本发明涉及喹唑啉类化合物，具体地指一种含酰腙结构的喹唑啉类化合物及其应用。
背景技术：
癌症，也被称为恶性肿瘤，通常是由于细胞增殖机制失常导致的。全球每年新增癌症病例数将高达1930万例，可见癌症一直是威胁人类健康的一大“杀手”。
表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)是ErbB家族成员之一，具有酪氨酸激酶活性，是一种重要的跨膜受体。EGFR被配体激活后启动胞内信号传导，经过细胞质中衔接蛋白、酶的级联反应，调节转录因子激活基因的转录，指导细胞迁移、黏附、增殖、分化、凋亡，且与肿瘤的形成和恶化密切相关。EGFR抑制剂的研发在分子靶向治疗人类癌症方向已成为热点。目前已报道了大量的EGFR小分子抑制剂(如下结构式所示)，在这些小分子抑制剂中，文献(Suda.K,Murakami.I,Katayama.T,et al.Clin.Cancer.Res.16(2010)5489-5498.)报道了阿法替尼在生物细胞活性及抗肿瘤酶活性上具有高效的作用，除此之外，还有很多EGFR小分子抑制剂具有优良的抗肿瘤活性，如吉非替尼(Fukuoka.M,Yano.S,Giaccone G,et al.J.Clin.Oncol.21(2003)2237-2246.)、达克米替你(Gonzales.A.J,Hook.K.E,Althaus.I.W,Mol,et al.Cancer.Ther.7(2008)1880-1889.)、LP-7(Lai.Y.S,Pang.J.X,Luo.M.H,C.N.Patent 201510184302,2015)以及本课题组近期设计、合成的喹唑啉类衍生物10k(Yuanbiao T,Yiqiang O.Y,Shan X,et al.Bioorg.Med.Chem.24(2016)1495-1503)等。文献(Zijian Liu,Shasha Wu,Yu Wang,et al.Eur.J.Med.Chem.87(2014)782-793)报道了一系列新颖的含有酰腙结构的噻吩并[3,2-d]嘧啶衍生物，其中化合物(Z)-36显示出非常优良的抗肿瘤活性。
本发明在参考文献的基础上，设计合成了一系列喹唑啉类化合物，此系列化合物保留了阿法替尼的主体结构的同时引入了酰腙活性基团，设计并合成了多种含有酰腙结构的喹唑啉类化合物。由于本课题组前期设计的部分含芳基酰腙结构的化合物溶解性不是很好，考虑到可能是结构太大的缘故，故此次发明着重考察的是非芳基取代的喹唑啉类化合物的抗肿瘤活性，以期筛选出活性与选择性更佳的抗肿瘤药物。
技术实现要素：
本发明的目的就是提供一种含酰腙结构的喹唑啉类化合物及其制备方法和应用。
本发明提供如通式I所示含酰腙结构的喹唑啉类化合物、其几何异构体及其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物或前药，结构如下述通式I所示：
其中：
R选自H、CF3、COOH、(C1～C8)烷基、(C3～C6)环烷基、含有1～3个选自O、N和S的杂原子形成5～10元饱和杂环基、
R1选自(C1～C4)烷基、(C3～C6)环烷基、S-四氢呋喃-3-基、
R2选自氢、卤素、三氟甲基、氰基、硝基、羟基、氨基、巯基、羧基、三氟甲氧基、(C1～C4)烷基、(C3～C6)环烷基、(C2～C4)烯基、(C2～C4)炔基、(C1～C4)烷氧基、叠氮基、(C1～C4)烷氧基甲基、(C1～C4)烷基酰基、(C1～C4)烷硫基或
R3选自H或CH3；
R4、R5相同或不同，分别独立地选自(C1～C6)烷基或(C3～C6)环烷基，且R4和R5含有1～2个氢、羟基、氨基、卤素、巯基或羧基取代；或者R4和R5与和它们所连接的氮原子一起形成5～10元饱和杂环基，所述饱和杂环基除了与R4和R5连接的氮原子外，任选含有1～3个选自O、N和S的杂原子；
R6选自氢、(C1～C4)烷基、(C3～C6)环烷基、(C2～C4)烯基、(C2～C4)炔基、(C1～C4)烷氧基、叠氮基、(C1～C4)烷氧基甲基、(C1～C4)烷基酰基、(C1～C4)烷硫基；
n为0～3。
本发明优选涉及如上述通式I含酰腙结构的化合物、其几何异构体、及其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物或前药，其中：
R选自H、CF3、COOH、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、环丙基、
R1选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、环丙基、S-四氢呋喃-3-基、
R2选自氢、卤素、三氟甲基、氰基、硝基、羟基、氨基、巯基、羧基、三氟甲氧基、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、环丙基、环戊基、丙烯基、乙炔基、甲氧基、乙氧基、环丙氧基、叔丁氧基、甲氧基甲基、乙氧基甲基、异丙氧基甲基、甲酰基、乙酰基、丙酰基、环丙酰基、甲硫基、乙硫基、烯丙基、(2-甲基)烯丙基或
R3选自H或CH3；
选自：
R6选自氢、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、环丙基或烯丙基；
n＝0～3。
本发明中，所述通式I的喹唑啉类化合物为选自下列化合物中的一种，但这些化合物并不意味着对本发明的任何限制：
(S,E)-N-(4-((3-氯-4-氟苯基)氨基)-7-((四氢呋喃-3-基)氧基)喹唑啉-6-基)-2-(2-(二甲基氨基)乙基)肼甲酰胺、
(S)-N-(4-((3-氯-4-氟苯基)氨基)-7-((四氢呋喃-3-基)氧基)喹唑啉-6-基)-2-甲基肼甲酰胺、
(S)-N-(4-((3-氯-4-氟苯基)氨基)-7-((四氢呋喃-3-基)氧基)喹唑啉-6-基)-2-乙基肼甲酰胺、
(S)-N-(4-((3-氯-4-氟苯基)氨基)-7-((四氢呋喃-3-基)氧基)喹唑啉-6-基)-2-丙基肼甲酰胺、
(S)-N-(4-((3-氯-4-氟苯基)氨基)-7-((四氢呋喃-3-基)氧基)喹唑啉-6-基)-2-异丙基肼甲酰胺、
(E)-N-(4-((3-氯-4-氟苯基)氨基)-7-甲氧基喹啉-6-基)-2-(2-(二甲基氨基)乙基)肼甲酰胺、
N-(4-((3-氯-4-氟苯基)氨基)-7-甲氧基喹啉-6-基)-2-甲基肼甲酰胺、
N-(4-((3-氯-4-氟苯基)氨基)-7-甲氧基喹唑-6-基)-2-乙基肼甲酰胺、
N-(4-((3-氯-4-氟苯基)氨基)-7-甲氧基喹啉-6-基)-2-丙基肼甲酰胺、
N-(4-((3-氯-4-氟苯基)氨基)-7-甲氧基喹啉-6-基)-2-异丙基肼甲酰胺、
2-(2-((4-((3-氯-4-氟苯基)氨基)-7-甲氧基喹啉-6-基)氨基甲酰基)肼基)乙酸、
(S,E)-叔丁氧羰基-4-((2-((4-((3-氯-4-氟苯基)氨基)-7-((四氢呋喃-3-基)氧基)喹唑啉-6-基)氨基甲酰基)肼基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯、
(S,E)-N-(4-((3-氯-4-氟苯基)氨基)-7-((四氢呋喃-3-基)氧基)喹唑啉-6-基)-2-((1-(3-氯丙基)哌啶-4-基)亚甲基)肼甲酰胺、
(S,E)-N-(4-((3-氯-4-氟苯基)氨基)-7-((四氢呋喃-3-基)氧基)喹唑啉-6-基)-2-((1-(3-吗啉代丙基)哌啶-4-基)亚甲基)肼甲酰胺、
(E)-N-(4-((4-氯-3-(三氟甲基)苯基)氨基)-7-(环丙基甲氧基)喹唑啉-6-基)-2-((1-(3-吗啉代丙基)吡咯烷-3-基)亚甲基)肼甲酰胺、
(E)-N-(4-((4-烯丙基苯基)氨基)-7-(3-(哌啶-1-基)丙氧基)喹唑啉-6-基)-2-((4-((二甲基氨基)甲基)吗啉-3-基)亚甲基)肼甲酰胺、
(E)-N-(7-((1-甲基哌啶-4-基)甲氧基)-4-((3-(甲硫基)苯基)氨基)喹啉-6-基)-2-((1-(2-吗啉代乙基)哌啶-4-基)亚甲基)肼甲酰胺、
(S,E)-2-((1-(2-吗啉代乙基)哌啶-4-基)亚甲基)-N-(4-((3-吗啉代苯基)氨基)-7-((四氢呋喃-3-基)氧基)喹唑啉-6-基)肼甲酰胺、
(S,E)-N-(4-((4-丙酰基苯基)氨基)-7-((四氢呋喃-3-基)氧基)喹唑啉-6-基)-2-((1-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)哌啶-4-基)亚甲基)肼甲酰胺、
(E)-N-(4-((4-氰基苯基)氨基)-7-乙氧基喹唑啉-6-基)-2-((1-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)哌啶-4-基)亚甲基)肼甲酰胺、
(E)-2-((1-(3-(4-甲基哌嗪-1-基)丙基)哌啶-4-基)亚甲基)-N-(7-(2-(哌啶-1-基)乙氧基)-4-((4-(三氟甲氧基)苯基)氨基)喹啉-6-基)肼甲酰胺、
(E)-2-((1-(3-(二乙基氨基)丙基)哌啶-4-基)亚甲基)-N-(4-((4-异丙基苯基)氨基)-7-(2-(哌啶-1-基)乙氧基)喹唑啉-6-基)肼甲酰胺。
下面的合成路线描述了本发明通式I含酰腙结构的喹唑啉类化合物的制备，所有的原料都是通过合成路线中描述的方式、通过有机化学领域普通技术人员熟知的方法制备的或者可商购。本发明的全部最终的喹唑啉类化合物都是通过合成路线中描述的方法或通过与其类似的方法制备的，这些方法是有机化学领域普通技术人员熟知的。合成路线中应用的全部可变因数如下文的定义或如权利要求中的定义。
路线1 目标化合物I的合成路线
本发明通过路线1首先合成中间体IX，再经与不同小分子醛或酮对接得到目标化合物I。
按照本发明所属领域的一些通常方法，本发明中上述通式I的喹唑啉类化合物可以与酸生成药学上可接受的盐。可药用加成盐包括无机酸和有机酸加成盐，与下列酸加成的盐是特别优选的：盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、苯磺酸、萘二磺酸、乙酸、丙酸、乳酸、三氟乙酸、马来酸、柠檬酸、富马酸、草酸、酒石酸、苯甲酸等。
此外，本发明还包括本发明衍生物的前药。本发明衍生物的前药是上述通式I含酰腙结构的喹唑啉类化合物，它们自身可能具有较弱的活性甚至没有活性，但是在给药后，在生理条件下(例如通过代谢、溶剂分解或另外的方式)被转化成相应的生物活性形式。
本发明可以含有上述通式I含酰腙结构的喹唑啉类化合物，及其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物作为活性成份，与药学上可接受的载体或赋型剂混合制备成组合物，并制备成临床上可接受的剂型，上述药学上可接受的赋型剂是指任何可用于药学领域的稀释剂、辅助剂和/或载体。本发明的衍生物可以与其他活性成份组合使用，只要它们不产生其他不利的作用，例如过敏反应。
本发明上述通式I含酰腙结构的喹唑啉类化合物用于患者的临床剂量可以根据：活性成分在体内的治疗功效和生物利用度、它们的代谢和排泄速率和患者的年龄、性别、疾病期来进行适当调整，不过成人的每日剂量一般应当为10～500mg，优选为50～300mg。因此，当本发明的药物组合物被制成单位剂型时，考虑到上述有效剂量，每单位制剂应当含有10～500mg上述通式I含酰腙结构的喹唑啉类化合物，优选为50～300mg。按照医生或药师的指导，这些制剂可以以一定间隔分若干次给药(优选为一至六次)。
本发明的药用组合物可配制成若干种剂型，其中含有药物领域中一些常用的赋形剂。如上所述的若干种剂型可以采用注射剂、片剂、胶囊剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂、外用搽剂、软膏剂等剂型药物。
用于本发明药物组合物的载体是药物领域中可得到的常见类型，包括：粘合剂、润滑剂、崩解剂、助溶剂、稀释剂、稳定剂、悬浮剂、无色素、矫味剂、防腐剂、加溶剂和基质等。药物制剂可以经口服或胃肠外方式(例如静脉内、皮下、腹膜内或局部)给药，如果某些药物在胃部条件下不稳定的，可将其配制成肠衣片剂。
本发明还发现上述含酰腙结构的喹唑啉类化合物在制备治疗和/或预防增生性疾病药物中的应用。本发明的活性化合物或其可药用盐及其溶剂化物可作为唯一的抗增生性药物单独使用，或者可以与现已上市的抗增生性药物联合使用，用于治疗和/或预防增生性疾病，如牛皮癣、良性前列腺肥大、动脉粥样硬化和再狭窄。
本发明还发现上述含酰腙结构的喹唑啉类化合物在制备治疗和/或预防癌症的药物中的应用。本发明化合物体外具有抑制肿瘤细胞生长活性，因此，它可以用作制备治疗和/或预防癌症的药物，如乳腺、肺、肝脏、肾脏、结肠、直肠、胃、前列腺、膀胱、子宫、胰腺、骨髓、睾丸、卵巢、淋巴、软组织、头颈、甲状腺、食道的癌和白血病、成神经细胞瘤等。
本发明还发现上述含酰腙结构的喹唑啉类化合物在制备治疗和/或预防前列腺癌、肺癌、宫颈癌和乳腺癌的药物中的应用。
通过体外抑制肺癌细胞A549、人前列腺癌细胞PC-3、人乳腺癌细胞MCF-7和宫颈癌细胞Hela活性试验，本发明化合物对肺癌细胞、前列腺癌细胞、乳腺癌细胞以及宫颈癌细胞具有显著抑制作用，特别用于制备治疗和/或预防前列腺癌、肺癌和宫颈癌的药物。
通过对EGFR和VEGFR2/KDR激酶活性测试发现，本发明化合物具有显著的抑制EGFR和VEGFR2/KDR激酶活性，对EGFR高表达的肺癌细胞、人前列腺癌细胞、乳腺癌细胞以及宫颈癌细胞等有较强的抑制作用，特别用于制备治疗和/或预防肺癌的药物。
本发明的活性化合物或其可药用盐及其溶剂化物可作为唯一的抗肿瘤药物单独使用，或者可以与现已上市的抗肿瘤药物(如铂类药物顺铂、喜树碱类药物伊立替康、长春花碱类药物诺维本、脱氧胞昔类药物吉西他滨、足叶乙甙、紫杉醇等)联合使用。联合治疗通过将各个治疗组分同时、顺序或隔开给药来实现。
本发明经体外对多种EGFR抑制剂高表达细胞株进行抗肿瘤活性筛选，结果表明具有较强的抗肿瘤活性和选择性，许多化合物还进行了EGFR和VEGFR2/KDR激酶的体内活性测试。实验表明某些化合物具有高效的抗肿瘤活性。
具体实施方式
为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，但它们不对本发明构成限定。
实施例旨在阐述而不是限制本发明的范围。衍生物的核磁共振氢谱用Bruker ARX-400测定，质谱用Agilent 1100LC/MSD测定；所用试剂均为分析纯或化学纯。
通式I含酰腙结构的喹唑啉类化合物：
本发明实施例1～22的结构式如下表1所示。
表1 实施例1～22的结构式
步骤A 7-氟喹唑啉-4-酮(II)的合成
依次向装有300mL无水乙醇的三颈瓶中加入50.0g的4-氟-2-氨基苯甲酸和67.0g醋酸甲脒，混合物加热回流反应24h。反应完毕，减压蒸干大部分溶剂，将反应液倒入1000mL氯化钠水溶液中搅拌30min，抽滤，滤饼用60％的乙醇水溶液洗涤，干燥，得51.0g白色固体，即7-氟喹唑啉-4-酮(II)，收率：96.4％。
mp 260.1-261.0，1H NMR(400MHz,CDCl3)δ12.35(s,1H),8.17(d,J＝6.8Hz,1H),8.14(d,J＝7.2Hz,1H),7.43(d,J＝9.8Hz,1H),7.37(t,J＝8.8Hz,1H).
步骤B 7-氟-6-硝基喹唑啉-4-酮(III)的合成
将50.0g的7-氟喹唑啉-4-酮在冰浴下缓慢加入到103mL浓硫酸和105mL发烟硝酸配成的混酸中，室温搅拌1h后加热至110℃反应3h。反应完毕，冷却至室温，将反应液倒入1000mL冰水混合物中强烈搅拌，抽滤，滤饼用500mL的水洗涤，干燥后的滤饼用300mL的乙醇加热回流30min，趁热抽滤，干燥，得淡黄色固体48.5g，即7-氟-6-硝基喹唑啉-4-酮(III)，收率：76.1％。
mp 277.3-278.5，ESI-MS[M-H]m/z:208,1H NMR(400MHz,DMSO)δ12.77(s,1H),8.68(dd,J＝8.2,2.7Hz,1H),8.28(s,1H),7.73(dd,J＝12.2,2.8Hz,1H).
步骤C 7-氟-6-硝基-4-氯喹唑啉(IV)的合成
将48.0g的7-氟-6-硝基喹唑啉-4-酮加入到407.0mL氯化亚砜和75.0mL三氯氧磷混合液中，向混合液滴加2.4mL的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，80℃加热回流3h，反应液变黄色澄清后再110℃加热回流6h。反应完毕，减压蒸干多余溶剂，用甲苯带走少量的溶剂，固体粉末缓慢倒入冰的碳酸氢钠水溶液中搅拌1h，抽滤，水洗，干燥，得50.7g黄色固体，即7-氟-6-硝基-4-氯喹唑啉，收率：97.0％。mp 118.2-119.3℃，1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.66(dd,J＝8.2,1.2Hz,1H),8.41(s,1H),7.75(d,J＝12.2Hz,1H).
步骤D 4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-6-硝基-7-氟喹唑啉(V)的合成
依次向400mL的异丙醇中加入50.0g的7-氟-6-硝基-4-氯喹唑啉、32.3g的4-氟-3-氯苯胺，向反应液中滴加34.0mL三乙胺，常温搅拌1.5h。反应完毕，抽滤，滤饼用异丙醇和水洗涤，干燥，滤液加大量水搅拌析出固体，抽滤，水洗，干燥，合并，得65.0g深黄色固体，即4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-6-硝基-7-氟喹唑啉，收率：87.8％。
mp 261.4-262.5，ESI-MS[M+H]m/z:337.1,1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.43(s,1H),9.51(d,J＝7.8Hz,1H),8.68(s,1H),8.08(d,J＝6.4Hz,1H),7.79(d,J＝5.2Hz,1H),7.76(s,1H),7.45(t,J＝9.0Hz,1H).
步骤E 4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-6-硝基-7-[(S)-(四氢呋喃-3-基)-氧基]-喹唑啉(VIa)的合成
将60％氢化钠4.7g加入到400mL四氢呋喃(THF)中搅拌，缓慢滴加12.0mL的(S)-3-羟基四氢呋喃，冰浴搅拌45min。20.0g中间体V(溶于200mL的THF中)缓慢滴入，常温反应5h。反应完毕，减压蒸干溶剂，加500mL碳酸氢钠水溶液搅拌30min，抽滤，滤饼用40％的乙醇水溶液洗涤，干燥，得23.9g深黄色固体，即4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-6-硝基-7-[(S)-(四氢呋喃-3-基)-氧基]-喹唑啉(VIa)，收率：99.5％。
mp 210.1-211.0，[M+H]m/z:405.1,1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.10(d,J＝11.8Hz,1H),9.16(d,J＝13.2Hz,1H),8.62(d,J＝13.4Hz,1H),8.13(d,J＝6.8Hz,1H),7.75(s,1H),7.45–7.35(m,2H),5.40(s,1H),3.99–3.79(m,4H),2.34(dd,J＝13.8,6.2Hz,1H),2.04(d,J＝5.6Hz,1H).
步骤F 4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-6-硝基-7-甲氧基]-喹唑啉(VIb)的合成
将11.37g中间体V加入到227mL甲醇和15mL的50％氢氧化钠水溶液中，加热回流1.5h，反应完毕后冷却至室温，倒入200mL冰水中强烈搅拌30min，抽滤，水洗，干燥，得11.2g黄色固体，即4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-6-硝基-7-甲氧基]-喹唑啉(VIb)，收率：94.9％。
m.p.292.3-293.0℃.ESI-MS m/z:[M+H]349.1，1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.13(s,1H),9.20(s,1H),8.66(s,1H),8.20–8.10(m,1H),7.84–7.73(m,1H),7.51–7.41(m,2H),4.05(s,3H).
步骤G 4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-6-氨基-7-[(S)-(四氢呋喃-3-基)-氧基]-喹唑啉(VIIa)的合成
将21.4g中间体VIa加入到700mL乙醇中，加热至60℃时加入15.0g活性炭，4.2g三氯化铁，升至80℃时缓慢滴加24.5mL的80％水合肼，继续加热回流1.5h。反应完毕，趁热抽滤，滤渣用乙酸乙酯冲洗，减压旋蒸滤液，旋至10％溶剂时加入500mL水，强烈搅拌，抽滤，干燥，得17.3g灰白色固体，即4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-6-氨基-7-[(S)-(四氢呋喃-3-基)-氧基]-喹唑啉(VIIa)，收率：87.3％。
mp 139.3-140.1，[M+H]m/z:375.2,1H NMR(400MHz,DMSO)δ9.41(s,1H),8.38(s,1H),8.17(t,J＝12.6Hz,1H),7.88–7.73(m,1H),7.38(dd,J＝17.2,8.2Hz,2H),7.05(s,1H),5.41(s,2H),5.20(s,1H),4.00–3.87(m,3H),3.77(dd,J＝12.6,7.8Hz,1H),2.29(td,J＝14.2,7.2Hz,1H),2.19–2.06(m,1H).
按照步骤G可合成VIIb。
步骤H(S)-苯基-N-(4-((3-氯-4-氟苯基)氨基)-7-((四氢呋喃-3-基)氧基)喹唑啉-6-基)氨基甲酸(VIIIa)的合成
将5.5mL的N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)加入到102.0mL的1,4-二氧六环中，4.2mL氯甲酸苯酯加入到混合液中，将5.07g中间体VIIa加入到30.0mL的1,4-二氧六环中，冰浴下缓慢滴入混合液中，反应完毕后加入200.0mL的水淬灭反应，抽滤，滤饼水洗，干燥，得到5.36g黄色固体，即(S)-苯基-N-(4-((3-氯-4-氟苯基)氨基)-7-((四氢呋喃-3-基)氧基)喹唑啉-6-基)氨基甲酸(VIIIa)，收率：80％。
[M+H]m/z:494.2。
按照步骤H可合成VIIIb。
步骤I(S)-N-(4-((3-氯-4-氟苯基)氨基)-7-((四氢呋喃-3-基)氧基)喹唑啉-6-基)肼甲酰胺(IXa)的合成
将2.0g中间体VIIIa加入到10.0mL的1,4-二氧六环和2.0mL的80％水合肼混合液中80℃加热反应30min，反应完毕，趁热抽滤，干燥，得1.49g白色固体，即(S)-N-(4-((3-氯-4-氟苯基)氨基)-7-((四氢呋喃-3-基)氧基)喹唑啉-6-基)肼甲酰胺(IXa)，收率：85％。
[M+H]m/z:433.2，1H NMR(400MHz,DMSO)δ9.78(s,1H),9.28(s,1H),8.92(s,1H),8.43(d,J＝12.7Hz,1H),8.07(d,J＝6.6Hz,1H),7.92(s,1H),7.76(d,J＝8.6Hz,1H),7.40(t,J＝9.1Hz,1H),7.24(s,1H),5.36(s,1H),4.68(s,2H),4.01(dd,J＝10.2,4.0Hz,1H),3.98-3.86(m,2H),3.82(dd,J＝12.4,7.9Hz,1H),2.37(td,J＝14.2,7.5Hz,1H),2.15–1.84(m,1H).
按照步骤I可合成IXb。
步骤J(S,E)-N-(4-((3-氯-4-氟苯基)氨基)-7-((四氢呋喃-3-基)氧基)喹唑啉-6-基)-2-(2-(二甲基氨基)乙基)肼甲酰胺的合成
将0.1g中间体IXa和0.04g的2-(二甲基氨基)乙醛加入到8.0mL乙醇中，加入2滴冰醋酸，加热回流1.5小时，反应完成后，减压蒸馏大部分溶剂，抽滤，干燥，得到白色固体0.11g，即得(S,E)-N-(4-((3-氯-4-氟苯基)氨基)-7-((四氢呋喃-3-基)氧基)喹唑啉-6-基)-2-(2-(二甲基氨基)乙基)肼甲酰胺，收率：80.1％。
实施例1
(S,E)-N-(4-((3-氯-4-氟苯基)氨基)-7-((四氢呋喃-3-基)氧基)喹唑啉-6-基)-2-(2-(二甲基氨基)乙基)肼甲酰胺
先按照步骤A～C合成7-氟-6-硝基-4-氯喹唑啉(IV)，再由中间体IV通过步骤D合成4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-6-硝基-7-氟喹唑啉(V)，通过步骤E合成4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-6-硝基-7-[(S)-(四氢呋喃-3-基)-氧基]-喹唑啉(VIa)；通过步骤G合成4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-6-氨基-7-[(S)-(四氢呋喃-3-基)-氧基]-喹唑啉(VIIa)，通过步骤H得到(S)-苯基-N-(4-((3-氯-4-氟苯基)氨基)-7-((四氢呋喃-3-基)氧基)喹唑啉-6-基)氨基甲酸(VIIIa)，通过步骤I得到(S)-N-(4-((3-氯-4-氟苯基)氨基)-7-((四氢呋喃-3-基)氧基)喹唑啉-6-基)肼甲酰胺(IXa)，最后通过步骤J得到(S,E)-N-(4-((3-氯-4-氟苯基)氨基)-7-((四氢呋喃-3-基)氧基)喹唑啉-6-基)-2-(2-(二甲基氨基)乙基)肼甲酰胺。
mp 227.9-230.0，ESI-MS m/z:[M+H]502.2，1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.86(s,1H),9.84(s,1H),8.95(d,J＝14.7Hz,2H),8.49(s,1H),8.08(d,J＝6.6Hz,1H),7.76(s,1H),7.41(t,J＝9.0Hz,1H),7.29(s,2H),5.40(s,1H),4.05–3.98(m,1H),3.91(d,J＝10.3Hz,2H),3.86(d,J＝4.4Hz,1H),3.04(d,J＝5.3Hz,2H),2.37(dd,J＝13.7,6.1Hz,1H),2.19(s,6H),2.12(s,1H).
按照实施例1的方法，分别以相应的取代醛或酮制得实施例2～22化合物。
实施例2
(S)-N-(4-((3-氯-4-氟苯基)氨基)-7-((四氢呋喃-3-基)氧基)喹唑啉-6-基)-2-甲基肼甲酰胺
mp 260.0-261.5，ESI-MS m/z:[M+H]445.1，1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.99(s,1H),9.83(s,1H),8.93(s,1H),8.80(s,1H),8.50(s,1H),8.08(d,J＝6.5Hz,1H),7.77(d,J＝8.8Hz,1H),7.41(t,J＝9.1Hz,1H),7.29(s,1H),6.96(d,J＝11.6Hz,1H),6.43(d,J＝11.7Hz,1H),5.35(d,J＝12.7Hz,1H),4.00(dd,J＝10.4,4.3Hz,1H),3.91(dd,J＝12.3,8.4Hz,2H),3.82(dd,J＝12.8,8.2Hz,1H),2.36(dt,J＝14.0,6.9Hz,1H),2.13–2.03(m,1H).
实施例3
(S)-N-(4-((3-氯-4-氟苯基)氨基)-7-((四氢呋喃-3-基)氧基)喹唑啉-6-基)-2-乙基肼甲酰胺
mp 258.5-260.0，ESI-MS m/z:[M+H]459.1，1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.72(s,1H),9.83(s,1H),8.95(d,J＝12.7Hz,2H),8.49(s,1H),8.08(d,J＝5.9Hz,1H),7.76(s,1H),7.41(t,J＝8.9Hz,1H),7.34(d,J＝4.9Hz,1H),7.29(s,1H),5.40(s,1H),4.01(d,J＝5.7Hz,1H),3.91(dd,J＝16.1,9.1Hz,2H),3.88(s,1H),2.40–2.31(m,1H),2.11(s,1H),1.92(d,J＝5.2Hz,3H).
实施例4
(S)-N-(4-((3-氯-4-氟苯基)氨基)-7-((四氢呋喃-3-基)氧基)喹唑啉-6-基)-2-丙基肼甲酰胺
mp 266.4-268.8，ESI-MS m/z:[M+H]473.1，1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.72(s,1H),9.83(s,1H),8.97(s,2H),8.49(s,1H),8.07(d,J＝5.9Hz,1H),7.76(d,J＝8.6Hz,1H),7.41(s,2H),7.28(s,1H),5.39(s,1H),4.01(dd,J＝10.4,4.3Hz,1H),3.97–3.86(m,2H),3.87–3.78(m,1H),2.44–2.33(m,1H),2.33(s,2H),2.14–2.04(m,1H),1.09(t,J＝7.3Hz,3H).
实施例5
(S)-N-(4-((3-氯-4-氟苯基)氨基)-7-((四氢呋喃-3-基)氧基)喹唑啉-6-基)-2-异丙基肼甲酰胺
mp 275.3-276.8，ESI-MS m/z:[M+H]612.2，1H NMR(400MHz,DMSO)δ9.83(d,J＝12.6Hz,2H),9.25(s,1H),8.94(s,1H),8.49(s,1H),8.07(d,J＝6.8Hz,1H),7.75(s,1H),7.41(t,J＝9.0Hz,1H),7.29(s,1H),5.40(s,1H),4.01(dd,J＝10.3,3.8Hz,1H),3.98–3.87(m,2H),3.87(s,1H),2.43–2.31(m,1H),2.16–2.05(m,1H),1.98(s,3H),1.92(s,3H).
实施例6
(E)-N-(4-((3-氯-4-氟苯基)氨基)-7-甲氧基喹啉-6-基)-2-(2-(二甲基氨基)乙基)肼甲酰胺
mp 226.3.4-227.4，ESI-MS m/z:[M+H]447.1，1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.82(s,1H),9.82(s,1H),8.91(s,1H),8.77(s,1H),8.49(s,1H),8.08(d,J＝6.1Hz,1H),7.76(s,1H),7.40(t,J＝9.0Hz,1H),7.32(t,J＝5.3Hz,1H),7.29(s,1H),4.04(s,3H),3.07(d,J＝5.1Hz,2H),2.21(s,6H).
实施例7
N-(4-((3-氯-4-氟苯基)氨基)-7-甲氧基喹啉-6-基)-2-甲基肼甲酰胺
mp 260.0-261.2，ESI-MS m/z:[M+H]389.1，1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.99(s,1H),9.84(s,1H),8.93(s,1H),8.75(s,1H),8.51(s,1H),8.08(d,J＝6.5Hz,1H),7.77(s,1H),7.41(t,J＝9.0Hz,1H),7.30(s,1H),6.97(d,J＝12.1Hz,1H),6.45(d,J＝11.5Hz,1H),4.05(s,3H).
实施例8
N-(4-((3-氯-4-氟苯基)氨基)-7-甲氧基喹唑-6-基)-2-乙基肼甲酰胺
mp 289.4-291.2，ESI-MS m/z:[M+H]404.1，1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.67(s,1H),9.80(s,1H),8.92(d,J＝8.4Hz,2H),8.77(s,1H),8.50(s,1H),8.44(s,1H),8.08(d,J＝7.1Hz,1H),7.78(s,1H),7.01(s,1H),4.05(s,3H),3.99(s,3H).
实施例9
N-(4-((3-氯-4-氟苯基)氨基)-7-甲氧基喹啉-6-基)-2-丙基肼甲酰胺
mp307.9-308.6，ESI-MS m/z:[M+H]417.1。
实施例10
N-(4-((3-氯-4-氟苯基)氨基)-7-甲氧基喹啉-6-基)-2-异丙基肼甲酰胺
mp 283.1-285.2，ESI-MS m/z:[M+H]418.1，1H NMR(400MHz,DMSO)δ9.82(s,1H),9.75(d,J＝8.7Hz,1H),9.02(s,1H),8.92(s,2H),8.50(s,1H),8.08(d,J＝7.0Hz,1H),7.76(s,1H),7.41(t,J＝9.0Hz,1H),7.29(s,1H),4.05(s,3H),1.99(s,3H),1.91(s,3H).
实施例11
2-(2-((4-((3-氯-4-氟苯基)氨基)-7-甲氧基喹啉-6-基)氨基甲酰基)肼基)乙酸
ESI-MS m/z:[M+H]433.1。
实施例12
(S,E)-叔丁氧羰基-4-((2-((4-((3-氯-4-氟苯基)氨基)-7-((四氢呋喃-3-基)氧基)喹唑啉-6-基)氨基甲酰基)肼基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯、
ESI-MS m/z:[M+H]629.2。
实施例13
(S,E)-N-(4-((3-氯-4-氟苯基)氨基)-7-((四氢呋喃-3-基)氧基)喹唑啉-6-基)-2-((1-(3-氯丙基)哌啶-4-基)亚甲基)肼甲酰胺
ESI-MS m/z:[M+H]605.2。
实施例14
(S,E)-N-(4-((3-氯-4-氟苯基)氨基)-7-((四氢呋喃-3-基)氧基)喹唑啉-6-基)-2-((1-(3-吗啉代丙基)哌啶-4-基)亚甲基)肼甲酰胺
ESI-MS m/z:[M+H]656.3。
实施例15
(E)-N-(4-((4-氯-3-(三氟甲基)苯基)氨基)-7-(环丙基甲氧基)喹唑啉-6-基)-2-((1-(3-吗啉代丙基)吡咯烷-3-基)亚甲基)肼甲酰胺
ESI-MS m/z:[M+H]676.3。
实施例16
(E)-N-(4-((4-烯丙基苯基)氨基)-7-(3-(哌啶-1-基)丙氧基)喹唑啉-6-基)-2-((4-((二甲基氨基)甲基)吗啉-3-基)亚甲基)肼甲酰胺
ESI-MS m/z:[M+H]631.2。
实施例17
(E)-N-(7-((1-甲基哌啶-4-基)甲氧基)-4-((3-(甲硫基)苯基)氨基)喹啉-6-基)-2-((1-(2-吗啉代乙基)哌啶-4-基)亚甲基)肼甲酰胺
ESI-MS m/z:[M+H]677.4。
实施例18
(S,E)-2-((1-(2-吗啉代乙基)哌啶-4-基)亚甲基)-N-(4-((3-吗啉代苯基)氨基)-7-((四氢呋喃-3-基)氧基)喹唑啉-6-基)肼甲酰胺
ESI-MS m/z:[M+H]675.4。
实施例19
(S,E)-N-(4-((4-丙酰基苯基)氨基)-7-((四氢呋喃-3-基)氧基)喹唑啉-6-基)-2-((1-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)哌啶-4-基)亚甲基)肼甲酰胺
ESI-MS m/z:[M+H]630.4。
实施例20
(E)-N-(4-((4-氰基苯基)氨基)-7-乙氧基喹唑啉-6-基)-2-((1-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)哌啶-4-基)亚甲基)肼甲酰胺
ESI-MS m/z:[M+H]557.3。
实施例21
(E)-2-((1-(3-(4-甲基哌嗪-1-基)丙基)哌啶-4-基)亚甲基)-N-(7-(2-(哌啶-1-基)乙氧基)-4-((4-(三氟甲氧基)苯基)氨基)喹啉-6-基)肼甲酰胺
ESI-MS m/z:[M+H]742.4。
实施例22
(E)-2-((1-(3-(二乙基氨基)丙基)哌啶-4-基)亚甲基)-N-(4-((4-异丙基苯基)氨基)-7-(2-(哌啶-1-基)乙氧基)喹唑啉-6-基)肼甲酰胺
ESI-MS m/z:[M+H]673.5。
本发明产物的药理研究
体外细胞毒活性
对按照本发明通式I含酰腙结构的喹唑啉类化合物进行了体外抑制肺癌细胞A549、前列腺癌PC-3、乳腺癌细胞MCF-7、宫颈癌细胞Hela活性筛选，对照品阿法替尼按照专利文献(WO2007085638A1)所述方法制备得到。
1)细胞复苏并传代2～3次稳定后，用胰蛋白酶溶液(0.25％)使其从培养瓶底部消化下来。将细胞消化液倒入离心管中后，之后加入培养液以终止消化。将离心管在800r/min下离心10min，弃去上清液后加入5mL培养液，吹打混匀细胞，吸取10μL细胞混悬液加入细胞计数板中计数，调整细胞浓度为104个/孔。96孔板中除A1孔为空白孔不加细胞外，其余皆加入100μL细胞混悬液。将96孔板放入培养箱中培养24h。
2)用50μL二甲基亚砜溶解受试样品，然后加入适量培养液，使样品溶解成2mg/mL药液，然后在24孔板中将样品稀释为20、4、0.8、0.16、0.032μg/mL。
每个浓度加入3孔，其中周围两行两列细胞长势受环境影响较大，只和为空白细胞孔使用。将96孔板放入培养箱中培养72h。
3)将96孔板中带药培养液弃去，用磷酸缓冲溶液(PBS)将细胞冲洗两遍，在每孔中加入MTT(四氮唑)(0.5mg/mL)100μL放入培养箱中4h后，弃去MTT溶液，加入二甲基亚砜100μL。在磁力振荡器上振荡使存活细胞与MTT反应产物甲臜充分溶解，放入酶标仪中测定结果。通过Bliss法可求出药物IC50值。
化合物的乳腺癌细胞MCF-7、肺癌细胞A549、前列腺癌PC-3活性结果见表2。
EGFR、VEGFR2酶活性实验
以阿法替尼为阳性对照，利用HTRF技术，测试新合成化合物对EGFR或VEGFR2激酶的抑制作用，并测试部分化合物对EGFR或VEGFR2激酶抑制作用的IC50值。
具体方法：配制所需浓度的ATP、TK Substrate-biotin(TK-底物生物素)、Kinase buffer(激酶缓冲液)的工作液，ATP、TK Substrate-biotin、Kinase buffer按体积比例2∶2∶2取液混匀；用Kinase buffer稀释药物配制为所需浓度；配制EGFR、VEGFR2酶工作液。在白色384孔板中，每孔加入6μL混匀液，2μL药物，2μL激酶，混匀，置于37℃下反应30min。然后加入5μL链激酶素标记的XL-665及5μL结合了Eu3+的穴状化合物抗体，混匀。室温放置30min后于酶标仪314nm激发，检测665、620nm波长处的荧光，计算激酶抑制率。
抑制率(％)＝(Ratio665/620对照孔－Ratio665/620给药孔)/Ratio665/620对照孔×100％
实验结果如表2所示。表1中抑制率>＝80％，以“+++”表示，80％>抑制率>＝60％，以“++”表示，60％>抑制率>＝40％，以“+”表示，抑制率<＝40％，以“-”表示，“NA”表示无活性，“ND”表示未测试。
表2 目标化合物酶活性和体外抗肿瘤活性
从上述试验结果可以清楚地看出，本发明所要保护的通式I含酰腙结构的喹唑啉类化合物，具有良好的体外抗肿瘤活性。
本发明中通式I含酰腙结构的喹唑啉类化合物可单独施用，但通常是和药用载体混合物给予，所述药用载体的选择要根据所需用药途径和标准药物实践，下面分别用该类化合物的各种药物剂型，例如片剂、胶囊剂、注射剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂、外用搽剂和软膏剂的制备方法，说明其在制药领域中的新应用。
应用例1：片剂
以实施例1化合物5g，按照药剂学一般压片法加辅料10g混匀后，压制成50片，每片重150mg。
应用例2：胶囊剂
以实施例1化合物5g，按照药剂学胶囊剂的要求将辅料10g混匀后，装入空心胶囊，每个胶囊重150mg。
应用例3：注射剂
以实施例6化合物5g，按照药剂学常规方法，进行活性炭吸附，经0.65μm微孔滤膜过滤后，填入氮气罐制成水针制剂，每只装2mL，共灌装50瓶。
应用例4：气雾剂
以实施例3化合物5g，用适量丙二醇溶解后，加入蒸馏水及其他辐料后，制成250mL的澄清溶液即得。
应用例5：栓剂
以实施例4化合物5g，将之研细加入甘油适量，研匀后加入已熔化的甘油明胶，研磨均匀，倾入已涂润滑剂的模型中，制得栓剂25颗。
应用例6：膜剂
以实施例7化合物5g，将聚乙烯醇、药用甘油、水等搅拌膨胀后加热溶解，80目筛网过滤，再将实施例7化合物加入到滤液中搅拌溶解，涂膜机制膜50片。
应用例7：滴丸剂
以实施例8化合物15g，与明胶等基质50g加热熔化混匀后，滴入低温液体石蜡中，共制得滴丸1000丸。
应用例8：外用搽剂
以实施例1化合物10g，按照常规药剂学方法与乳化剂等辅料2.5g混合研磨，再加蒸馏水至200mL制得。
应用例9：软膏剂
以实施例1化合物5g，研细后与凡士林等油性基质250g研匀制得。
尽管已经通过特定实施方案描述了本发明，但修改和等价变化对于精通此领域的技术人员而言是显见的，且它们都包含在本发明范围之内。