本发明涉及用于产生经纯化重组霍乱毒素b(recombinantcholeratoxinb，rctb)的新方法，所述经纯化重组霍乱毒素b提供针对由多种细菌例如霍乱弧菌(vibriocholerae)和肠致病性大肠杆菌(enterotoxigenicescherichiacoli，etec)引起的腹泻的保护。更特别地，本发明涉及用于以显著更高产量和更高纯度产生rctb的方法。本发明还公开了针对霍乱弧菌和肠致病性大肠杆菌(etec)的经纯化rctb的疫苗制剂，其当与全细胞灭活霍乱菌株一起配制时具有协同作用。
背景技术：
腹泻性疾病是对公共健康的持续存在的全球威胁。腹泻的主要原因包括某些细菌、病毒或寄生虫、食物不耐性等。婴幼儿和成人腹泻的主要原因之一是霍乱弧菌。
霍乱弧菌是一种革兰氏阴性菌，其定殖于小肠而不侵入上皮并且引起急性肠霍乱感染。尽管已经鉴定出霍乱弧菌的多于200个血清组，但是霍乱的大多数情况是由两个血清组o1和o139引起的。当霍乱弧菌细菌通过受污染的食物或饮用水被摄取时引起疾病。仅影响人的霍乱是由霍乱毒素(choleratoxin，ct)介导的，霍乱毒素由霍乱弧菌在肠中分泌并且作用于肠的黏膜细胞，引起多种可以导致严重脱水和休克的无痛性水样腹泻。如果不进行治疗的话，可能在数小时内发生死亡。据估计，每年28,000至142,000例的死亡率和每年140万至430万例的患病率可以归因于霍乱。其作为由自然或人为灾难引起的流行病发生，并且在许多发展中国家也是地方病。在这样的灾难中和在地方病国家中，干净的饮用水和合适的环境卫生是不能获得的并且因此疫苗的介入变得必不可少。在2010年，who建议将经口霍乱疫苗与其他控制措施一起在地方病国家中使用和用于霍乱流行二者皆可[cholera–factsheetn107.worldhealthorganization.2012,pp.cholera–factsheetn107]。
目前有三种通过who初审的灭活经口霍乱疫苗可供使用：
1.
2.
公知的是，包含rctb的灭活全细胞疫苗比没有rctb的灭活全细胞疫苗提供更好的保护。由于抗ctb抗体与热不稳定性肠毒素(heatlabileenterotoxin，ltb)的交叉反应性，包含rctb的灭活全细胞疫苗(dukoral)对肠致病性大肠杆菌(etec)同样有效[lucasm.e,deenj.l,vonseidleinl,wangx.y,ampueroj,purim,alim,ansaruzzamanm,amosj,macuamulea等.‘effectivenessofmassoralcholeravaccinationinbeira,mozambique.’n.engl.j.med.2005,352,757–767.]。shanchol缺乏rctb组分并且因此缺乏例如短期etec交叉保护、协同保护作用(抗细菌+抗毒性免疫)、早期和长期保护等的益处。因此，在经口霍乱疫苗中包含rctb是更好的。
rctb是酸不稳定的，因此dukoral疫苗必须在施用疫苗之前向其施加75ml至150ml碳酸氢盐缓冲剂，这使得对于5岁以下的儿童和甚至对于成人而言施用在逻辑上是困难的。此外，在dukoral中，必须打开所述缓冲剂袋并使内容物溶解在所需量的水中，之后添加并混合来自玻璃小瓶的疫苗。该附加剂量制备步骤使该疫苗使用起来不方便且麻烦。
在经口霍乱疫苗中添加rctb可以导致疫苗的成本增加，如从dukoral/shanchol的比较中显而易见的，其中dukoral每剂量定价为超过$45，而shanchol每剂量定价为$5。其中可以使包含rctb的经口霍乱疫苗更具成本效益的一种方式是通过开发以下这样的方法用于rctb发酵和纯化：其使用简单且有效的纯化方法提供高培养物od和高rctb产量。
有许多涉及rctb的产生和纯化的专利和非专利公开内容。文章“recombinantsystemforoverexpressionofcholeratoxinbsubunitinvibriocholeraeasabasisforvaccinedevelopment”pnas,1989,第86卷,第481-485页中的非专利公开内容公开了通过使用亲和色谱柱获得的最佳产量为75μg/ml，这从生产的角度来看并不具有成本效益。另一篇题为“choleratoxinb:onesubunitwithmanypharmaceuticalapplications,”toxins2015,7,974-996的非专利公开了迄今为止用于rctb产生的表达系统的模式和所使用纯化方法的详尽列表。该数据显示，到目前为止还没有实现超过1gm/lt的rctb产量。
鉴于以上现有技术，本领域中的实际贡献将是开发实现显著更高产量以及高纯度的产生和纯化重组霍乱毒素b的方法。此外，需要开发热稳定，消除对缓冲剂施用的需求并且使疫苗递送容易的制剂和剂型。
发明目的
本发明的主要目的是提供用于产生经纯化重组霍乱毒素b(rctb)的新方法。
本发明的另一个目的是提供以显著高产量和高纯度获得经纯化重组霍乱毒素b(rctb)的发酵和纯化方法。
本发明的另一个目的是提供用于通过简单且有效的方法进行rctb的发酵和纯化以在非常短的时间内获得经纯化重组霍乱毒素b(rctb)同时消除不期望杂质的方法。
本发明的另一个目的是提供用于产生经纯化重组霍乱毒素b(rctb)的可放大规模、耗时较短、具有成本效益、环境友好且可负担的方法。
本发明的另一个目的是提供能够用于针对霍乱弧菌的新疫苗制剂的经纯化重组霍乱毒素b(rctb)。
本发明的另一个目的是提供能够用于经口霍乱疫苗的新疫苗制剂，其提供针对霍乱弧菌的早期、长期和协同保护以及针对etec的交叉保护。
发明概述
因此，本发明提供了用于以显著更高产量和更高纯度产生经纯化重组霍乱毒素b(rctb)的新方法。用于产生rctb的本发明方法可放大规模、耗时较短且环境友好，因为细菌菌株在发酵罐中灭活并且因此污染环境的可能性最低。
本发明还涉及rctb与灭活全细胞霍乱弧菌的疫苗制剂和以适于患者顺从性的热稳定剂型提供所述制剂。
本发明的方法在下文作为一个非限制性实例公开：
组成型或诱导型过表达rctb的重组o1霍乱弧菌菌株是由瑞典哥德堡大学(gothenberguniversity,sweden)janholmgren教授的实验室制备的并且用于在预定培养基上制备主细胞库和工作细胞库。
在本发明中，在维持在预定条件下的发酵罐中对所述选定菌株进行发酵。发酵培养基包含葡萄糖进料和其他已知的生产培养基组分。在维持预定ph和温度的同时，使发酵罐运行18至22小时。通过加热至预定温度范围对所得发酵培养物进行灭活，以获得包含灭活细胞、变性蛋白和rctb的收获物。将收获物在室温下以预定rpm离心。对所得上清液进行酸沉淀和超滤以产生经纯化rctb。对如此获得的滤出物进一步进行渗滤，随后进行无菌过滤以产生经纯化且经灭菌的rctb。
对所得经纯化且经灭菌的rctb进行表征和量化。在通过hplc确认期望的纯度并通过gm1elisa和sds-page确认期望的产量之后，将经纯化且经灭菌的rctb用于配制期望的剂型。
相对于现有技术，本发明用于纯化rctb的方法展现出多个优点，例如提供显著更高的产量和更高的纯度。其还提供了产生和纯化rctb的稳健且快速的方法。该方法由于其减少单元操作的数目并且避免使用昂贵的柱色谱术来纯化rctb而具有成本效益。另一个优点是其可在工业上放大规模。由于rctb的存在，所述疫苗制剂还提供了针对霍乱弧菌的协同保护。当将rctb与全细胞灭活霍乱菌株一起配制时，疫苗制剂提供针对etec的交叉保护。
附图简述
图1：发酵期间菌株ms1012的生长曲线。
图2：rctb的差示扫描量热法(differentialscanningcalorimetry，dcs)。
图3：经纯化rctb的hplc谱。
图4：不同纯化阶段中经煮沸rctb样品的sdspage。
图5：(a)rctb的经煮沸样品和未经煮沸样品的sds-page。
(b)rctb的western印迹。
图6：针对量化rctb进行的密度测定术结果。
图7：对于rctb发酵和纯化批次的一致性实验的sdspage。
图8：用于发酵和纯化的示意图。
发明详述
因此，本发明涉及用于产生重组霍乱毒素b的方法，其以>95％的纯度提供1.5至2.5gm/升的高产量的rctb。过表达rctb的重组霍乱弧菌菌株ms1012是由gotovaxab,sweden开发的。所述菌株被hillemanlabs接受作为gotovaxab,sweden与msdwellcometrusthillemanlaboratoriespvt.ltd之间合作的一部分。对来自所述菌株的rctb的方法开发、纯化、量化和表征已经在hillemanlabs进行。
在描述本发明的优选实施方案之前，可以理解本发明并不限于所述的具体材料，因为其可以改变。还可以理解，本文所用的术语仅仅是出于描述具体实施方案的目的而并非意图以任何方式限制本发明的范围。
必须注意的是，除非上下文清楚地另有表明，否则本文所用的没有数量词修饰的名词包括一个/种或更多个/种。
将过表达rctb的选定重组霍乱弧菌菌株ms1012在预定培养基上培养并在预定条件下孵育过夜。然后，在存在葡萄糖进料的情况下，在使ph维持在7.2至7.5并且温度为35摄氏度至37摄氏度的同时，对所述选定菌株进行发酵18至22小时，随后将发酵培养物加热至60℃至70℃的高温30分钟。
然后，对所得发酵培养物进行离心以除去灭活细胞和变性蛋白。
然后，对所得上清液进行超滤。将如此获得的滤液使用500kda超滤膜进行超滤。弃去保留物并收集渗透物。在存在六偏磷酸钠的情况下对如此获得的渗透物进行酸沉淀。对获得的沉淀物进行离心。弃去上清液，收集如此形成的粒料并将其溶解于缓冲溶液，优选ph7.4的磷酸盐缓冲液中。使用10kda膜对所得粒料缓冲液溶液进一步进行超滤以除去培养基组分。将保留物收集并通过0.22μm膜过滤灭菌。对所得经纯化且经灭菌的rctb进行rctb的表征和量化。
rctb的纯度通过hplc和novextris-甘氨酸凝胶14％上的sds-page确认。hplc谱(图3)确认超过95％的纯度。
对rctb的进一步表征是通过使用lt39单克隆抗体的western印迹进行。rctb的量化是通过gm1elisa进行的。elisa和sds-page密度测定术结果二者证实彼此。rctb的总产量为1.5至2.5gm/升。
在实现期望的纯度和产量后，对经纯化且经过滤灭菌的rctb进行配制步骤。
将经纯化rctb与天然分离的具有ogawainaba血清型的灭活全细胞o1霍乱弧菌菌株或共表达ogawa和inaba的重组产生彦岛型(hikojima)菌株混合以产生1mgrctb/1.5ml灭活霍乱弧菌细菌悬浮液。在存在蔗糖的情况下将所得悬浮液在小瓶或托盘中冷冻干燥。冷冻干燥周期为28小时。使搁板温度维持在30℃至50℃，而同时维持压力控制。将经冷冻干燥的材料从托盘转移到氮气室中的气密容器中并储存在4℃下直到使用。
得到的经冷冻干燥材料可以被配制成期望的剂型，更优选地片剂。将rctb与灭活全细胞霍乱弧菌合并，并配制成肠溶包衣有保护性抗酸性聚合物的片剂，所述聚合物特别地在胃肠道的酸性较低区域(小肠)中溶解并释放rctb和灭活全细胞霍乱弧菌。肠溶包衣允许rctb在小肠中释放同时保护免受胃酸性环境而无论进食还是禁食状态。该制剂以在泡罩/带材包装中的固体剂型进行设计、包装和销售以用于旅行者或用于在霍乱地方性或流行性地区的五岁以上的对象。
因此，本发明提供了显著高产量和高纯度。该方法由于其缩短总时间并且避免使用纯化rctb所需的昂贵色谱基质而具有成本效益。本发明还提供了提供针对etec的交叉保护和针对霍乱弧菌的协同作用的一定剂型、优选固体剂型、更优选片剂形式的新疫苗制剂。用于发酵和纯化的示意图如图8所示。
对方法的以上详细描述通过非限制性实例来举例说明：
实施例1：重组霍乱毒素b(rctb)的发酵和纯化
ms1012菌株在例如以下培养基的1.5％琼脂平板上由工作种子批复苏并在37℃下孵育过夜：luriabertini、ms培养基(酪蛋白氨基酸，20gm；蔗糖，2.5gm；na2hpo4.2h2o，6.27gm；k2hpo4，5gm；nh4cl，1gm；na2so4，0.089gm；mgcl2.6h2o，42mg；mncl2.4h2o，4mg；fecl3.6h2o，5mg)、vcg培养基(酪蛋白氨基酸，30gm；酵母提取物、mgso4.7h2o，0.02gm；l-色氨酸，0.05gm；kh2po4，0.13gm；na2hpo4.2h2o，0.87gm；蔗糖，3.4gm)、rctb生产培养基(酪蛋白氨基酸，30gm；蔗糖，2.5gm；na2hpo4.2h2o，6.27gm；k2hpo4，5gm；nh4cl，1gm；na2so4，0.089gm；mgcl2.6h2o，42mg；mncl2.4h2o，4mg；fecl3.6h2o，5mg)等。
从该平板中将3个菌落转移到35ml的例如luriabertini、ms培养基、vcg培养基、rctb生产培养基等的培养基中并使培养物在振动(180rpm)下于37℃下生长直到od600为0.9至1.5/ml或对数中期。将35ml的该培养物用于接种5升发酵罐中的2.5升rctb生产培养基，其包含酪蛋白氨基酸，30gm；蔗糖，2.5gm；na2hpo4.2h2o，6.27gm；k2hpo4，5gm；nh4cl，1gm；na2so4，0.089gm；mgcl2.6h2o，42mg；mncl2.4h2o，4mg；fecl3.6h2o，5mg。将发酵罐的ph维持在7.2±1至7.4±1，温度在37℃，通气为2个反应器体积/分钟，在600rpm下搅拌并且在发酵5小时后在po2下降到小于30％时以0.3ml/分钟的进料速率提供包含1m葡萄糖和rctb生产培养基的进料。在10至12小时内，菌株ms1012的发酵培养物达到8至10的od600(图1)。将经在水中稀释至30％的消泡剂204(sigma)用于控制起泡。在20小时后中止培养并将发酵罐的温度升高至65℃持续30分钟以使不期望的细菌蛋白沉淀。rctb在74℃之前抵抗热变性并且因此不会被沉淀(dsc，图2)。将经热处理的发酵培养物在室温下以8000rpm离心90分钟。弃去碎片并收集上清液，然后对该上清液进行500kda切向流过滤(tangentialflowfiltration，tff)，弃去保留物并收集渗透物。在存在浓度为2.5gm/lt的六偏磷酸钠的情况下，使用6mhcl随后是3mhcl直到ph达到4.5对渗透物进行酸沉淀。将该经酸处理的500kda渗透物在2℃至8℃下以8000rpm离心60分钟。弃去上清液并将粒料溶解于500ml至600ml的ph7.4的20mm磷酸盐缓冲液中，然后进行5x10kdatff以从粒料中除去六偏磷酸钠和培养基组分。收集保留物，过滤，然后通过0.22微米过滤器进行灭菌。
这是经纯化且经灭菌的rctb。发酵和纯化过程是根据如上给出的示意图中所示进行的。通过上述过程进行rctb发酵和纯化的三个一致性实验。
实施例2：重组霍乱毒素b的纯度、表征和量化
通过hplc和sds-page确认rctb的纯度。样品通过hplc-sec在与tskgelpwxl保护柱(6.0x40mm，tosoh)串联的tskgel5000pwxl(7.8x300mm，颗粒尺寸7μm，tosoh)和tskgel4000pwxl(7.8x300mm，颗粒尺寸7μm，tosoh)上进行分析。流动相是ph7.2的0.1mnano3，在等度模式下以1.0ml/分钟的流量进行30分钟。空隙和总柱体积分别用右旋糖酐(mw5,0,00,000-40,0,00,000(himedia))和氧化氘(d2o,merck)确定。在280nm下检测蛋白质峰。hplc谱(图3)显示，该纯化过程向我们提供>95％纯的rctb。
经纯化rctb还通过sds-page在novextris-甘氨酸凝胶14％上进行检查并且使用geldocimager进行条带的检测(图5a和5b)。凝胶清楚地显示在12kda下仅存在一条主带(图5b)。如针对rctb的下表1中所示的，rctb纯度的结果与emea规范完全一致。
表1
重组霍乱毒素的emea规范
rctb的表征使用稀释1:100稀释度的lt39单克隆抗体和稀释度为1:2000的山羊抗小鼠igg-hrp通过western印迹进行。对于western印迹，在sds-page中运行经煮沸和未经煮沸的样品二者。煮沸使60kda的五聚体rctb分解成12kda的单体。由于western印迹抗体仅识别五聚体，因此仅观察到western印迹中在60kda处的五聚体的条带而未观察到单体的条带(图5(b))。
rctb的量化如早前所述通过gm1elisa进行[identificationofescherichiacoliheat-labileenterotoxinbymeansofagangliosideimmunosorbentassay(gm1-elisa)procedure.curr.microbio.1978；1:19-23]。简言之，将0.3nmol/ml的gm1包被在elisa板上。对样品进行三倍稀释。使用浓度为0.5μg/ml的经纯化ctb作为参考。使用稀释1:100稀释度的lt39单克隆抗体作为一抗。使用稀释度为1:4000的山羊抗小鼠igg-hrp作为二抗。rctb的量化还通过密度测定术进行，其结果示于图6中。elisa和密度测定术的结果二者都证实彼此。rctb的总产量为1.5gm/升至2.5gm/升。在三个一致性实验中，rctb的产量为2gm/l、1.7gm/l和2.25gm/l(图7)。
实施例3：制剂和目标产品特征(targetproductprofile，tpp)
在存在蔗糖(2.5mg/ml)的情况下，将经福尔马林灭活的全细胞霍乱弧菌细菌和rctb(1mg/1.5ml经福尔马林灭活的霍乱弧菌细菌)的制剂进行冷冻干燥。冷冻干燥周期为28小时。将搁板温度设为40℃并且将压力控制至922mbar。将经冷冻干燥的材料从托盘转移到氮气室中的气密容器中并储存在4℃下直到使用。该制剂的tpp为片剂。一种疫苗片剂包含经热灭活霍乱弧菌全细胞和rctb的活性药物复合物(每片100至150mg)。片剂中使用的赋形剂是微晶纤维素(25％至30％)、淀粉(25％至30％)、硬脂酸镁(0.5％至0.7％)、胶体二氧化硅(colloidalsiliconedioxide)(0.5％至1％)。所有成分的混合物直接在压片机中压缩。片剂用欧巴代(opadry)(3％至5％)密封包衣并且最后用eudragitl30d55/雅克宜ii(8％至12％)肠溶包衣。