本发明属于海洋生物医药技术领域，具体涉及一种海绵的化学成分提取方法。
背景技术：
海洋生物碱作为海洋生物的一种特征次级代谢产物，以其结构的新颖性、多样性和显著的生物活性成为海洋天然产物的重要研究对象。到目前为止，海洋来源的天然产物已经超过20000个，其中约三分之一的化合物含有氮原子，在46个海洋药物中，33个属于生物碱。海绵一直是海洋生物碱的主要来源，研究报道Calcarea纲中富含咪唑生物碱，在过去的30年中，共分离得到60多个咪唑生物碱。这类生物碱具有显著的抗菌、抗炎和细胞毒活性。
海绵是生物碱的主要来源，这些生物碱具有结构类型新颖，生物活性好的特征。Calcarea纲的海绵分布与全球各个海域，其中Leucetta和Clathrina属海绵被报道其特征性化学成分为咪唑类生物碱，在过去30年中，从这两个属中分离到的咪唑类生物碱已超过60个。咪唑类生物碱的结构以2-氨基咪唑环为基本母核，2位氨基通常连有取代基乙内酰脲，N1，C-4，C-5位常连有苯环取代基，C-4，C-5位连有苯环的称为naamines或naamidines，N1，C-4位连有苯环的结构类型称作isonaamines或isonaamidines。
技术实现要素：
本发明旨在提供一种全面提取海绵中化学成分的方法。
海绵的化学成分提取方法，步骤如下：将海绵样品搅碎后，室温下用甲醇冷浸提取4次，每次浸泡3天；合并提取液，减压浓缩，用无水甲醇脱盐三次，得到总浸膏36.2g。经100~200目的减压硅胶柱层析，石油醚/丙酮梯度洗脱(100:1到1:2,v/v)，得到粗组分。
对上述粗组分进行进一步分离纯化，首先用手性柱进行分离，然后采用半制备高效液相色谱HPLC进行分离纯化。
本发明综合利用TCL、CC、ODS、SephadexLH-20、HPLC等现代色谱分离技术，从海绵Pericharaxheteroraphis中分离得到7个化合物。包括5个咪唑类生物碱(PH-1~PH-5)，1个聚酮类化合物(PH-6)，1个核苷类化合物(PH-7)。除化合物PH-2其余化合物均为首次从本属海绵中获得。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
将海绵样品搅碎后，室温下用甲醇冷浸提取4次，每次浸泡3天；合并提取液，减压浓缩，用无水甲醇脱盐三次，得到总浸膏36.2g。经100~200目的减压硅胶柱层析，石油醚/丙酮梯度洗脱(100:1到1:2,v/v)，得到粗组分。
在过减压柱的过程中，发现有很多黄色物质，对其进行HPLC分析，所示，推测是咪唑类生物碱的物质，因此对其进行针对性的分离。
生物碱段（6.7g）取部分样品，经过中压液相砍段，洗脱条件如下：
流速：20mL/min；检测波长：230nm 320nm
经过中压砍段后，分为3个主峰，主峰1~3，主峰1在C18柱上为一个单峰，但是核磁谱图信号显示为混合物，因此用手性柱进行分离，选用IC手性柱，液相条件为：流动相：100%甲醇；流速：0.7mL/min，检测波长：210nm，进一步分离得化合物PH-1(3.5mg)和PH-2(4.3mg)，主峰2进一步用半制备高效液相色谱HPLC进行分离纯化(YMC-PackODSC8,10×250mm,5μm；流动相：乙腈/水(65:35)：1‰HCOOH，流速：1.5mL/min，检测波长：210nm)得到化合物PH-3(30mg)，主峰3也进一步用半制备高效液相色谱HPLC进行分离纯化(YMC-Pack ODSC8,10×250mm,5μm；流动相：乙腈/水(64:36)：1‰HCOOH，流速：1.5mL/min，检测波长：210nm)得到化合物PH-4(8mg)和PH-5(5.3mg)。从其他组分中以石油醚/丙酮(35:1)洗脱的硅胶柱层析后，再通过半制备高效液相色谱HPLC(流动相为甲醇/水80:20)进步纯化得化合物PH-6(5.0mg)。PH-7(3.4mg)是经过HPLC用10%甲醇/水制备出来的。
分离得到的化合物的理化数据如下
化合物PH-1：leucettamineC
分子式：C12H13N3O2，分子量：231，黄色油状物。ESI-MS:m/z232[M+H]+。1H-NMR(500MHz，DMSO,TMS,δ)H：8.01(2H,d,J=8.6Hz,H-9,11),7.44 (2H,s,NH2),6.92 (2H,d,J=8.7Hz,H-8,12), 6.36(1H,s,H-6),3.77(3H,s,13-OCH3),3.03(3H,s,N-CH3)。以上数据与文献对照一致，鉴定化合物PH-1为leucettamineC。
化合物PH-2：leucettaamineB
分子式：C12H11N3O3，分子量：245，黄色油状物。ESI-MS:m/z246[M+H]+。1H-NMR(500MHz，DMSO,TMS,δ)H:7.92(1H,s,H-9),7.50(2H,s,NH2), 7.40(1H,d,J=8.0Hz,H-13), 6.90(1H,d,J=8.1Hz,H-12),6.34(1H,s,H-7),6.02(2H,s,H-14),3.03(3H,s,N-CH3).。以上数据与文献对照一致，鉴定化合物PH-2为leucettamineB。
化合物PH-3：pyronaamidine
分子式：C25H27N5O6，分子量：493，黄色油状物。ESI-MS:m/z494[M+H]+。1H-NMR(500MHz，CDCl3,TMS,δ)H：8.01(2H,d,J=8.6Hz,H-9,11),7.44(2H,s,NH2), 6.92(2H,d,J=8.7Hz,H-8,12),6.36(1H,s,H-6),3.77(3H,s,13-OCH3),3.03(3H,s,N-CH3);13CNMR(150MHz，CDCl3,TMS,δ)c147.8(s,C-2), 126.8(s,C-4), 132.7(s,C-5),153.9(s,C-7),161.2(s,C-9), 164.8(s,C-11),31.0(t,C-12),22.9(t,C-13),30.2(q,C-14),24.3(q,C-15),130.0(s,C-1′), 128.6(s,C-2′6′),113.3(s,C-3′5′),157.8(s,C-4′), 115.9(s,C-1′′), 147.0(s,C-2′′), 135.4(s,C-3′′), 151.2(s,C-4′′),103.8(d,C-5′′),123.2(d,C-6′′), 55.0(q,4′-OCH3), 60.9(q,3′′-OCH3),55.8(q,4′′-OCH3)。以上数据与文献对照一致，鉴定化合物PH-3为pyronaamidine。
化合物PH-4：naamidineH
分子式：C25H27N5O6，分子量：493，黄色油状物。ESI-MS:m/z494[M+H]+。1H-NMR(500MHz，CDCl3,TMS,δ)H：7.08(2H,d,J=8.6Hz,H-3′,5′), 6.79(2H,s,J=8.6Hz,H-2′,6′), 6.38(1H,d,J=8.6Hz,H-5′′), 6.29(1H,s,d,J=8.6Hz,H-6′′), 3.90(3H,s,3′′-OCH3),3.82(3H,s,4′′-OCH3),3.77(3H,s,4′-CH3), 3.56(3H,s,14-CH3), 3.16(3H,s,15-CH3)。 以上数据与文献对照一致，鉴定化合物PH-4化合物PH-1：leucettamineC为naamidineH。
化合物PH-5:leucettamineJ
分子式：C25H27O5N5，分子量：477，黄色油状物。UV(MeOH):λmax(logε)225(4.27),275(3.77),392(3.97)nm；IR(KBr):3427, 2960,2873,1731,1710,1377, 1250,1068, 1025cm-1；1H-NMR(500MHz,CDCl3)和13C-NMR(125MHz,CDCl3)数据见表2-1;HR-ESI-MSpositiveionmode):m/z=478.2091[M+H]+(计算值为478.2085)，m/z=500.1906[M+Na]+(计算值为500.1904)。
化合物PH-6：(-)-Methyl(2Z,6R,8R,9E)-3,6-epoxy-4,6,8-triethyl-2,4,9-dodecatrienoate
分子式：C19H30O3，分子量：306，无色油状物；10%H2SO4/EtOH显紫红色；EIMSm/z:329.0[M+Na]+；1HNMRCDCl3,600MHz)δ:0.75 (3H,t,J=5Hz,H-16), 0.76 (3H,t,J= 5Hz,H-18), 0.93(3H,t,J=7.5Hz,H-12),1.13(3H,t,J=7.5Hz,H-14), 3.69(3H,s,OCH3),4.80(1H,s,H-2), 5.00(1H,dd,J=17.5,7.5Hz,H-9), 5.20(1H,dt,J=15.0,5.0Hz,H-10), 6.18(1H,s,H-5); 13CNMR(DMSO-d6, 150MHz) δ7.7(C-16,q),11.7(C-18,q),11.7(C-14,q),13.8(C-12,q),17.9(C-13,t), 25.0(C-11,t),28.0(C-17,t),31.0(C-15,t),39.1(C-8,d),42.0(C-7,t),50.0(CH3O-),82.0(C-2,d),97.0(C-6,s),131.0(C-10,t),133.0(C-9,t),138.0(C-4,s),141.0(C-5,d),165.0(C-1,s),172.0(C-3,s)。以上数据与文献报道基本一致，鉴定化合物12为(-)-Methyl(2Z,6R,8R,9E)- 3,6-epoxy -4,6,8-triethyl- 2,4,9-dodecatrienoate。
化合物PH-7:2′-脱氧腺嘌呤核苷
分子式：C10H13N5O3，分子量：215，白色粉末；10%H2SO4/EtOH显灰黄色；1HNMR(DMSO,600MHz)δ:8.15(1H,s,H-2),7.33(2H,s,5-NH2),8.35(1H,s,H-7),6.36(1H,dd,J=7.8,7.8Hz,H-1′),2.28,2.73(2H,m,H-2′),4.43(1H,m,H-3′),3.88(1H,dd,J=6.9,4.1Hz,H-4′),3.59(2H,dd,J=11.9,4.1Hz,H-5′),5.35(1H,brs,3′-OH),5.29(1H,brs,5′-OH)。以上数据与文献[6]报道基本一致，鉴定化合物PH-7为2′-脱氧腺嘌呤核苷。