一种从土霉菌渣中提取蛋白质的方法与流程

本发明属于固体废弃物处理处置及资源回收领域，具体涉及一种用酸/热联合法破碎消化土霉素菌渣提取蛋白质的方法。

背景技术：

我国是世界上最大的抗生素原料药生产国与出口国，据统计，2013年抗生素产量达12.12万t，包括青霉素工业盐、头孢菌素、土霉素和链霉素等。即使按生产1t的抗生素产生菌渣8t计（实际可能超过此值），我国抗生素菌渣年产生也将达到100万t以上。

抗生素菌渣为生产抗生素提纯后剩余的发酵残渣，被列入2008年实施的《国家危险废物名录》，被禁止用做动物饲料、饲料添加剂和生产有机肥。但抗生素菌渣（干基）中有机质含量高达90%以上，具有较高生物质能，具有极大的资源潜力。如果不对抗生素菌渣中的有机质加以有效利用，这将与当前循环经济和科学发展的时代要求严重背离。2012年3月7日起实施的《制药工业污染防治技术政策》中提出了“鼓励开发发酵菌渣在生产工艺中的再利用技术、无害化处理技术、综合利用技术”的政策建议。

研究表明，抗生素菌渣内蛋白质含量约占干基的20%～60%。因此，对抗生素菌渣中蛋白质进行提取并加以合理应用，不仅使抗生素菌渣得到资源化处理，回收有用资源，而且也能有效达到抗生素菌渣的减量化要求，降低抗生素菌渣的处理规模和成本。目前，国内外对于抗生素菌渣蛋白质的提取还未见诸报道。

技术实现要素：

本发明的目的是实现对四环类抗生素—土霉素菌渣中的蛋白质提取。本发明采用酸-热联合工艺，将菌渣进行溶胞处理，使蛋白质溶出，从而实现蛋白质固体从菌渣中分离提纯，实现菌渣的资源化、减量化处理。

本发明的利用酸-热联合工艺提取土霉素菌渣中蛋白质的方法，包括以下步骤进行：

一、土霉素菌渣搅匀均质预处理：调节制药厂原菌渣（含水率≤60～80）的含水率为90wt%～99wt%，放入打浆机中搅拌5～10分钟，进行搅匀均质预处理；

二、酸-热联合处理土霉素菌渣：调节预处理后菌渣溶液的pH至1～3，搅拌均匀后放入恒温反应器，调节反应温度至80℃～120℃，反应时间2h～6h，使菌渣细胞破碎、蛋白质溶出；

三、溶解性蛋白质提取液分离：将酸-热联合处理后菌渣溶液静沉冷却至室温，然后放入离心机进行固液离心分离，调节离心机转速为3500r/min～4500r/min，控制离心时间为5～30min，将离心管中的蛋白质提取液与剩余残渣离心分离，最后得到溶解性蛋白质提取液；

四、等电点法沉淀蛋白质：将离心分离得到的溶解性蛋白质提取液进行pH调节，利用等电点法沉淀提纯蛋白质，调节蛋白质提取液pH至5～7，反应沉淀时间5～10分钟；

五、蛋白质的分离：将沉淀后蛋白质提取液放入离心机进行固体蛋白质提纯分离，控制离心机转速3500r/min～4500r/min，控制离心时间为5～30min，将离心管中的白色胶体物质与上清液分离，将白色胶体物质在50℃～60℃下干燥1～2d，得蛋白质。

优选地，步骤一中土霉素菌渣的含水率为92-96wt%，放入打浆机中搅拌8分钟。

优选地，步骤二中调节预处理后菌渣溶液的pH至2，调节反应温度至120℃，反应时间2h。

优选地，步骤四中调节溶解性蛋白质提取液pH为6。

优选地，离心机转速均为4000r/min，离心时间均为20min。

本发明的优点和有益效果：

1、采用本发明方法从土霉素菌渣中提取蛋白质具有能耗低、费用低、操作方便、时间短暂等特点；当处理条件为含水率为94%、反应pH为2.0、反应温度为80℃、反应时间为2h时，菌渣中蛋白质溶出浓度为6376.93mg/L；等电点沉淀蛋白质时，当pH=6.0，蛋白质沉淀效率最大为92.73%。2、本方法考虑到土霉素菌渣本身pH值<2～4的固有性质，同时考虑到传统热处理工工艺的成熟应用，采用酸-热联合法进行土霉素菌渣的预处理和蛋白质提取，设备简单易操作，且用药量少，处理成本低。

3、本发明方法适用于土霉素菌渣蛋白质的提取，利用该方法提取蛋白质可大幅降低菌渣中悬浮物质的含量，降低菌渣固体物质的量，有利于土霉素菌渣的资源化、减量化处理处置。

附图说明

图1 酸-热联合法提取土霉素菌渣中蛋白质流程示意图。

图2不同pH条件下蛋白质沉淀率。

具体实施方式

实施例1土霉素菌渣搅匀均质预处理和酸-热联合处理

土霉素菌渣土霉素菌渣搅匀均质预处理：调节制药厂原菌渣（含水率≤60～80）的含水率为90wt%～99wt%，放入打浆机中搅拌8分钟，进行搅匀均质预处理；

酸-热联合处理土霉素菌渣：调节预处理后菌渣溶液的pH至1～3，搅拌均匀后放入恒温反应器，调节反应温度至80℃～120℃，反应时间2h～6h，使菌渣细胞破碎、蛋白质溶出。

蛋白质溶液的提取与检测：将酸-热联合处理后菌渣混合液放入离心机中，调节离心机转速为4000r/min，控制离心时间为10min，将离心管中的蛋白质提取液与剩余残渣离心分离，最后得到溶解性蛋白质提取液。

蛋白质提取液中蛋白质浓度的测定：采用考马斯亮蓝法进行溶液中蛋白质浓度测定。具体反应条件和反应结果如表1所示。

表1 反应时间和反应结果

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实施例2溶解性蛋白质提取液分离

溶解性蛋白质提取液分离：将酸-热联合处理后菌渣溶液静沉冷却至室温，然后放入离心机进行固液离心分离，调节离心机转速为4000r/min，控制离心时间为20min，将离心管中的蛋白质提取液与剩余残渣离心分离，最后得到溶解性蛋白质提取液。实验中离心机转速与离心时间，可在权利要求范围内自行调节，不同的离心条件下，实验结果基本一致。

实施例3等电点法沉淀蛋白质和蛋白质的分离

当处理条件为含水率为94%、反应pH为2.0、反应温度为120℃、反应时间为2h时，菌渣中蛋白质溶出浓度为6376.93mg/L，利用等电点法进行蛋白质沉淀分离。

等电点法沉淀蛋白质：将离心分离得到的溶解性蛋白质提取液进行pH调节，利用等电点法沉淀提纯蛋白质，用1mol/LNaOH溶液调节离心上清液pH值至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，反应沉淀时间8分钟；

蛋白质的分离：将沉淀后蛋白质提取液放入离心机进行固体蛋白质提纯分离，控制离心机转速4000r/min，控制离心时间为18min，将离心管中的白色胶体物质与上清液分离，测定二次上清液的蛋白质浓度，通过计算得各pH下的蛋白质沉淀率，实验结果如图2所示，将白色胶体物质在55℃下干燥1.5d，得蛋白质。

由图2易得，随着pH的增大，蛋白质沉淀效率先上升再下降，当pH为6.0时，蛋白质沉淀效率最大为92.73%。通过调节溶液的pH，可以改变溶液的电荷性质，使蛋白质表面的双电层与水化膜受到破坏，引起蛋白质分子间引力增大，从而造成蛋白质在溶液中溶解度下降，导致蛋白质沉淀析出。