了其引用。所引用的论文及专利文献的公开内容全部插入于本说明书作为参照，从而更加明确说明本发明所属的技术领域的水平及本发明的内容。
技术实现要素：
技术问题
本发明人为了将作为大肠癌治疗剂的聚腺苷二磷酸核糖聚合酶及端锚聚合酶的双重抑制剂的治疗效果最大化，努力开发确定对上述聚腺苷二磷酸核糖聚合酶及端锚聚合酶双重抑制剂的灵敏度的方法。其结果，确认在从大肠癌患者分离的大肠癌细胞的p53基因型为正常型，脱氧核糖核酸连接酶4的基因型为突变型的情况下，可将上述聚腺苷二磷酸核糖聚合酶及端锚聚合酶抑制剂的治疗效果最大化，从而完成了本发明。
因此，本发明的目的在于提供与聚腺苷二磷酸核糖聚合酶及端锚聚合酶抑制剂相关的灵敏度确定方法。
本发明的另一目的在于，提供与聚腺苷二磷酸核糖聚合酶及端锚聚合酶抑制剂相关的灵敏度确定用试剂盒。
根据以下发明的详细说明、发明要求保护范围及附图更加明确本发明的其他目的及优点。
解决问题的方案
根据本发明的一实施方式提供对聚腺苷二磷酸核糖聚合酶及端锚聚合酶双重抑制剂的灵敏度确定方法，上述对聚腺苷二磷酸核糖聚合酶及端锚聚合酶双重抑制剂的灵敏度确定方法包括：步骤a，从大肠癌患者分离大肠癌细胞；步骤b，对上述步骤a的大肠癌细胞的核酸分子进行分离；以及步骤c，作为确认上述步骤b的核酸分子的p53基因及脱氧核糖核酸连接酶4(dnaligase4)基因的基因型的步骤，在上述p53基因的基因型为正常型且上述脱氧核糖核酸连接酶4基因的基因型为突变型的情况下，判断为相对于聚腺苷二磷酸核糖聚合酶及端锚聚合酶双重抑制剂有灵敏度。
本发明人为了将作为大肠癌治疗剂的聚腺苷二磷酸核糖聚合酶及端锚聚合酶抑制剂的治疗效果最大化，努力开发确定对上述聚腺苷二磷酸核糖聚合酶及端锚聚合酶双重抑制剂的灵敏度的方法。其结果，确认在从大肠癌患者分离的大肠癌细胞的p53基因型为正常型，脱氧核糖核酸连接酶4基因的基因型为突变型的情况下，可将上述聚腺苷二磷酸核糖聚合酶及端锚聚合酶抑制剂的治疗效果最大化。
按步骤对本发明的对聚腺苷二磷酸核糖聚合酶及端锚聚合酶双重抑制剂的灵敏度确定方法进行详细说明。
步骤a大肠癌细胞的分离
首先，为了从大肠癌患者取得大肠癌细胞，可通过对大肠癌组织进行切割后处理适当的蛋白质分解酶来取得。
上述蛋白质分解酶可以为选自由木瓜蛋白酶(papain)、胰酶(pancreatin)、胰蛋白酶(trypsin)、胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)、胃蛋白酶(pepsin)、链激酶(streptokinase)、链球菌脱氧核糖核酸酶(streptodornase)、无花果蛋白酶(ficain)、羧肽酶(0carboxypeptidase)、氨肽酶(aminopeptidase)、木瓜凝乳蛋白酶(chymopapain)、菠萝蛋白酶(bromelin)及枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)组成的组中的一种以上的蛋白质分解酶。
步骤b核酸分子的分离
然后，对上述步骤a的大肠癌细胞的核酸分子进行分离。
在本说明书中“核酸分子”具有总括脱氧核糖核酸(dna)(基因组脱氧核糖核酸(gdna)及互补脱氧核糖核酸(cdna)及核糖核酸分子的意义，在核酸分子中作为基本结构单位的核苷酸不仅包括天然的核苷酸，而且还包括糖或碱基部位变形的类似物(analogue)(scheit,nucleotideanalogs,johnwiley,newyork(1980)；uhlman以及peyman,chemicalreviews,90:543-584(1990))。
在本发明的方法中，可从大肠癌患者的大肠癌组织分离的大肠癌细胞取得上述核酸分子。
步骤cp53及脱氧核糖核酸连接酶4的基因型确认
然后，作为确认上述步骤b的核酸分子的p53基因及脱氧核糖核酸连接酶4基因的基因型的步骤，在上述p53基因的基因型为正常型且上述脱氧核糖核酸连接酶4基因的基因型为突变型的情况下，判断为相对于聚腺苷二磷酸核糖聚合酶及端锚聚合酶双重抑制剂有灵敏度。
在初始物质为基因组脱氧核糖核酸的情况下，为了确认上述基因型，可暗战在本发明所属技术领域中公知的方法进行基因组脱氧核糖核酸的分离
在本发明的方法中，可应用利用于查明(genotyping)基因型的在本发明所属技术领域中公知的方法，来进行上述步骤c。
根据本发明的一实例，上述步骤c通过脱氧核糖核酸测序、聚合酶链式反应(pcr，polymerasechainreaction)、限制性片段长度多态性(rflp，restrictionfragmentlengthpolymorphism)、随机扩增多态性检测(rapd，randomamplifiedpolymorphicdetection)、扩增片段长度多态性检测(aflpd，amplifiedfragmentlengthpolymorphismdetection)、等位基因特异性寡核苷酸(aso，allelespecificoligonucleotide)探针或脱氧核糖核酸微阵列进行。
在上述p53基因的基因型为正常型，上述脱氧核糖核酸连接酶4基因的基因型为突变型的情况下，判断为对聚腺苷二磷酸核糖聚合酶及端锚聚合酶抑制剂有灵敏度。
根据本发明的一实例，上述p53基因在基因型为正常型的情况下，包含序列表中序列1的核苷酸序列，上述脱氧核糖核酸连接酶4基因在基因型为正常型的情况下包含序列表中序列2的核苷酸序列。
在上述脱氧核糖核酸连接酶4基因的基因型为突变型的情况下，包含脱氧核糖核酸连接酶4的核苷酸序列的变异。
根据本发明的另一实例，在上述脱氧核糖核酸连接酶4基因为选自由作为序列表中序列2的第八个碱基的胞嘧啶(cytosine)被胸腺嘧啶(thymine)取代、作为第二十六个碱基的胞嘧啶被胸腺嘧啶取代、作为第八百三十三个碱基的鸟嘌呤被腺嘌呤(adenine)取代以及作为第一千七百零四个碱基的胸腺嘧啶(thymine)被胞嘧啶取代的情况组成的组中的一种以上的情况下判断为基因型为突变型。
在上述脱氧核糖核酸连接酶4基因的基因型为突变型的情况下，包含脱氧核糖核酸连接酶4的氨基酸序列的变异。
根据本发明的一实例，在上述脱氧核糖核酸连接酶4基因为选自由作为序列表中第三序列的第三个氨基酸的丙氨酸(alanine)被缬氨酸(valine)取代、作为第九个氨基酸的苏氨酸(threonine)被异亮氨酸(isoleucine)取代、作为第二百七十八个氨基酸的精氨酸(arginine)被组氨酸(histidine)取代以及作为第五百六十八个氨基酸的天门冬氨酸(asparticacid,gat)的胸腺嘧啶碱基被胞嘧啶取代的情况组成的组中的一种以上的情况下，判断为基因型为突变型。
上述第五百六十八个氨基酸的天门冬氨酸的胸腺嘧啶碱基被胞嘧啶取代的情况是指作为对作为第五百六十八个氨基酸的天门冬氨酸进行编码化的密码子的天门冬氨酸中，胸腺嘧啶碱基为被胞嘧啶取代的天门冬氨酸。
作为确认上述核酸分子的p53基因及脱氧核糖核酸连接酶4基因的基因型的步骤，在上述p53基因的基因型为正常型，上述脱氧核糖核酸连接酶4基因的基因型为突变型的情况下，判断为对聚腺苷二磷酸核糖聚合酶及端锚聚合酶抑制剂有灵敏度。
根据本发明的一实例，上述聚腺苷二磷酸核糖聚合酶及端锚聚合酶抑制剂化合物a的iupac名称为8-[(二甲基氨基)甲基]-10-乙氧基-1，2，3，4-四氢苯并[h][1，6]萘啶-5(6h)-酮，化合物b的iupac名称为6-{4-[(5-氧代-1，2，3，4，5，6-六氢苯并[h][1，6]萘啶-8-基)甲基]哌嗪-1-基}烟腈。
根据本发明的另一实施方式，本发明提供对聚腺苷二磷酸核糖聚合酶及端锚聚合酶双重抑制剂的灵敏度确定用试剂盒，上述对聚腺苷二磷酸核糖聚合酶及端锚聚合酶双重抑制剂的灵敏度确定用试剂盒包括：a)与对p53基因进行编码的核苷酸序列特异性地结合的引物或探针；以及(b)与对脱氧核糖核酸连接酶4基因进行编码的核苷酸序列特异性地结合的引物或探针。
在本说明书中所使用的术语“引物”是指在适当的温度条件下，在适当的缓冲液下且适当的条件(即，4种不同核苷三磷酸及聚合反应酶)下，可作为模板-指示合成脱氧核糖核酸(dna)的起始点起到作用的单链寡核苷酸。引物的适当的长度根据多种要素，例如，根据温度和引物的用途有变化，但是典型地，为15～30核苷酸。为了形成于模板充分地稳定的杂交复合物，短的引物分子通常需要较低的温度。
引物的序列无需具有与模板的一部分序列完全互补的序列，在与模板进行杂交来可起到引物固有的作用的范围下，具有充分的互补性即可。因此，本发明中的引物无需具有与作为模板的上述的核苷酸序列完整地互补的序列，在于上述基因序列杂交化，来可起到引物作用的范围下具有充分的互补性就充分。本发明所属技术领域的普通技术人员可利用上述的核苷酸序列容易进行这种引物的设计，例如，可利用引物设计用程序(例：primer3程序)进行。
在本说明中所使用的术语“探针”是指天然的或变形的单体或链接(linkages)的线形寡聚物，并包含脱氧核糖核苷酸及核糖核苷酸，可与靶核苷酸序列特异性地杂交，是天然存在或人为合成的。优选地，本发明的探针为单链，为寡脱氧核糖核苷酸。
可在基因库(genbank)中确认制备引物或探针时需要参照的本发明标志的核苷酸序列。例如，在基因库接入号码nm_000546.5中公开本发明的p53，在基因库接入号码nm_002312.3中公开脱氧核糖核酸连接酶4的核苷酸序列，可参照上述徐磊涉及引物或探针。
根据本发明的一实例，对上述p53基因进行编码的核苷酸序列为序列表中序列1，对上述脱氧核糖核酸连接酶4基因进行编码的核苷酸序列为序列表中序列2。
根据本发明的另一实例，为了检测上述脱氧核糖核酸连接酶4基因突变型利用序列表中序列8及序列9的引物对、序列表中序列10及序列11的引物对及序列表中序列12及序列13的引物对。
发明的效果
对本发明的特征及优点进行概括如下：
(a)本发明提供对聚腺苷二磷酸核糖聚合酶及端锚聚合酶双重抑制剂的灵敏度(susceptibility)的确定方法及试剂盒。
(b)在本发明中，可通过分类具有对聚腺苷二磷酸核糖聚合酶及端锚聚合酶双重抑制剂的灵敏度的患者组，来将大肠癌治疗效果最大化。
附图说明
图1表示在人类大肠癌细胞株hct116中对在作为聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a的抗癌灵敏度和是否存在p53及脱氧核糖核酸修复相关基因(atr、xlf、xrcc4及脱氧核糖核酸连接酶4)的关联性进行分析的结果。
图2表示在多种人类大肠癌细胞株(rko、lovo及sw620)中，对与作为基于p53基因型及脱氧核糖核酸连接酶4基因型的聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a及奥拉帕尼(olaparib)相关的细胞凋亡进行分析的结果。
图3通过免疫化学法表示在p53基因型及脱氧核糖核酸连接酶4基因型为正常型的人类大肠癌细胞株hct116中，对与作为聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a及奥拉帕尼处理相关的脱氧核糖核酸损伤进行分析的结果。
图4通过免疫化学法表示在p53基因型为正常型，脱氧核糖核酸连接酶4基因型为突变型的人类大肠癌细胞株rko中，对与作为聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a及奥拉帕尼处理相关的脱氧核糖核酸损伤进行分析的结果。
图5的(a)部分及图5的(b)部分通过免疫印迹法表示在人类大肠癌细胞株hct116及rko中与作为聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a及奥拉帕尼处理相关的脱氧核糖核酸损伤及细胞凋亡。
图6表示使突变型脱氧核糖核酸连接酶4(g833a或t1704c)在人类大肠癌细胞株hct8(p53野生型(wt)/脱氧核糖核酸连接酶4野生型)中过表达，并对与作为聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a处理相关的细胞凋亡进行分析的结果。
图7表示使突变型脱氧核糖核酸连接酶4(g833a或t1704c)在人类大肠癌细胞株sw620(p53突变型(mt)/脱氧核糖核酸连接酶4野生型)中过表达，并对与作为聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a处理相关的细胞凋亡进行分析的结果。
图8的(a)部分及图8的(b)部分表示使突变型脱氧核糖核酸连接酶4(g833a或t1704c)在人类大肠癌细胞株hct8(p53野生型/脱氧核糖核酸连接酶4野生型)中过表达，并对与作为聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a处理相关的脱氧核糖核酸损伤及细胞凋亡进行分析的结果。
图9的(a)部分及图9的(b)部分表示使突变型p53和正常型脱氧核糖核酸连接酶4分别在人类大肠癌细胞株rko(p53野生型/脱氧核糖核酸连接酶4突变型)中过表达，并对与作为聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a及奥拉帕尼处理相关的细胞凋亡进行分析的结果。
图10的(a)部分及图10的(b)部分表示在p53基因型为正常型且脱氧核糖核酸连接酶4基因型为突变型的人类大肠癌细胞株(rko、lovo)中，对与作为聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a及化合物b处理相关的细胞凋亡进行分析的结果。
图11的(a)部分至图11的(d)部分表示在人类大肠癌细胞株rko(p53野生型/脱氧核糖核酸连接酶4突变型)、sw620(p53突变型/脱氧核糖核酸连接酶4野生型)、hct8(p53野生型/脱氧核糖核酸连接酶4野生型)、km12c(p53突变型/脱氧核糖核酸连接酶4突变型)中与作为聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a、化合物b、奥拉帕尼及nvp-tnks656处理相关的细胞凋亡分析结果。
图12的(a)部分及图12的(b)部分表示使突变型p53和正常型脱氧核糖核酸连接酶4分别在人类大肠癌细胞株rko(p53野生型/脱氧核糖核酸连接酶4突变型)中过表达，并对与作为聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物b及奥拉帕尼处理相关的细胞凋亡进行分析的结果。
图13的(a)部分及图13的(b)部分表示使突变型p53和正常型脱氧核糖核酸连接酶4分别在人类大肠癌细胞株lovo(p53野生型/脱氧核糖核酸连接酶4突变型)，并对与作为聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物b及奥拉帕尼处理相关的细胞凋亡进行分析的结果。
图14的(a)部分及图14的(b)通过免疫印迹法表示使突变型p53和正常型脱氧核糖核酸连接酶4分别在人类大肠癌细胞株lovo(p53野生型/脱氧核糖核酸连接酶4突变型)中过表达，并与作为聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物b及奥拉帕尼处理相关的脱氧核糖核酸损伤及细胞凋亡。
图15的(a)部分及图15的(b)部分表示在利用人类大肠癌细胞株rko(p53野生型/脱氧核糖核酸连接酶4突变型)的体内异种移植模型(invivoxenograftmodel)中与作为聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a和奥拉帕尼给药相关的肿瘤抑制分析结果。
图16的(a)部分及图16的(b)部分表示在利用人类sw620(p53突变型/脱氧核糖核酸连接酶4野生型)的体内异种移植模型中与作为聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a和奥拉帕尼给药相关的肿瘤抑制分析结果。
图17的(a)部分及图17的(b)部分表示在利用人类大肠癌细胞株km12c(p53突变型/脱氧核糖核酸连接酶4突变型)的体内异种移植模型中与作为聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a和奥拉帕尼给药相关的肿瘤抑制分析结果。
图18的(a)部分及图18的(b)部分表示在利用人类大肠癌细胞株rko(p53野生型/脱氧核糖核酸连接酶4突变型)的体内异种移植模型中与作为聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物b和奥拉帕尼给药相关的肿瘤抑制分析结果。
图19的(a)部分及图19的(b)部分表示在利用人类大肠癌细胞株km12c(p53突变型/脱氧核糖核酸连接酶4突变型)的体内异种移植模型中与作为聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物b给药相关的肿瘤抑制分析结果。
图20示出在来源于大肠癌患者细胞11-ct-79558d(p53野生型/脱氧核糖核酸连接酶4突变型)、11-ct-80464b(p53野生型/脱氧核糖核酸连接酶4突变型)、11ct-94575(p53野生型/脱氧核糖核酸连接酶4野生型)、13ct-78649b(p53野生型/脱氧核糖核酸连接酶4野生型)中，与作为聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物b及奥拉帕尼处理相关的细胞形状分析结果。
具体实施方式
以下，通过实施例更详细地说明本发明。这些实施例只用于更详细地说明本发明，根据本发明的要旨，本发明的范围并不限制于这些实施例，这对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说是显而易见的。
适用于本发明的新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂化合物a的iupac名称为8-[(二甲基氨基)甲基]-10-乙氧基-1，2，3，4-四氢苯并[h][1，6]萘啶-5(6h)-酮，化合物b的iupac名称为6-{4-[(5-氧代-1，2，3，4，5，6-六氢苯并[h][1，6]萘啶-8-基)甲基]哌嗪-1-基}烟腈。
实施例1：作为聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a的ic50分析
本发明人为了对在18种人类大肠癌细胞株(从韩国细胞株银行及atcc购买)中作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a的抗癌活性进行分析，通过体外细胞碱基分析(invitrocellbaseassay)测定了与作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a相关的细胞株的生存能力(cellviability)和ic50。作为上述实验的条件和方法，通过在rpmi1640(罗斯韦尔公园纪念研究所(roswellparkmemorialinstitute)1640；10％的胎牛血清(fbs)，1％的青霉素/链霉素)中培养总18种人类大肠癌细胞株，来在37℃的温度下，在96孔板中，以每孔2×103个的方式培养各个细胞株，并相对于作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a在最大100μm条件下，以最少0.390625μm稀释两倍(100μm、50μm、25μm、12.5μm、6.25μm、3.125μm、1.5625μm、0.78125μm及0.390625μm)，来处理后，在37℃的温度下，培养72小时来利用mts分析(普洛麦格公司(promega)，celltiter96aqeousonesolution)测定各个细胞株的生存能力，并利用prism程序测定了各个细胞株的ic50。
试验结果
在18种人类大肠癌细胞株中分别对作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a进行处理，来利用mts分析分析ic50，结果在10种(hct116、ht29、rko、lovo、ls174t、colo201、colo205、colo320hsr、hct8及caco-2)的细胞株中呈现对化合物a具有显著性的ic50值。
表1
实施例2：基于p53基因型的化合物a的抗癌灵敏度
本发明人利用与实施例1相同的实验方法通过体外细胞碱基分析(invitrocellbaseassay)分析了在18种人类大肠癌细胞株中，作为18种的人类大肠癌细胞株、作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a的抗癌功效及p53基因的基因型的关联性。
实验结果
在18种人类大肠癌细胞株中对在作为聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a的ic50和大肠癌中普遍发生的p53的基因型进行比较，结果，p53基因型为正常的大肠癌细胞的ic50值分析得低，从而呈现作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a和p53基因型的关联性。
表2
实施例3：化合物a的抗癌灵敏度基因型分析
本发明人为了对基于是否存在p53基因及是否存在脱氧核糖核酸修复基因的作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a的细胞凋亡程度进行分析，利用众所周知为脱氧核糖核酸修复基因的脱氧核糖核酸连接酶4干扰核糖核酸(sirna)沉默(knockdown)方法使在人类大肠癌细胞株hct116中的基因表达减少后，处理作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a，然后通过台盼蓝色染色法测定细胞数，来确认了细胞凋亡程度。作为上述实验的条件和方法，通过在rpmi1640(10％的胎牛血清、1％的青霉素/链霉素)中培养p53基因为正常的hct116和p53基因缺失的hct116p53null人类大肠癌细胞株，来在37℃的温度下，在96㎜板中，以每孔1×105个的方式培养24小时，并利用脂质体2000(lipofectamin2000，英杰公司(invitrogen))使atr、xlf、xrcc4及脱氧核糖核酸连接酶4(序列表中的序列4；atr小干扰核糖核酸5’-gaguucucagaagucaacc-3’、序列表中的序列5；xlf小干扰核糖核酸5’-cgcugauucgagaucgauuga-3’、序列表中的序列6；xrcc4小干扰核糖核酸5’-cugaucucucuggguuggcuu-3’、序列表中的序列7；脱氧核糖核酸连接酶4小干扰核糖核酸5’-gggagugucucauguaaua-3’)向细胞内流入来在37℃的温度下沉默(knockdown)48小时后，处理25μm及50μm的作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a，并培养48小时后，通过台盼蓝色染色法测定细胞数来确认了细胞凋亡程度。
实验结果
在作为p53的基因型为正常的大肠癌细胞株的hct116及p53-缺失hct116(hct116p53null)中，根据是否存在p53基因使脱氧核糖核酸修复相关的基因沉默(knockdown)后，对仅作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a呈现灵敏度的脱氧核糖核酸修复基因进行分析，结果在p53基因为正常且脱氧核糖核酸连接酶4基因缺失的情况下，大大地增加细胞凋亡，来对作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a呈现选择性的结果(图1)。
实施例4：在大肠癌细胞中的脱氧核糖核酸连接酶4基因型分析
本发明人为了对在大肠癌细胞株中的脱氧核糖核酸连接酶4基因型进行确认，通过逆转录聚合酶链式反应(rt-pcr)和测序分析了在20种大肠癌细胞株中脱氧核糖核酸连接酶4的基因型是否变异/缺乏。作为上述实验的条件和方法，相对于总20种大肠癌细胞株通过trizol试剂核糖核酸提取法，利用均质器(homogenizer)提取总核糖核酸，来将500ng的总核糖核酸重新合称为互补脱氧核糖核酸，从而利用(序列表中序列8；脱氧核糖核酸连接酶4引物exon2-1正向引物5’-gctagctgctattgcagatattgagc-3’、序列表中序列9；脱氧核糖核酸连接酶4引物exon2-1逆向引物5’-agaaccttcagtaggagaagcaccaa-3’、序列表中序列10；脱氧核糖核酸连接酶4引物exon2-2正向引物5’-cctggtgagaagccatctgt-3’、序列表中序列11；脱氧核糖核酸连接酶4引物exon2-2逆向引物5’-gccttccccctaagttgttc-3’)进行聚合酶链式反应(pcr)，来在1％的琼脂糖凝胶中进行电泳，然后通过et-br染色，来利用桑格测序法(sangersequencing)确认了脱氧核糖核酸连接酶4的表达得到确认的聚合酶链式反应生产物。
实验结果
相对于脱氧核糖核酸连接酶4基因型是否突变，在20种人类大肠癌细胞株中，利用桑格测序法对作为脱氧核糖核酸连接酶4基因的功能丧失突变部位众所周知的g833及t1704部位进行分析，结果确认了在20种中8种的大肠癌细胞株中存在脱氧核糖核酸连接酶4基因型的突变。
表3
实施例5：基于p53及脱氧核糖核酸连接酶4基因型的细胞凋亡分析
本发明人为了对基于p53基因型及脱氧核糖核酸连接酶4基因型的作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a的细胞凋亡程度进行分析，在p53基因型为正常型，并脱氧核糖核酸连接酶4基因型为突变型的rko、lovo人类大肠癌细胞株及p53基因为突变型且脱氧核糖核酸连接酶4基因为正常型的sw620人类大肠癌细胞株中，对作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a及属于竞争药物的作为聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂的奥拉帕尼进行处理后，通过台盼蓝色染色法测定细胞数，来确认了细胞凋亡程度。作为上述实验的条件和方法，通过在rpmi1640(10％的胎牛血清，1％的青霉素/链霉素)中培养p53基因型为正常型，并脱氧核糖核酸连接酶4基因型为突变型的rko、lovo人类大肠癌细胞株和p53基因为突变型且脱氧核糖核酸连接酶4基因为正常型的sw620人类大肠癌细胞株，来在37℃的温度下，在60mm板中，以每孔1×105个的方式培养24小时，并分别处理25μm及50μm的作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a及属于竞争药物的作为聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂的奥拉帕尼，培养48小时，然后通过台盼蓝色染色法测定细胞数，来确认了细胞凋亡程度。
实验结果
通过在p53及脱氧核糖核酸连接酶4的基因型不同的人类大肠癌细胞株中，对作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a及属于竞争药物的作为聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂的奥拉帕尼进行处理，来观察细胞凋亡程度，结果可观察出在p53基因型为正常，并脱氧核糖核酸连接酶4基因型具有突变型的rko、lovo细胞株中诱导基于作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a的细胞凋亡，在属于竞争药物的作为聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂的奥拉帕尼中无细胞凋亡效果，在p53基因型为突变型且脱氧核糖核酸连接酶4为正常型sw620中，可观察作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a及奥拉帕尼的细胞凋亡功效均低，从而示出对p53基因型未正常，并脱氧核糖核酸连接酶4基因型的突变型中对作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a具有选择性的结果(图2)。
实施例6：p53基因型正常型细胞的脱氧核糖核酸损伤分析
本发明人为了对在p53基因型为正常型的情况下，作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a的脱氧核糖核酸损伤程度进行分析，对p53基因型为正常型的hct116人类大肠癌细胞株处理作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a和属于竞争药物的作为聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂的奥拉帕尼后，利用免疫化学方法，以r-h2ax的表达程度确认了脱氧核糖核酸是否损伤。作为上述实验的条件和方法，通过在rpmi1640(10％的胎牛血清，1％的青霉素/链霉素)中培养p53基因型为正常型的hct116人类大肠癌细胞株，来在37℃的温度下，在60mm板中，以每孔1×105个的方式培养24小时，并分别处理50μm的作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a及属于竞争药物的作为聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂的奥拉帕尼，培养48小时，然后利用4％的多聚甲醛(paraformaldehyde)在常温条件下，固定15分钟，以10分钟3次的方式利用tbs-t缓冲液清洗后，利用0.5％的曲拉通(triton)x-100透化(permeabilization)10分钟，以10分钟3次的方式利用tbs-t缓冲液清洗后，在常温条件下利用5％的牛血清白蛋白(bsa)粘连1小时，在1％的牛血清白蛋白中，以1：100稀释r-h2ax抗体，来在4℃的温度下进行过夜后，以10分钟3次的方式利用tbs-t缓冲液清洗后，在1％的牛血清白蛋白中，以1：100稀释2次抗体(alexa
实验结果
在p53基因为正常型的人类大肠癌细胞株hct116中，对作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a及属于竞争药物的作为聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂的奥拉帕尼进行处理，来对脱氧核糖核酸是否损，通过免疫化学(imuunocytochemistry)方法观察r-h2ax的表达量，结果处理作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a的组与处理奥拉帕尼相比，r-h2ax的表达增加，从而示出诱导作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a的脱氧核糖核酸损伤(图3)。
实施例7：p53基因型正常型及脱氧核糖核酸连接酶4基因型突变型细胞的脱氧核糖核酸损伤分析
本发明人为了对在p53基因型为正常型且脱氧核糖核酸连接酶4基因型为突变型的情况下，作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a的脱氧核糖核酸损伤程度进行分析，对p53基因型为正常型且脱氧核糖核酸连接酶4基因型为突变型的rko人类大肠癌细胞株处理作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a和属于竞争药物的作为聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂的奥拉帕尼后，利用免疫化学方法，以r-h2ax的表达程度确认了脱氧核糖核酸是否损伤。作为上述实验的条件和方法，通过在rpmi1640(10％的胎牛血清，1％的青霉素/链霉素)中培养p53基因型为正常型且脱氧核糖核酸连接酶4基因型为突变型的rko人类大肠癌细胞株，来在37℃的温度下，在60mm板中，以每孔1×105个的方式培养24小时，并分别处理50μm的作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a及属于竞争药物的作为聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂的奥拉帕尼，培养48小时，然后利用4％的多聚甲醛在常温条件下，固定15分钟，以5分钟10次的方式利用tbs-t缓冲液清洗后，利用0.5％的曲拉通(triton)x-100透化10分钟，以10分钟3次的方式利用tbs-t缓冲液清洗后，在常温条件下利用5％的牛血清白蛋白粘连1小时，在1％的牛血清白蛋白中，以1：100稀释r-h2ax抗体，来在4℃的温度下进行过夜后，以10分钟3次的方式利用tbs-t缓冲液清洗后，在1％的牛血清白蛋白中，以1：100稀释2次抗体(alexa
实验结果
在p53基因为正常型且脱氧核糖核酸连接酶4基因型为突变型的人类大肠癌细胞株rko中，对作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a及属于竞争药物的作为聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂的奥拉帕尼进行处理，来对脱氧核糖核酸是否损，利用免疫化学(imuunocytochemistry)方法观察r-h2ax的表达量，结果仅在处理作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a的组中r-h2ax的表达增加，从而示出诱导作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a的脱氧核糖核酸损伤(图4)。
实施例8：p53基因型正常型及脱氧核糖核酸连接酶4基因型突变型细胞的脱氧核糖核酸损伤及细胞凋亡分析
本发明人为了对在p53基因型为正常型及脱氧核糖核酸连接酶4基因型为突变型的情况下，作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a的脱氧核糖核酸损伤程度及细胞凋亡程度进行分析，对p53基因和脱氧核糖核酸连接酶4为正常型的hct116人类大肠癌细胞株和p53基因型为正常型且脱氧核糖核酸连接酶4基因型为突变型的rko人类大肠癌细胞株处理作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a和属于竞争药物的作为聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂的奥拉帕尼后，通过免疫印迹法，以r-h2ax的表达程度确认了脱氧核糖核酸是否损伤，并以切割型半胱天冬酶3(cleavedcaspase3)的表达程度确认了细胞凋亡程度。作为上述实验的条件和方法，通过在rpmi1640(10％的胎牛血清，1％的青霉素/链霉素)中培养p53基因和脱氧核糖核酸连接酶4为正常型的hct116人类大肠癌细胞株和p53基因型为正常型脱氧核糖核酸连接酶4基因型为突变型的rko人类大肠癌细胞株，来在37℃的温度下，在60mm板中，以每孔1×105个的方式培养24小时，并分别处理50μm的作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a及属于竞争药物的作为聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂的奥拉帕尼，然后利用离心分离机获得培养48小时后的细胞，相对于获得的各个细胞利用ripa缓冲液溶解细胞后，利用高速离心分离机提取蛋白质，来利用免疫印迹法每细胞电泳30μmg的蛋白质，从而分离蛋白质后，转移到聚偏氟乙烯(pdvf)膜，来在5％的脱脂牛奶中分别以1:2000的比率稀释r-h2ax、切割型半胱天冬酶3、b-肌动蛋白抗体，从而在4℃的温度下反应12小时后，以15分钟3次的方式利用tbs-t缓冲液清洗2次后，在5％的脱脂牛奶中分别以1:2000的比率稀释第二次抗体，来在常温条件下，反应2小时，以15分钟3次的方式利用tbs-t缓冲液清洗，从而利用增强化学发光(ecl,enhancedchemiluminescence)缓冲液诱导聚偏氟乙烯膜的发光，由此利用x-ray膜对与各个抗体相关的蛋白质的表达进行了显像。
实验结果
在p53基因型为正常型的人类大肠癌细胞株hct116及p53基因型为正常型且脱氧核糖核酸连接酶4基因型为突变型的人类大肠癌细胞株rko中，对作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a和属于竞争药物的作为聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂的奥拉帕尼进行处理，来相对于脱氧核糖核酸的损伤程度和细胞凋亡程度，利用免疫印迹法观察r-h2ax和切割型半胱天冬酶3的表达量，结果处理作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a的组与处理奥拉帕尼的组相比，r-h2ax的表达增加，并且切割型半胱天冬酶3的表达量也增加，从而示出诱导作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a的脱氧核糖核酸损伤和细胞凋亡(图5)。
实施例9：在p53基因型为正常型的细胞株中，在脱氧核糖核酸连接酶4基因型为突变型细胞的情况下，细胞凋亡分析
本发明人为了对在p53基因型为正常型且脱氧核糖核酸连接酶4基因型为突变型的情况下，作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a的细胞凋亡程度进行分析，在p53基因为正常型且脱氧核糖核酸连接酶4基因型为正常型的hct8人类大肠癌细胞株中过表达脱氧核糖核酸连接酶4突变型，来处理作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a和属于竞争药物的作为聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂的奥拉帕尼后，通过台盼蓝染色法，测定细胞数来确认了细胞凋亡程度。作为上述实验的条件和方法，通过在rpmi1640(10％的胎牛血清，1％的青霉素/链霉素)中培养p53基因为正常型并脱氧核糖核酸连接酶4为正常型的hct8人类大肠癌细胞株，来在37℃的温度下，在60mm板中，以每孔1×105个的方式培养24小时，并利用脂质体2000(英杰公司)使脱氧核糖核酸连接酶4基因型为突变型的g833a或t1704c质粒脱氧核糖核酸向细胞内流入，来在37℃的温度下过表达48小时后，分别处理25um、50um的作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a及属于竞争药物的作为聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂的奥拉帕尼，并培养48小时后，通过台盼蓝染色法测定细胞数，来确认了细胞凋亡程度。
实验结果
通过使脱氧核糖核酸连接酶4基因型为突变型的g833a或t1704c在p53基因型及脱氧核糖核酸连接酶4基因型为正常型的人类大肠癌细胞株hct8中过表达，来处理作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a，从而利用台盼蓝拒蓝法(trypanblueexclusionassay)观察细胞凋亡程度，结果与不插入脱氧核糖核酸连接酶4突变基因的对照组(empty)相比，示出在使脱氧核糖核酸连接酶4突变g833a或t1704c过表达的情况下，基于作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a的细胞凋亡增加(图6)。
实施例10：在p53基因型为突变型的细胞株中，在脱氧核糖核酸连接酶4基因型为突变型细胞的情况下细胞凋亡分析
本发明人为了分析在p53基因型为突变型且脱氧核糖核酸连接酶4基因型为突变型的情况下，作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a的细胞凋亡程度，在p53基因为突变型且脱氧核糖核酸连接酶4基因型为正常型的sw620人类大肠癌细胞株中过表达脱氧核糖核酸连接酶4突变型，来处理作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a及属于竞争药物的作为聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂的奥拉帕尼后，通过台盼蓝染色法，测定细胞数来确认了细胞凋亡程度。作为上述实验的条件和方法，通过在rpmi1640(10％的胎牛血清，1％的青霉素/链霉素)中培养p53基因为突变型并脱氧核糖核酸连接酶4基因为正常型的sw620人类大肠癌细胞株，来在37℃的温度下，在60mm板中，以每孔1×105个的方式培养24小时，并利用脂质体2000(英杰公司)使脱氧核糖核酸连接酶4基因型为突变型的g833a或t1704c质粒脱氧核糖核酸向细胞内流入，来在37℃的温度下过表达48小时后，分别处理25um及50um的作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a及属于竞争药物的作为聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂的奥拉帕尼，并培养48小时后，通过台盼蓝染色法测定细胞数，来确认了细胞凋亡程度。
实验结果
通过在p53基因型为突变型且脱氧核糖核酸连接酶4基因型为正常型的人类大肠癌细胞株sw620中过表达脱氧核糖核酸连接酶4基因型为突变型的g833a或t1704c，来处理作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a，从而利用台盼蓝拒蓝法观察细胞凋亡程度，结果与不插入脱氧核糖核酸连接酶4突变基因的对照组(empty)相比，在过表达脱氧核糖核酸连接酶4突变g833a或t1704c的情况下，基于作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a的细胞凋亡无变化，如图5所示，示出仅在p53基因型为正常型的情况下，诱导与脱氧核糖核酸连接酶4突变相关的基于作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a的细胞凋亡(图7)。
实施例11：在p53基因型为正常型的细胞株中，在脱氧核糖核酸连接酶4基因型为突变型细胞的情况下脱氧核糖核酸损伤及细胞凋亡分析
本发明人为了对在p53基因型为突变型且脱氧核糖核酸连接酶4基因型为突变型的情况下，作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a的细胞凋亡程度和脱氧核糖核酸损伤程度进行分析，与实施例9相同地进行了实验。利用台盼蓝染色法，测定细胞数来确认了细胞凋亡程度，并利用离心分离机获得细胞，相对于获得的各个细胞利用ripa缓冲液溶解细胞后，利用高速离心分离机提取蛋白质，来利用免疫印迹法每细胞电泳30μg的蛋白质，从而分离蛋白质后，转移到聚偏氟乙烯膜，来在5％的脱脂牛奶中分别以1:2000的比率稀释r-h2ax、切割型半胱天冬酶3、b-肌动蛋白抗体，从而在4℃的温度下反应12小时后，以15分钟3次的方式利用tbs-t缓冲液清洗2次后，在5％的脱脂牛奶中分别以1:2000的比率稀释第二次抗体，来在常温条件下，反应2小时，以15分钟3次的方式利用tbs-t缓冲液清洗，从而利用增强化学发光缓冲液诱导聚偏氟乙烯膜的发光，由此利用x-ray膜对与各个抗体相关的蛋白质的表达进行了显像。
实验结果
通过使脱氧核糖核酸连接酶4基因型为突变型的g833a或t1704c在p53基因型及脱氧核糖核酸连接酶4基因型为正常型的人类大肠癌细胞株hct8中过表达，来处理作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a及属于竞争药物的作为聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂的奥拉帕尼，从而利用台盼蓝拒蓝法观察细胞凋亡程度，并相对于脱氧核糖核酸的损伤程度和细胞凋亡程度利用免疫印迹法观察r-h2ax和切割型半胱天冬酶3的表达量，结果处理作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a的组与作为竞争药物的奥拉帕尼相比，与不插入脱氧核糖核酸连接酶4突变基因的对照组(empty)相比，在过表达脱氧核糖核酸连接酶4突变g833a或t1704c的情况下，观察到基于作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a的细胞凋亡增加(图8的(a)部分)，r-h2ax的表达和切割型半胱天冬酶3的表达量也增加，从而示出仅在p53基因型为正常型且脱氧核糖核酸连接酶4基因型为突变的情况下，诱导化合物a的脱氧核糖核酸损伤和细胞凋亡(图8的(b)部分)。
实施例12：在p53基因型为正常型且脱氧核糖核酸连接酶4基因型为突变型的细胞株中，基于p53突变型及脱氧核糖核酸连接酶4正常型表达的细胞凋亡分析
本发明人为了对在p53基因型为正常型且脱氧核糖核酸连接酶4基因型为突变型的情况下，基于突变型p53及正常型脱氧核糖核酸连接酶4的表达的作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a的细胞凋亡程度进行分析，与实施例7相同地培养p53基因为正常型且脱氧核糖核酸连接酶4基因型为突变型的rko人类大肠癌细胞株，并通过使p53突变型质粒脱氧核糖核酸和脱氧核糖核酸连接酶4基因型为正常型的质粒脱氧核糖核酸向细胞内流入，来在37℃的温度下过表达48小时后，分别处理25um、50um的作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a及属于竞争药物的作为聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂的奥拉帕尼，并培养48小时后，通过台盼蓝染色法测定细胞数，来确认了细胞凋亡程度。
实验结果
通过在p53基因型为正常型且脱氧核糖核酸连接酶4基因型为突变型的人类大肠癌细胞株rko中过表达p53基因型，来处理作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a及属于竞争药物的作为聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂的奥拉帕尼，从而利用台盼蓝拒蓝法观察细胞凋亡程度，结果与不插入p53突变型基因的对照组(empty)相比，在过表达p53突变型基因的情况下，观察到基于作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a的细胞凋亡减少(图9的(a)部分)。通过在p53基因型为正常型且脱氧核糖核酸连接酶4基因型为突变型的人类大肠癌细胞株rko中过表达脱氧核糖核酸连接酶4正常型基因，来处理作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a及属于竞争药物的作为聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂的奥拉帕尼，从而利用台盼蓝拒蓝法观察细胞凋亡程度，结果与不插入脱氧核糖核酸连接酶4突变基因的对照组(empty)相比，在过表达脱氧核糖核酸连接酶4正常型基因的情况下，观察到基于作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a的细胞凋亡减少(图9的(b)部分)，从而示出在p53为正常型且脱氧核糖核酸连接酶4为突变型的情况下，在化合物a中细胞凋亡最高(图9)。
实施例13：作为基于p53及脱氧核糖核酸连接酶4基因型的聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物b的ic50分析
本发明人为了对在p53及脱氧核糖核酸连接酶4基因型互不相同的rko(p53wt/脱氧核糖核酸连接酶4mt)、hct8(p53wt、脱氧核糖核酸连接酶4wt)、sw620(p53mt、脱氧核糖核酸连接酶4wt)、km12c(p53mt、脱氧核糖核酸连接酶4mt)4种人类大肠癌细胞株中，作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a及化合物b的抗癌活性进行分析，通过体外细胞碱基分析(invitrocellbaseassay)，测定了与作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a和化合物b相关的细胞株的生存能力(cellviability)和ic50。作为上述实验的条件和方法通过在rpmi1640(10％的胎牛血清(fbs)，1％的青霉素/链霉素)中培养总4种人类大肠癌细胞株，来在37℃的温度下，在96孔板中，以每孔2×103个的方式将各个细胞株培养24小时，并相对于作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a在最大100μm条件下，以最少0.390625μm稀释两倍(100μm、50μm、25μm、12.5μm、6.25μm、3.125μm、1.5625μm、0.78125μm及0.390625μm)，来处理后，在37℃的温度下，培养72小时来相对于药物处理组和非处理组，利用mts分析(普洛麦格公司，celltiter96aqeousonesolution)测定各个细胞株的生存能力，并利用prism程序测定了各个细胞株的ic50。
实验结果
在4种人类大肠癌细胞株中分别对作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a进行处理，来利用mts分析分析ic50，结果在4种的细胞株中，在p53为正常型且脱氧核糖核酸连接酶4为突变型的rko中，在化合物a和化合物b中呈现最低的ic50值，从而示出作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a和化合物b在p53为正常型且脱氧核糖核酸连接酶4为突变型的情况下，抗癌功效最优秀(表4)。
表4
实施例14：基于p53及脱氧核糖核酸连接酶4基因型的化合物a和化合物b的功效分析
本发明人为了对作为基于p53及脱氧核糖核酸连接酶4基因型的新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a的细胞凋亡程度进行分析，在p53基因为正常型，并脱氧核糖核酸连接酶4基因为突变型的rko和lovo人类大肠癌细胞株中，对作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a和化合物b进行处理后，通过台盼蓝色染色法测定细胞数，来比较确认细胞凋亡程度。与实施例5相同的条件培养上述rko及lovo人类大肠癌细胞株，并分别处理25μm及50μm的作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a和化合物b，来培养48小时后，通过台盼蓝色染色法测定细胞数，从而确认了细胞凋亡程度。
实验结果
在p53基因为正常型，并脱氧核糖核酸连接酶4基因为突变型的人类大肠癌细胞株rko及lovo中，分别对作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a及化合物b进行处理，来观察细胞凋亡程度，结果在p53基因型为正常，并脱氧核糖核酸连接酶4基因型具有突变型的rko及lovo细胞株中，可观察与作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a相比，基于化合物b的细胞凋亡功效高，在p53基因型为正常，并脱氧核糖核酸连接酶4基因型为突变型中，作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物b与化合物a相比示出选择性的结果(图10)。
实施例15：在p53基因型和脱氧核糖核酸连接酶4基因型互不相同的细胞株中的与化合物a及化合物b相关的细胞凋亡分析
本发明人为了对在p53基因型为正常型，脱氧核糖核酸连接酶4基因型为突变的细胞株rko，p53基因型为突变型，脱氧核糖核酸连接酶4基因型为正常型的细胞株sw620，p53基因型和脱氧核糖核酸连接酶4基因型为正常的细胞株hct8以及p53基因型和脱氧核糖核酸连接酶4基因型为突变的细胞株km12c中，作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a及化合物b的细胞凋亡程度进行分析，通过在rpmi1640(10％的胎牛血清，1％的青霉素/链霉素)中培养p53基因型和脱氧核糖核酸连接酶4基因型互不相同的rko、hct、sw620及km12c的人类大肠癌细胞株，来在37℃的温度下，在60mm板中，以每孔1×105个的方式培养24小时，并分别处理25μm及50μm的作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a、化合物b及属于竞争药物的作为聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂的奥拉帕尼和作为端锚聚合酶的nvp-tnks656，从而利用台盼蓝色染色法分析细胞凋亡程度。
实验结果
在p53基因型和脱氧核糖核酸连接酶4基因型互不相同的人类大肠癌细胞株rko、sw620、hct8及km12c中，对作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a、化合物b及属于竞争药物的作为聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂的奥拉帕尼和作为tankyrase抑制剂的nvp-tnks656，来利用台盼蓝拒蓝法分析细胞凋亡程度，结果在p53基因型为正常型，并脱氧核糖核酸连接酶4基因型为突变型的细胞株rko中可观察作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a和化合物b的细胞凋亡，并基于属于竞争药物的作为聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂和作为tankyrase抑制剂的nvp-tnks656的细胞凋亡均无变化(图11的(a)部分)。在p53为突变型且脱氧核糖核酸连接酶4为正常型的细胞株sw620、p53；脱氧核糖核酸连接酶4基因型为正常型的细胞株hct8、p53；脱氧核糖核酸连接酶4基因型为突变型的细胞株km12c的情况下，未发生基于化合物a、化合物b、作为聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂的奥拉帕尼、作为tankyrase抑制剂的nvp-tnks656的细胞凋亡，从而仅在p53为正常型且脱氧核糖核酸连接酶4为突变型的情况下，示出基于化合物a及化合物b的细胞凋亡(图11的(a)部分至图11的(d)部分)。
实施例16：在p53基因型为正常型且脱氧核糖核酸连接酶4基因型为突变型的细胞株rko中基于p53突变型、脱氧核糖核酸连接酶4正常型的过表达的与化合物b相关的细胞凋亡分析
如实施例12，本发明人为了对在p53基因型为正常型且脱氧核糖核酸连接酶4基因型为突变型的情况下，基于突变型p53及正常型脱氧核糖核酸连接酶4的表达的作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物b的细胞凋亡程度进行分析，在p53基因为正常型且脱氧核糖核酸连接酶4基因型为突变型的rko中分别过表达p53突变型及脱氧核糖核酸连接酶4正常型，来处理作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物b及属于竞争药物的作为聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂的奥拉帕尼，然后通过台盼蓝色染色法测定细胞数来确认了细胞凋亡程度。作为上述实验的条件和方法，与实施例12相同地条件培养p53基因为正常型且脱氧核糖核酸连接酶4基因型为突变型的rko人类大肠癌细胞株，并通过使p53突变型质粒脱氧核糖核酸和脱氧核糖核酸连接酶4基因型为正常型的质粒脱氧核糖核酸向细胞内流入，来在37℃的温度下过表达48小时后，分别处理25um、50um的作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a及属于竞争药物的作为聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂的奥拉帕尼，并培养48小时后，通过台盼蓝色染色法测定细胞数，来确认了细胞凋亡程度。
实验结果
通过在p53基因型为正常型且脱氧核糖核酸连接酶4基因型为突变型的人类大肠癌细胞株rko中过表达p53突变型基因，来处理作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物b及属于竞争药物的作为聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂的奥拉帕尼，从而利用台盼蓝拒蓝法观察细胞凋亡程度，结果与不插入p53突变型基因的对照组(empty)相比，在过表达p53突变型基因的情况下，观察到基于作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a的细胞凋亡减少(图12的(a)部分)。通过在p53基因型为正常型且脱氧核糖核酸连接酶4基因型为突变型的人类大肠癌细胞株rko中过表达脱氧核糖核酸连接酶4正常型基因，来处理作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物b及属于竞争药物的作为聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂的奥拉帕尼，从而利用台盼蓝拒蓝法观察细胞凋亡程度，结果与不插入脱氧核糖核酸连接酶4突变基因的对照组(empty)相比，在过表达脱氧核糖核酸连接酶4正常型基因的情况下，观察到基于作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物b的细胞凋亡减少，从而示出在p53为正常型且脱氧核糖核酸连接酶4为突变型的情况下，在化合物b中细胞凋亡最高(图12的(a)部分及图12的(b)部分)。
实施例17：在p53基因型为正常型且脱氧核糖核酸连接酶4基因型为突变型的细胞株lovo中基于p53突变型及脱氧核糖核酸连接酶4正常型的过表达的与化合物b相关的细胞凋亡分析
如实施例12，本发明人为了对在p53基因型为正常型且脱氧核糖核酸连接酶4基因型为突变型的情况下，基于突变型p53及正常型脱氧核糖核酸连接酶4的表达的作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物b的细胞凋亡程度进行分析，在p53基因为正常型且脱氧核糖核酸连接酶4基因型为突变型的lovo中分别过表达p53突变型及脱氧核糖核酸连接酶4正常型，来处理作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物b及属于竞争药物的作为聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂的奥拉帕尼，然后通过台盼蓝色染色法测定细胞数来确认了细胞凋亡程度。作为上述实验的条件和方法，与实施例12的rko细胞培养及转染方法相同。分别处理25um、50um的作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物b及属于竞争药物的作为聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂的奥拉帕尼，并培养48小时后，通过台盼蓝色染色法测定细胞数，来确认了细胞凋亡程度。
实验结果
通过在p53基因型为正常型且脱氧核糖核酸连接酶4基因型为突变型的人类大肠癌细胞株lovo中过表达p53突变型基因，来处理作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物b及属于竞争药物的作为聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂的奥拉帕尼，从而利用台盼蓝拒蓝法观察细胞凋亡程度，结果与不插入p53突变型基因的对照组(empty)相比，在过表达p53突变型基因的情况下，观察到基于作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物b的细胞凋亡减少(图13a)。通过在p53基因型为正常型且脱氧核糖核酸连接酶4基因型为突变型的人类大肠癌细胞株lovo中过表达脱氧核糖核酸连接酶4正常型基因，来处理作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物b及属于竞争药物的作为聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂的奥拉帕尼，从而利用台盼蓝拒蓝法观察细胞凋亡程度，结果与不插入脱氧核糖核酸连接酶4突变基因的对照组(empty)相比，在过表达脱氧核糖核酸连接酶4正常型基因的情况下，观察到基于作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物b的细胞凋亡减少(图13的(b)部分)，从而示出在p53为正常型且脱氧核糖核酸连接酶4为突变型的情况下，在化合物b中细胞凋亡最高(图13的(a)部分及图13的(b)部分)。
实施例18：在p53基因型为正常型且脱氧核糖核酸连接酶4基因型为突变型的细胞株lovo中基于p53突变型及脱氧核糖核酸连接酶4正常型的过表达的与化合物b相关的脱氧核糖核酸损伤及细胞凋亡分析
本发明人为了对在p53基因型为正常型且脱氧核糖核酸连接酶4基因型为突变型的情况下，基于突变型p53及正常型脱氧核糖核酸连接酶4的表达的作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物b的细胞凋亡程度进行分析，通过与实施例17相同的条件培养及处理p53基因为正常型且脱氧核糖核酸连接酶4基因型为突变型的人类大肠癌细胞株，来利用免疫印迹法以r-h2ax的表达程度确认脱氧核糖核酸是否损伤，并以与实施例11相同的反发确认了切割型半胱天冬酶3(cleavedcaspase3)的表达程度。
实验结果
在p53基因型为正常型且脱氧核糖核酸连接酶4基因型为突变型的人类大肠癌细胞株lovo中，过表达p53突变型基因，来对作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物b及属于竞争药物的作为聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂的奥拉帕尼进行处理，从而相对于脱氧核糖核酸的损伤程度和细胞凋亡程度，利用免疫印迹法观察r-h2ax和切割型半胱天冬酶3的表达量，结果与不插入p53突变型基因的对照组(empty)相比，在过表达p53突变型基因的情况下，观察到基于作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物b的r-h2ax表达和切割型半胱天冬酶3的表达量减少(图14的(a)部分)，通过在p53基因型为正常型且脱氧核糖核酸连接酶4基因型为突变型的人类大肠癌细胞株lovo中过表达脱氧核糖核酸连接酶4正常型基因，来处理相对于作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物b及属于竞争药物的作为聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂的奥拉帕尼的脱氧核糖核酸的损伤程度和细胞凋亡程度，利用免疫印迹法观察r-h2ax和切割型半胱天冬酶3的表达量，结果与不插入脱氧核糖核酸连接酶4突变基因的对照组(empty)相比，在过表达脱氧核糖核酸连接酶4正常型基因的情况下，观察到基于作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物b的r-h2ax表达和切割型半胱天冬酶3的表达量减少(图14的(b)部分)，从而示出仅在p53为正常型且脱氧核糖核酸连接酶4为突变型的情况下，诱导作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物b的脱氧核糖核酸损伤和细胞凋亡(图14)。
实施例19：在利用p53基因型为正常型且脱氧核糖核酸连接酶4基因型为突变型的细胞株rko的异种移植动物模型中的与化合物a和奥拉帕尼相关的肿瘤抑制功效分析
本发明人为了对在p53基因型为正常型且脱氧核糖核酸连接酶4基因型为突变型的情况下，与作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a和奥拉帕尼相关的在体内动物模型中的肿瘤抑制功效进行分析，通过将向6周龄的雌性裸鼠(balb/c-nude、从中心实验动物购买)移植p53基因型为正常型且脱氧核糖核酸连接酶4基因型为突变型的rko人类大肠癌细胞株，来给药作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a和属于竞争药物的作为聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂的奥拉帕尼后，测定肿瘤的大小来确认了肿瘤抑制功效程度。作为上述实验的条件和方法，通过在rpmi1640(10％的胎牛血清、1％的青霉素/链霉素)中培养p53基因为正常型且脱氧核糖核酸连接酶4基因为突变型的rko类大肠癌细胞株，来对裸鼠每次移植1×107个后，当肿瘤的大小为mm3时，以分别25mpk及50mpk的方式将作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a和属于竞争药物的作为聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂的奥拉帕尼每日口服给药共27天，并每3天测定肿瘤的大小，在药物给药结束后摘除肿瘤来测定了重量。
实验结果
在p53基因型为正常型且脱氧核糖核酸连接酶4基因型为突变型人类大肠癌细胞株rko中，通过给药作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a和属于竞争药物的作为聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂的奥拉帕尼，来观察肿瘤抑制功效程度，结果作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a的肿瘤抑制功效与属于竞争药物的作为聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂的奥拉帕尼给药组相比，肿瘤的大小减少，并且肿瘤的重量也减少，从而示出在p53为正常型且脱氧核糖核酸连接酶4为突变型的情况下，产生与化合物a相关的肿瘤抑制功效(图15的(a)部分及图15的(b)部分)。
实施例20：在利用p53基因型为正常型且脱氧核糖核酸连接酶4基因型为正常型的细胞株sw620的异种移植动物模型中的与化合物a和奥拉帕尼相关的肿瘤抑制功效分析
本发明人为了对在p53基因型为突变型且脱氧核糖核酸连接酶4基因型为正常型的情况下，作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a的在体内动物模型中的肿瘤抑制功效进行分析，通过向6周龄的雌性裸鼠(balb/c-nude、从中心实验动物购买)移植p53基因型为突变型且脱氧核糖核酸连接酶4基因型为正常型的sw620人类大肠癌细胞株，来给药作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a及属于竞争药物的作为聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂的奥拉帕尼后，测定肿瘤的大小来确认了肿瘤抑制功效程度。作为上述实验的条件和方法，通过在rpmi1640(10％的胎牛血清、1％的青霉素/链霉素)中培养p53基因为突变型且脱氧核糖核酸连接酶4基因为突变型的sw620人类大肠癌细胞株，来对裸鼠每次移植1×107个后，当肿瘤的大小为100mm3时，以分别25mpk及50mpk的方式将作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a和属于竞争药物的作为聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂的奥拉帕尼每日口服给药共27天，并每3天测定肿瘤的大小，在药物给药结束后摘除肿瘤来测定了重量。
实验结果
在p53基因型为正常型且脱氧核糖核酸连接酶4基因型为突变型人类大肠癌细胞株sw620中，通过给药作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a及属于竞争药物的作为聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂的奥拉帕尼，来观察肿瘤抑制功效程度，结果观察到基于作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a及属于竞争药物的作为聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂的奥拉帕尼的肿瘤大小和重量均无变化，从而示出在p53为突变型且脱氧核糖核酸连接酶4为正常型的情况下，不产生与化合物a和奥拉帕尼相关的肿瘤抑制功效(图16的(a)部分及图16的(b)部分)。
实施例21：在利用p53基因型和脱氧核糖核酸连接酶4基因型为突变型的细胞株km12c的异种移植动物模型中的与化合物a相关的肿瘤抑制功效分析
本发明人为了对在p53基因型和脱氧核糖核酸连接酶4基因型为突变型的情况下，与作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a相关的在体内动物模型中的肿瘤抑制功效进行分析，通过将向6周龄的雌性裸鼠(balb/c-nude、从中心实验动物购买)移植p53基因型和脱氧核糖核酸连接酶4基因型为突变型的km12c人类大肠癌细胞株，来给药作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a及属于竞争药物的作为聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂的奥拉帕尼后，测定肿瘤的大小来确认了肿瘤抑制功效程度。作为上述实验的条件和方法，通过在rpmi1640(10％的胎牛血清、1％的青霉素/链霉素)中培养p53基因和脱氧核糖核酸连接酶4基因为突变型的km12c人类大肠癌细胞株，来对裸鼠每次移植1×107个后，当肿瘤的大小为mm3时，以分别25mpk及50mpk的方式将作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a及属于竞争药物的作为聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂的奥拉帕尼每日口服给药共18天，并每3天测定肿瘤的大小，在药物给药结束后摘除肿瘤来测定了重量。
实验结果
在p53基因型和脱氧核糖核酸连接酶4基因型为突变型的人类大肠癌细胞株km12c中，通过给药作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a及属于竞争药物的作为聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂的奥拉帕尼，来观察肿瘤抑制功效程度，结果观察到基于作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a及属于竞争药物的作为聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂的奥拉帕尼的肿瘤大小和重量均无变化，从而示出在p53和脱氧核糖核酸连接酶4均为突变型的情况下，不产生与化合物a和奥拉帕尼相关的肿瘤抑制功效(图17的(a)部分及图17的(b)部分)。
实施例22：在利用p53基因型为正常型且脱氧核糖核酸连接酶4基因型为突变型的细胞株rko的异种移植动物模型中的与化合物b及奥拉帕尼相关的肿瘤抑制功效分析
本发明人为了对在p53基因型为正常型且脱氧核糖核酸连接酶4基因型为正常型的情况下，与作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物b和奥拉帕尼相关的的在体内动物模型中的肿瘤抑制功效进行分析，通过向6周龄的雌性裸鼠(balb/c-nude、从中心实验动物购买)移植p53基因型为突变型且脱氧核糖核酸连接酶4基因型为正常型的rko人类大肠癌细胞株，来给药作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物b和属于竞争药物的作为聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂的奥拉帕尼后，测定肿瘤的大小来确认了肿瘤抑制功效程度。作为上述实验的条件和方法，通过在rpmi1640(10％的胎牛血清、1％的青霉素/链霉素)中培养p53基因为突变型且脱氧核糖核酸连接酶4基因为突变型的rko人类大肠癌细胞株，来对裸鼠每次移植1×107个后，当肿瘤的大小为100mm3时，以分别25mpk及50mpk的方式将作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物a和属于竞争药物的作为聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂的奥拉帕尼每日口服给药共27天，并每3天测定肿瘤的大小，在药物给药结束后摘除肿瘤来测定了重量。
实验结果
在p53基因型为正常型且脱氧核糖核酸连接酶4基因型为突变型的人类大肠癌细胞株rko中，通过给药作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物b及属于竞争药物的作为聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂的奥拉帕尼，来观察肿瘤抑制功效程度，结果观察到作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物b的肿瘤抑制功效与属于竞争药物的作为聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂的奥拉帕尼的给药组相比，肿瘤大小减少，并且重量也减少，从而示出在p53为正常型且脱氧核糖核酸连接酶4为突变型的情况下，产生与化合物b相关的肿瘤抑制功效(图18的(a)部分及图18的(b)部分)。
实施例23：在利用p53基因型和脱氧核糖核酸连接酶4基因型为突变型的细胞株km12c的异种移植动物模型中的与化合物b相关的肿瘤抑制功效分析
本发明人为了对在p53基因型和脱氧核糖核酸连接酶4基因型为突变型的情况下，与作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物b相关的的在体内动物模型中的肿瘤抑制功效进行分析，通过向6周龄的雌性裸鼠(balb/c-nude、从中心实验动物购买)移植p53基因型和脱氧核糖核酸连接酶4基因型为突变型的km12c人类大肠癌细胞株，来给药作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物b后，测定肿瘤的大小来确认了肿瘤抑制功效程度。作为上述实验的条件和方法，通过在rpmi1640(10％的胎牛血清、1％的青霉素/链霉素)中培养p53基因和脱氧核糖核酸连接酶4基因为突变型的km12c人类大肠癌细胞株，来对裸鼠每次移植1×107个后，当肿瘤的大小为100mm3时，以分别25mpk及50mpk的方式将作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物b每日口服给药共15天，并每3天测定肿瘤的大小，在药物给药结束后摘除肿瘤来测定了重量。
实验结果
在p53基因型和脱氧核糖核酸连接酶4基因型为突变型人类大肠癌细胞株km12c中，通过给药作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物b，来观察肿瘤抑制功效程度，结果观察到基于作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物b的肿瘤大小及重量均无变化，从而示出在p53和脱氧核糖核酸连接酶4均为突变型的情况下，不产生与化合物b相关的肿瘤抑制功效(图19的(a)部分及图19的(b)部分)。
实施例24：在来源于大肠癌患者细胞中的脱氧核糖核酸连接酶4基因型分析
本发明人为了对在来源于大肠癌患者细胞中的脱氧核糖核酸连接酶4基因型进行确认，通过逆转录聚合酶链式反应和测序分析了在36种来源于大肠癌患者细胞株中脱氧核糖核酸连接酶4的基因型是否变异/缺乏。作为上述实验的条件和方法，相对于总36个来源于大肠癌患者细胞株通过trizol核糖核酸提取法，利用均质器(homogenizer)提取总核糖核酸，来将500ng的总核糖核酸重新合称为互补脱氧核糖核酸，从而利用脱氧核糖核酸连接酶4引物(序列表中序列12；脱氧核糖核酸连接酶4引物exon1-1正向引物5’-ttgctttactagttaaacgagaagattca-3’、序列表中序列13；脱氧核糖核酸连接酶4引物exon1-1逆向引物5’-ttcgttctaaagttgaacacaaatctg-3’、序列表中序列8；脱氧核糖核酸连接酶4引物exon2-1正向引物5’-gctagctgctattgcagatattgagc-3’、序列表中序列9；脱氧核糖核酸连接酶4引物exon2-1逆向引物5’-agaaccttcagtaggagaagcaccaa-3’、序列表中序列10；脱氧核糖核酸连接酶4引物exon2-2正向引物5’-cctggtgagaagccatctgt-3’、序列表中序列11；脱氧核糖核酸连接酶4引物exon2-2逆向引物5’-gccttccccctaagttgttc-3’)进行聚合酶链式反应，在1％的琼脂糖凝胶中进行电泳，然后通过et-b染色，来利用桑格测序法(sangersequencing)确认了脱氧核糖核酸连接酶4的表达得到确认的聚合酶链式反应生产物。
实验结果
在36个来源于大肠癌患者的细胞株中，对脱氧核糖核酸连接酶4的c8、c27、g833及t1704部位的突变进行分析，结果在14个来源于大肠癌患者细胞株中分析了脱氧核糖核酸连接酶4的突变(表5)。
表5
实施例25：在大肠癌患者组织中的脱氧核糖核酸连接酶4基因型分析
本发明人为了对在大肠癌患者组织中的脱氧核糖核酸连接酶4基因型去人，通过逆转录聚合酶链式反应和测序分析了在39个来源于大肠癌患者组织中脱氧核糖核酸连接酶4的基因型是否变异/缺乏。作为上述实验的条件和方法，相对于总39个来源于大肠癌患者组织通过trizol核糖核酸提取法，利用均质器提取总核糖核酸，来将500ng的总核糖核酸重新合称为互补脱氧核糖核酸，从而利用脱氧核糖核酸连接酶4引物(序列表中序列12；脱氧核糖核酸连接酶4引物exon1-1正向引物5’-ttgctttactagttaaacgagaagattca-3’、序列表中序列13；脱氧核糖核酸连接酶4引物exon1-1逆向引物5’-ttcgttctaaagttgaacacaaatctg-3’、序列表中序列8；脱氧核糖核酸连接酶4引物exon2-1正向引物5’-gctagctgctattgcagatattgagc-3’、序列表中序列9；脱氧核糖核酸连接酶4引物exon2-1逆向引物5’-agaaccttcagtaggagaagcaccaa-3’、序列表中序列10；脱氧核糖核酸连接酶4引物exon2-2正向引物5’-cctggtgagaagccatctgt-3’、序列表中序列11；脱氧核糖核酸连接酶4引物exon2-2逆向引物5’-gccttccccctaagttgttc-3’)进行聚合酶链式反应，在1％的琼脂糖凝胶中进行电泳，然后通过et-br染色，来利用桑格测序法确认了脱氧核糖核酸连接酶4的表达得到确认的聚合酶链式反应生产物。
实验结果
在39个来源于大肠癌患者的细胞株中，对脱氧核糖核酸连接酶4的c8、c27、g833及t1704部位的突变进行分析，结果在9个来源于大肠癌患者组织中分析了脱氧核糖核酸连接酶4的突变(表6)。
表6
实施例26：在p53基因型为正常型且脱氧核糖核酸连接酶4基因型为正常型或突变型的来源于大肠癌患者细胞中的药物功效分析
本发明人为了对在p53基因型为正常型且脱氧核糖核酸连接酶4基因型为正常型或突变型的来源于大肠癌患者细胞11-ct-79558d(p53野生型/脱氧核糖核酸连接酶4突变型)、11-ct-80464b(p53野生型/脱氧核糖核酸连接酶4突变型)、11ct-94575(p53野生型/脱氧核糖核酸连接酶4野生型)及13ct-78649b(p53野生型/脱氧核糖核酸连接酶4野生型)中，作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物b的药物功效程度进行分析，通过在rebm(renalgrowthbasalmedium；5％胎牛血清、1％的青霉素/链霉素)中培养p53基因型为正常型且脱氧核糖核酸连接酶4基因型互不相同的4种人类来源于大肠癌患者细胞，来在37℃的温度下，在60mm板中，以每孔1×105个的方式培养24小时，并分别处理25μm及50μm的作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物b及属于竞争药物的作为聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂的奥拉帕尼，培养48小时，然后通过分析细胞形状的变化来确认了药物功效。
实验结果
相对于p53基因型为正常型且脱氧核糖核酸连接酶4基因型互不相同的人类来源于大肠癌患者细胞，通过处理作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物b及属于竞争药物的作为聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂的奥拉帕尼，来利用显微镜观察细胞形状的变化程度，结果仅在p53基因型为正常型且脱氧核糖核酸连接酶4基因型为突变型的来源于大肠癌患者细胞11-ct-79558d(p53野生型/脱氧核糖核酸连接酶4突变型)及11-ct-80464b(p53野生型/脱氧核糖核酸连接酶4突变型)中，可观察到与作为新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/端锚聚合酶双重抑制剂的化合物b相关的细胞形状凋亡，并且在属于竞争药物的作为聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂的奥拉帕尼中无细胞的形状变化，从而仅在p53为正常型且脱氧核糖核酸连接酶4为突变型的情况下，示出基于化合物b的与细胞凋亡相关的药物反应(图20)。
以上，对本发明的特定部分进行了详细记述，就本发明所属技术领域的普通技术人员来说，这种详细说明只属于优选实例，本发明的范围并不局限于此，这是显而易见的。因此，本发明的实质性的范围应根据所附的发明要求保护范围和其的等同技术方案来定义。
序列表
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<120>对聚腺苷二磷酸核糖聚合酶及端锚聚合酶双重抑制剂的灵敏度确定方法
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