本发明涉及新的双功能小分子及其药学上可接受的盐、水合物或前药的制备方法以及这些化合物和其药用组合物在治疗肿瘤，炎症，免疫等疾病中的应用。本发明涉及的双功能小分子是一种蛋白降解靶向联合体(protacs)，它们能够选择性诱导bet蛋白降解。本发明通过使用连接臂将bet蛋白小分子抑制剂和e3泛素连接酶复合体中cereblon蛋白配体连接获得双功能小分子。
背景技术：
：cereblon是由人类crbn基因编码的蛋白，crbn同源基因是高度保守的，这表明它在生理学中的重要性。cereblon与损伤dna结合蛋白1(ddb1)、cullin-4a(cul4a)以及cullin-1调节器(roc1)组成e3泛素连接酶复合体。该复合体能泛素化一系列蛋白，但具体机制尚不清楚。cereblon泛素化靶蛋白导致成纤维细胞生长因子8(fgf8)和成纤维细胞生长因子10(fgf10)增多，说明泛素化酶复合体对于胚胎肢体生长十分重要。泊马度胺用于治疗免疫疾病和肿瘤，包括多发性骨髓瘤。研究表明泊马度胺可以结合cereblon，从而引发转录因子lkaros(ikzf1)和aiolos(ikzf3)的泛素化和降解，这些转录因子对于多发性骨髓瘤的生长极其重要。在目前的多发性骨髓瘤的治疗中，高表达的cereblon与泊马度胺或类似药物的疗效密切相关。bet蛋白家族被认为是众多疾病尤其是癌症的潜在靶点，得到许多研究所和药企的关注。bet蛋白家族包括四个蛋白(brd2，brd3，brd4和brdt)，每个蛋白都包含两个独立的bromodomain结构域(bd1，bd2)用来识别组蛋白末端乙酰化的赖氨酸位点。bromodomain结构域是一个高度保守的由约110个氨基酸构成的蛋白质功能结构域，蛋白由四个α螺旋(z，a，b，c)和两个loop(za，bc)构成，能够形成疏水区域，识别并结合乙酰化的赖氨酸残基。brd4在调节基因转录过程中发挥重要作用，许多研究表明brd4被募集到靶基因的超增强子区域，促进c-myc，bcl-x1和bcl-6等致癌基因的转录。由于brd4在调节致癌基因转录中的关键作用，使其成为潜在的抗肿瘤靶点，利用bet抑制剂干扰brd4与靶基因结合，下调c-myc等致癌基因，达到抗肿瘤目的。近几年，bet抑制剂发展迅速，有14个抑制剂处于早期临床研究，例如ibet-762，otx-015，abbv-075，和cpi-0610等。虽然bet抑制剂在众多体外实验和动物模型中表现出很好的抗癌活性和耐受性，但是临床研究还是发现存在一些问题。otx-015的i期临床结果表明，当使用剂量高于每天80mg时，患者会出现严重的毒副作用：血小板减少，当剂量较低时，药物抗肿瘤效果不理想。最终，研究人员给出的合理用药方案是每天80mg，用药两周后需要停药一周。本发明中设计的双功能小分子可以对brd4蛋白进行泛素化标记，诱导蛋白降解，抗肿瘤效果优于bet抑制剂。抑制brd4蛋白往往需要将药物长期维持在较高的浓度，有可能造成严重的副作用；而诱导蛋白降解只需要少量的药物就可以，这个过程类似于催化反应，并不需要等摩尔量的药物，所以使用双功能小分子可以降低药物使用剂量，减轻毒副作用。技术实现要素：本发明的目的在于提供一些新的双功能小分子及其药学上可接受的盐、水合物或前药。这些化合物有诱导bet蛋白降解的功能，可用于制备新型抗肿瘤药物。所述肿瘤可为但不限于多发性骨髓瘤、胃癌、肺癌、乳腺癌、食管癌、结肠癌、髓母细胞瘤、急性粒细胞白血病、慢性白血病、前列腺癌、肝细胞瘤、肾细胞瘤、宫颈癌、皮肤癌、卵巢癌、结肠癌、神经胶质瘤、甲状腺癌或胰腺癌。本发明的目的还在于提供一种合成新的双功能小分子的制备方法。本发明的另一目的在于提供一种含有新的双功能小分子的药物制剂。详细
发明内容如下：为了实现上述目的，本发明提供了如下通式所示的双功能小分子或其药学上可接受的盐、水合物或前药：a-l-b其中：a是e3泛素连接酶复合体中cereblon蛋白的小分子配体，包含酰胺类化合物，邻苯二酰亚胺类化合物，沙利度胺或其衍生物，来那度胺或其衍生物，泊马度胺或其衍生物，部分配体结构通式如下所示：其中：w选自ch2、c＝o、so2、nh、n-烷基；x选自o、s；y选自nh、n-烷基、n-芳基、n-杂环、n-环烷基、o、s；z选自-烷基、-环烷基、-cl、-f；g、g’选自-h、-烷基、-oh、-ch2-杂环；q1、q2、q3、q4选自c、n、no。l是连接臂，包含非线性链、脂肪族链、芳香链、杂芳环结构链，通过共价键与a和b相连，部分连接臂结构如下通式所示：其中：n选自1-10之间的整数。b是bet蛋白抑制剂或其衍生物。本发明优选涉及如下通式(ia)所示的双功能小分子或其药学上可接受的盐、水合物或前药：其中：r1选自-h、-d、-ch3、-ch2f、chf2、-cf3、-ch2d、-chd2、-cd3、-ch2ch3、-ch2ch2ch3；r2、r3相同或不同，分别独立地选自-h、-d、-f、-cl、-br、-i、-no2、-cn、-nh2、-oh、-ch3、-ch2f、chf2、-cf3、-ch2d、-chd2、-cd3、-ch2ch3；n选自1-10之间的整数。本发明更优选涉及通式(ia)所示的双功能小分子或其药学上可接受的盐、水合物或前药：其中：r1选自-h、-ch3、-ch2ch3；r2、r3相同或不同，分别独立地选自-h、-f、-cl、-br、-ch3、-ch2f、chf2、-cf3、-ch2d、-chd2、-cd3；n选自1-6之间的整数。本发明的优选化合物包括，但不限于：2-(2-(4-((6-(3，5-二甲基异噁唑-4-基)-1-甲基-2-氧代-4-苯基-1，4-二氢喹唑啉-3(2h)-基)甲基)-1h-1，2，3-三氮唑-1-基)乙氧基)-n-(2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-1，3-二氧代异吲哚啉-4-基)乙酰胺；2-(2-(2-(4-((6-(3，5-二甲基异噁唑-4-基)-1-甲基-2-氧代-4-苯基-1，4-二氢喹唑啉-3(2h)-基)甲基)-1h-1，2，3-三氮唑-1-基)乙氧基)乙氧基)-n-(2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-1，3-二氧代异吲哚啉-4-基)乙酰胺；2-(2-(2-(2-(4-((6-(3，5-二甲基异噁唑-4-基)-1-甲基-2-氧代-4-苯基-二氢喹唑啉-3(2h)-基)甲基)-1h-1，2，3-三氮唑-1-基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-n-(2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-1，3-二氧代异吲哚啉-4-基)乙酰胺；2-(2-(2-(2-(2-(4-((6-(3，5-二甲基异噁唑-4-基)-1-甲基-2-氧代-4-苯基-二氢喹唑啉-3(2h)-基)甲基)-1h-1，2，3-三氮唑-1-基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-n-(2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-1，3-二氧代异吲哚啉-4-基)乙酰胺；部分化合物的结构为：通式(ia)所示的化合物可以含有不对称或手性中心，因此可以以不同立体异构形式存在。本发明化合物的所有立体异构形式，包括但不限于非対映异构体、対映异构体和阻转异构体以及他们的混合物(如外消旋物)，均包括在本发明的范围内。通式(ia)所示的化合物还可以以不同互变异构形式存在，所有这些形式均包括在本发明范围内。属于“互变异构体”或“互变异构形式”是指经由低能垒相互转化的不同能量的结构异构体。根据本发明，药学上可接受的盐包括与下列酸形成的加成盐：盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、苯磺酸、萘二磺酸、乙酸、丙酸、乳酸、三氟乙酸、马来酸、柠檬酸、富马酸、草酸、酒石酸、苯甲酸等。盐酸、氢溴酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸、磷酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、三氟乙酸、马来酸、苯磺酸、琥珀酸以及类似的已知可以接受的酸成盐。此外，本发明还包括本发明衍生物的前药。本发明衍生物的前药是通式(ia)的衍生物，它们自身可能具有较弱的活性甚至没有活性，但是在给药后，在生理条件下(例如通过代谢、溶剂分解或另外的方式)被转化成相应的生物活性形式。本发明可以含有上式(ia)的双功能小分子及其药学上可接受的盐、水合物作为活性成份，与药学上可接受的赋形剂混合制备成组合物，并制备成临床上可接受的剂型，上述赋形剂是指可用于药学领域的稀释剂、辅助剂或载体。上述剂型是指临床上常用的注射剂、片剂、胶囊剂等。本发明涉及的化合物或其药学上可接受的盐、水合物、前药可作为唯一的抗肿瘤药物单独使用，或者可以与现已上市的抗肿瘤药物联合使用，用于治疗预防肿瘤等。下文中提供的实施例和制备例进一步阐明和举例说明本发明化合物及其制备方法。应当理解，下述实例和制备例的范围并不以任何方式限制本发明的范围。通式(ia)的化合物制备方法，方法如下：步骤a：化合物i与对甲苯磺酰氯反应得到化合物ii；步骤b：化合物ii与叠氮钠反应得到化合物iii；步骤c：化合物iii与溴乙酸叔丁酯反应得到化合物iv；步骤d：化合物iv与三氟乙酸反应得到化合物v；步骤e：化合物v与二氯亚砜反应得到化合物vi；步骤f：化合物vi与泊马度胺或其衍生物反应得到化合物vii；步骤g：化合物viii与vii反应得到通式(ia)表示的化合物；其中，r1、r2、r3和n的定义如上所述。具体实施方式不需进一步详细说明，认为本领域熟练技术人员借助前面的描述，可以最大程度的利用本发明。因此，下面提供的实施例仅仅是进一步阐明本发明而已，并不意味着以任何方式限制本发明范围。原料可以从商业途径获得，或者通过本领域已知的方法制备，或根据本文所述方法制备。化合物的结构通过核磁共振(1h-nmr)和/或质谱(ms)来确定。nmr测定是用acf-300bruk型核磁共振仪，测定溶剂为氘代氯仿(cdcl3)或氘代二甲亚砜(dmso-d6)，tms为内标。ms的测定用hp1100型质谱仪。柱层析采用200-300目硅胶(青岛海洋化工厂生产)。实施例1：制备2-(2-(4-((6-(3，5-二甲基异噁唑-4-基)-1-甲基-2-氧代-4-苯基-1，4-二氢喹唑啉-3(2h)-基)甲基)-1h-1，2，3-三氮唑-1-基)乙氧基)-n-(2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-1，3-二氧代异吲哚啉-4-基)乙酰胺(i-1)，其结构式如下：步骤1)2-羟基乙基-4-甲基苯磺酸酯(1a)将乙二醇(3.91g，62.95mmol)溶于5ml吡啶中，分批加入对甲苯磺酰氯(6g，31.47mmol)，室温搅拌4小时后，加入6mol/l盐酸(40ml)，用乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗，收集有机层，无水硫酸钠干燥，减压蒸去有机溶剂，残留物通过硅胶柱色谱层析纯化，使用石油醚/乙酸乙酯(v/v＝20/1-10/1)洗脱得到无色液体，重2g，收率29.39％。1hnmr(300mhz，cdcl3)δ7.81(d，j＝8.3hz，2h)，7.36(d，j＝8.0hz，2h)，4.16-4.12(m，2h)，3.85-3.78(m，2h)，2.45(s，3h)，2.01(d，j＝19.0hz，1h)。步骤2)2-羟基乙基叠氮(1b)将1a(1.2g，5.55mmol)和叠氮化钠(0.72g，11.1mmol)溶于5ml丙酮和5ml水混合液中，加热回流16小时加入20ml水，用乙酸乙酯萃取，饱和碳酸钠水溶液洗，饱和食盐水洗，收集有机层，无水硫酸钠干燥，减压蒸去有机溶剂，得到无色液体，重0.41g，收率84.85％。1hnmr(300mhz，cdcl3)δ3.82-3.74(m，2h)，3.49-3.39(m，2h)，2.01(s，1h)。步骤3)2-叠氮乙氧基乙酸叔丁酯(1c)将1b(0.41g，4.71mmol)和溴乙酸叔丁酯(1.1g，5.65mmol)溶于15ml四氢呋喃中，在冰水浴中搅拌10分钟，分批加入氢化钠(0.38g，9.42mmol)，继续在冰水浴中反应0.5小时后，室温反应3小时，加入30ml水，用乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗，收集有机层，无水硫酸钠干燥，减压蒸去有机溶剂，残留物通过硅胶柱色谱层析纯化，使用石油醚/乙酸乙酯(v/v＝30/1-20/1)洗脱得到无色液体，重0.41g，收率43.28％。1hnmr(300mhz，cdcl3)δ4.06-4.00(m，2h)，3.76-3.70(m，2h)，3.48-3.41(m，2h)，1.49(d，j＝5.8hz，9h)。步骤4)2-叠氮乙氧基乙酸(1d)将1c(0.41g，2.04mmol)溶于4ml二氯甲烷中，加入1ml三氟乙酸，室温反应3小时后，减压蒸去有机溶剂，得到棕色液体，重0.29g。步骤5)2-叠氮乙氧基乙酰氯(1e)将1d(0.29g，2.03mmol)溶于4ml二氯甲烷中，加入1ml二氯亚砜，再加入2滴dmf催化，加热回流4小时后，减压蒸去有机溶剂，得到褐色液体，重0.33g。步骤6)2-(2-叠氮乙氧基)-n-(2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-1，3-二氧代异吲哚啉-4-基)乙酰胺(1f)将泊马度胺(0.26g，0.95mmol)溶于3mln-甲基吡咯烷酮中，加入1e(0.32g，1.9mmol)，室温反应4小时后，加入20ml水，有固体析出，抽滤，干燥得粗品，通过硅胶柱色谱层析纯化，使用二氯甲烷/甲醇(v/v＝150/1-100/1)洗脱得到黄色固体，重0.21g，收率55.13％。步骤7)2-(2-(4-((6-(3，5-二甲基异噁唑-4-基)-1-甲基-2-氧代-4-苯基-1，4-二氢喹唑啉-3(2h)-基)甲基)-1h-1，2，3-三氮唑-1-基)乙氧基)-n-(2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-1，3-二氧代异吲哚啉-4-基)乙酰胺(i-1)将6-(3，5-二甲基异噁唑-4-基)-1-甲基-4-苯基-3-(丙-2-炔-1-基)-3，4-二氢喹唑啉-2(1h)-酮(0.06g，0.161mmol)，1f(0.064g，0.161mmol)和五水合硫酸铜(0.008g，0.032mmol)溶于2ml二氯甲烷，2ml甲醇和2ml水混合液中，室温搅拌10分钟，加入抗坏血酸钠(0.013g，0.065mmol)，室温反应4小时后，加入20ml水，用二氯甲烷萃取，饱和食盐水洗，收集有机层，无水硫酸钠干燥，减压蒸去有机溶剂，残留物通过硅胶柱色谱层析纯化，使用二氯甲烷/甲醇(v/v＝100/1-30/1)洗脱得到黄色固体，重0.057g，收率45.72％。ms(esi，m/z)：794.05[m+na]+1hnmr(300mhz，cdcl3)δ10.44(d，j＝35.6hz，1h)，9.49-8.95(m，1h)，8.81(s，1h)，7.66(d，j＝36.2hz，3h)，7.36(d，j＝46.0hz，5h)，6.99(d，j＝40.8hz，3h)，5.33(s，2h)，5.03(s，1h)，4.72(s，2h)，4.11(s，6h)，3.43(s，3h)，2.90(s，4h)，2.28(s，5h)。实施例2：制备2-(2-(2-(4-((6-(3，5-二甲基异噁唑-4-基)-1-甲基-2-氧代-4-苯基-1，4-二氢喹唑啉-3(2h)-基)甲基)-1h-1，2，3-三氮唑-1-基)乙氧基)乙氧基)-n-(2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-1，3-二氧代异吲哚啉-4-基)乙酰胺(i-2)，其结构式如下：合成步骤同实施例1ms(esi，m/z)：838.05[m+na]+1hnmr(300mhz，cdcl3)δ10.44(d，j＝5.9hz，1h)，9.20(s，1h)，8.85(d，j＝8.2hz，1h)，7.77-7.66(m，2h)，7.57(d，j＝7.3hz，1h)，7.39-7.27(m，5h)，7.07(d，j＝8.4hz，1h)，6.90(d，j＝8.7hz，2h)，5.79(d，j＝11.5hz，1h)，5.10(s，1h)，4.98(s，1h)，4.50(s，2h)，4.19-3.84(m，6h)，3.75(s，4h)，3.41(s，3h)，2.86(d，j＝13.4hz，4h)，2.20(d，j＝41.5hz，9h)。实施例3：制备2-(2-(2-(2-(4-((6-(3，5-二甲基异噁唑-4-基)-1-甲基-2-氧代-4-苯基-二氢喹唑啉-3(2h)-基)甲基)-1h-1，2，3-三氮唑-1-基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-n-(2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-1，3-二氧代异吲哚啉-4-基)乙酰胺(i-3)，其结构式如下：合成步骤同实施例1ms(esi，m/z)：782.30[m+na]+1hnmr(300mhz，cdcl3)δ10.47(s，1h)，9.08(s，1h)，8.86(d，j＝8.3hz，1h)，8.08-7.53(m，3h)，7.31(d，j＝16.6hz，5h)，7.09(d，j＝7.7hz，1h)，6.93(d，j＝8.4hz，2h)，5.84(s，1h)，4.98(s，1h)，4.51(s，2h)，4.20(s，2h)，3.84-3.34(m，14h)，2.82(s，4h)，2.29(s，3h)，2.15(s，4h)。实施例4：制备2-(2-(2-(2-(2-(4-((6-(3，5-二甲基异噁唑-4-基)-1-甲基-2-氧代-4-苯基-二氢喹唑啉-3(2h)-基)甲基)-1h-1，2，3-三氮唑-1-基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-n-(2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-1，3-二氧代异吲哚啉-4-基)乙酰胺(i-4)，其结构式如下：合成步骤同实施例1ms(esi，m/z)：926.05[m+na]+1hnmr(300mhz，cdcl3)δ10.50(s，1h)，9.14(s，1h)，8.84(d，j＝8.4hz，1h)，7.93-7.67(m，2h)，7.57(d，j＝7.5hz，1h)，7.31(d，j＝22.5hz，5h)，7.07(d，j＝8.6hz，1h)，6.91(d，j＝8.4hz，2h)，5.80(s，1h)，5.18(s，1h)，4.98(s，1h)，4.49(s，2h)，4.18(s，2h)，3.82(d，j＝18.0hz，6h)，3.67(s，2h)，3.56(s，6h)，3.43(s，3h)，2.78(s，4h)，2.21(d，j＝41.5hz，7h)。实施例5：化合物的蛋白水平活性测定化合物与brd4蛋白n端第一个bromodomain结构域(以下称作brd4(bd1))的结合活性测试采用的是alphascreen检测技术。化合物初筛浓度为500nm。配制hepes缓冲液(50mmhepes，100mmnacl，0.1％bsa，0.05％chaps，ph7.5)用于制备brd4(bd1)蛋白、biotin标记的组蛋白h4、待测化合物(dmso0.1％)、donorbeads和acceptorbeads溶液。取384孔板一块，按照布置，板上分待测化合物孔、空白对照孔(min，max)、阳性药对照孔。向待测化合物孔和阳性药孔分别加入不同浓度的化合物溶液5μl，空白加入缓冲液5μl(dmso0.1％)。继续向除空白对照孔(min)外的各孔加入brd4(bd1)蛋白溶液5μl，向空白对照孔(min)加入缓冲液5μl。室温下孵育15分钟后，每孔加入biotin标记的组蛋白h4溶液5μl，继续在室温下孵育1小时后，加入donorbeads和acceptorbeads溶液15μl，避光室温孵育1小时后用enspire检测仪的alphamode(λex＝680，λem＝570)读取荧光数值。数值处理：抑制率＝(max-signal)/(max-min)×100％其中：max：biotin标记的组蛋白h4与蛋白完全结合的值min：biotin标记的组蛋白h4本底值signal：化合物相应浓度下的值以化合物浓度和相应的抑制率做s曲线。得到相应化合物的ic50。部分化合物的实验结果见表1：表1优选化合物对brd4(bd1)的抑制活性结果。实施例6：化合物细胞水平活性测定化合物细胞水平的活性检测采用celltiter-glo荧光细胞活力检测法。将处于对数生长期的hl60或mv4-11细胞接种至96孔培养板，培养过夜后，加入待测化合物37℃，5％co2孵育72h，结束后，检测前30分钟在室温下平衡测定试剂。每孔加入30ulcelltiter-glo试剂，摇晃96孔板10分钟诱导细胞裂解。将96孔板在室温下孵育2分钟来稳定荧光信号。使用envision检测仪来读取荧光数值。数值处理：抑制率＝(maxsignal-compoundsignal)/(maxsignal-minsignal)×100％其中：maxsignal：dmso作用中读取到的最大值minsignal：只有介质作用的最小值compoundsignal：化合物相应浓度下的值以化合物浓度和相应的抑制率做s曲线。得到相应化合物的ic50。部分化合物的实验结果见表2：表2优选化合物对hl-60细胞和mv4-11细胞抗增殖活性。化合物hl-60ic50(μm)mv4-11ic50(μm)i-1＜0.5＜0.5i-2＜0.5＜0.5i-3＜0.5＜0.5i-4＜1＜1实施例7：片剂用含有权利要求1中化合物(以实施例1化合物为例)10g，按照药剂学一般压片法加辅料20g混匀后，压制成100片，每片重300mg。实施例8：胶囊剂用含有权利要求1中化合物(以实施例1化合物为例)10g，按照药剂学胶囊剂的要求将辅料20g混匀后，装入空心胶囊，每个胶囊重300mg。实施例9：注射剂用含有权利要求1中化合物(以实施例1化合物为例)10g，按照药剂学常规方法，进行活性炭吸附，经0.65μm微孔滤膜过滤后，填入氮气罐制成水针制剂，每只装2ml，共灌装100瓶。尽管已经通过特定实施方案描述了本发明，但修改和等价变化对于精通此领域的技术人员而言是显见的，且它们都包含在本发明范围之内。当前第1页12