本发明涉及基因工程及分子生物学领域，更具体地说，涉及一种基因检测引物组、试剂盒及检测方法。
背景技术：
华法林（warfarin）是香豆素类口服抗凝血药，目前被广泛应用于多种疾病的抗凝以及预防和治疗血栓栓塞中，但是因为华法林的有效血药浓度范围狭窄，剂量偏小会降低治疗血栓形成的效果，剂量偏大则会增大出血的风险，甚至引发大出血等副作用。已知与华法林的药效学和药动学相关的基因达30余种，细胞色素2c9(cyp2c9)和微生物k环氧化物还原酶复合物（vkorc1）基因的多态性是影响华法林用量个体差异最主要的遗传因素。通过对患者的基因cyp2c9、vkorc1进行检测，得到特定位点的基因型，以基因检测结果作为中间结果的信息的方法，不属于疾病的诊断方法；以基因型的检测结果来确定华法林需求的维持剂量，就可以实现个体化用药，既可避免剂量不够造成血栓，又可防止剂量过大引起出血并发症。
目前常用的cyp2c9基因和vkorc1基因突变检测方法主要有taqman荧光探针法。但taqman荧光探针法灵敏度低、假阳性率高、耗时较长，通量小。
因此，需要一种新的检测cyp2c9基因和vkorc1基因突变的试剂盒及检测方法，使得对cyp2c9基因和vkorc1基因突变的检测灵敏度高、假阳性率低，且检测周期短，通量高。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种cyp2c9基因检测引物组、试剂盒及检测方法，旨在解决现有技术中cyp2c9基因检测灵敏度低、假阳性率高、周期长，通量小的技术问题。
本发明的一个目的在于提供一种基因检测引物组，用于对含待测位点的核酸片段进行特异性扩增，所述待测位点包括cyp2c9基因上的rs1799853位点、rs1057910位点，以及vkorc1基因上的rs9923231位点中的至少一种，所述引物组包括rs1799853引物组、rs1057910引物组以及rs9923231引物组中的至少一种；
所述rs1799853引物组用于特异性扩增含rs1799853位点的核酸片段，包括rs1799853上游引物seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3或seqidno:4，以及rs1799853下游引物seqidno:5、seqidno:6、seqidno:7或seqidno:8；
所述rs1057910引物组用于特异性扩增含rs1057910位点的核酸片段，包括rs1057910上游引物seqidno:9、seqidno:10、seqidno:11或seqidno:12，以及rs1057910下游引物seqidno:13、seqidno:14、seqidno:15或seqidno:16；
所述rs9923231引物组用于特异性扩增含rs9923231位点的核酸片段，包括rs9923231上游引物seqidno:17、seqidno:18、seqidno:19或seqidno:20，以及rs9923231下游引物seqidno:21、seqidno:22、seqidno:23或seqidno:24。
本发明的第二个目的在于提供一种基因检测引物组，用于对含待测位点的核酸片段进行特异性扩增，所述待测位点包括cyp2c9基因上的rs1799853位点、rs1057910位点，以及vkorc1基因上的rs9923231位点中的至少一种，所述引物组包括rs1799853引物组、rs1057910引物组以及rs9923231引物组中的至少一种；
所述rs1799853引物组包括第一rs1799853引物组和第二rs1799853引物组，所述第一rs1799853引物组包括第一rs1799853上游引物seqidno:1或seqidno:2，以及第一rs1799853下游引物seqidno:5或seqidno:6；所述第二rs1799853引物组包括第二rs1799853上游引物seqidno:3或seqidno:4，以及第二rs1799853下游引物seqidno:7或seqidno:8；
所述rs1057910引物组包括第一rs1057910引物组和第二rs1057910引物组，所述第一rs1057910引物组包括第一rs1057910上游引物seqidno:9或seqidno:10，以及第一rs1057910下游引物seqidno:13或seqidno:14；所述第二rs1057910引物组包括第二rs1057910上游引物seqidno:11或seqidno:12，以及第二rs1057910下游引物seqidno:15或seqidno:16；
所述rs9923231引物组包括第一rs9923231引物组和第二rs9923231引物组，所述第一rs9923231引物组包括第一rs9923231上游引物seqidno:17或seqidno:18，以及第一rs9923231下游引物seqidno:21或seqidno:22；所述第二rs9923231引物组包括第二rs9923231上游引物seqidno:19或seqidno:20，以及第二rs9923231下游引物seqidno:23或seqidno:24。
本发明的第三个目的在于提供一种基因检测试剂盒，所述试剂盒包括上述任一种基因检测引物组。
优选的，所述试剂盒还包括含有标签序列的接头，所述接头由seqidno:25和seqidno:26组成，用于与含rs1799853位点、rs1057910位点或rs9923231位点的扩增产物连接。
优选的，所述试剂盒还包括测序引物，所述测序引物包括对含rs1799853位点的文库分子进行测序的rs1799853测序引物seqidno:27、对含rs1057910位点的文库分子进行测序的rs1057910测序引物seqidno:28、以及对含rs9923231位点的文库分子进行测序的rs9923231测序引物seqidno:29中的至少一种。
本发明的第四个目的在于提供一种基因检测方法，包括以下步骤：
a、利用引物组，分别对含待测位点的样本进行扩增，得扩增产物；所述引物组包括rs1799853引物组、rs1057910引物组以及rs9923231引物组中的至少一种；
所述rs1799853引物组用于特异性扩增含rs1799853位点的核酸片段，包括rs1799853上游引物seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3或seqidno:4，以及rs1799853下游引物seqidno:5、seqidno:6、seqidno:7或seqidno:8；
所述rs1057910引物组用于特异性扩增含rs1057910位点的核酸片段，包括rs1057910上游引物seqidno:9、seqidno:10、seqidno:11或seqidno:12，以及rs1057910下游引物seqidno:13、seqidno:14、seqidno:15或seqidno:16；
所述rs9923231引物组用于特异性扩增含rs9923231位点的核酸片段，包括rs9923231上游引物seqidno:17、seqidno:18、seqidno:19或seqidno:20，以及rs9923231下游引物seqidno:21、seqidno:22、seqidno:23或seqidno:24；
b、在所述扩增产物上连接接头，得到文库分子；
c、采用第二代高通量基因测序技术对所述文库分子进行测序，确定待测位点的基因型。
优选的，所述步骤a包括以下步骤：
a1、采用第一rs1799853引物组扩增cyp2c9基因2号等位基因区域，得第一rs1799853扩增产物；采用第一rs1057910引物组扩增cyp2c9基因3号等位基因区域，得第一rs1057910扩增产物；采用第一rs9923231引物组扩增vkorc1基因启动子区域，得第一rs9923231扩增产物；
所述第一rs1799853引物组包括第一rs1799853上游引物seqidno:1或seqidno:2，以及第一rs1799853下游引物seqidno:5或seqidno:6；所述第一rs1057910引物组包括第一rs1057910上游引物seqidno:9或seqidno:10，以及第一rs1057910下游引物seqidno:13或seqidno:14；所述第一rs9923231引物组包括第一rs9923231上游引物seqidno:17或seqidno:18，以及第一rs9923231下游引物seqidno:21或seqidno:22；
a2、采用第二rs1799853引物组对第一rs1799853扩增产物进行扩增，得第二rs1799853扩增产物；采用第二rs1057910引物组对第一rs1057910扩增产物为进行扩增，得第二rs1057910扩增产物；采用第二rs9923231引物组扩增第一rs9923231扩增产物，得第二rs9923231扩增产物；
所述第二rs1799853引物组包括第二rs1799853上游引物seqidno:3或seqidno:4，以及第二rs1799853下游引物seqidno:7或seqidno:8；所述第二rs1057910引物组包括第二rs1057910上游引物seqidno:11或seqidno:12，以及第二rs1057910下游引物seqidno:15或seqidno:16；所述第二rs9923231引物组包括第二rs9923231上游引物seqidno:19或seqidno:20，以及第二rs9923231下游引物seqidno:23或seqidno:24。
优选的，所述步骤b中还包括对第二rs1799853扩增产物、第二rs1057910扩增产物或第二rs9923231扩增产物上的尿嘧啶进行特异性切割的步骤，所述第二rs1799853扩增产物、第二rs1057910扩增产物或第二rs9923231扩增产物经切割分别形成第一粘性末端。
优选的，所述接头由seqidno:25和seqidno:26组成，用于与含rs1799853位点、rs1057910位点或rs9923231位点的扩增产物连接。
优选的，步骤c中用于对含rs1799853位点的文库分子进行测序的rs1799853测序引物为seqidno:27；对含rs1057910位点的文库分子进行测序的rs1057910测序引物为seqidno:28；对含rs9923231位点的文库分子进行测序的rs9923231测序引物为seqidno:29。
本发明提供的基因检测引物组，能够对含待测位点的片段进行特异性扩增，降低了扩增多个靶位点的可能性，提高了对待测位点扩增的特异性和灵敏度，降低了假阳性率；同时，采用第二代高通量基因测序技术，使得对待测位点的检测周期短，通量高。
附图说明
图1为第五实施例中各文库分子的page胶电泳图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。
本发明提出第一实施例，一种基因检测引物组，包括用于对含待测位点的核酸片段进行特异性扩增的引物组，所述待测位点包括cyp2c9基因上的rs1799853位点、rs1057910位点以及vkorc1基因上的rs9923231位点中的至少一种，所述引物组包括rs1799853引物组、rs1057910引物组以及rs9923231引物组中的至少一种；
所述rs1799853引物组用于特异性扩增含rs1799853位点的核酸片段，包括rs1799853上游引物seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3或seqidno:4，以及rs1799853下游引物seqidno:5、seqidno:6、seqidno:7或seqidno:8；
所述rs1057910引物组用于特异性扩增含rs1057910位点的核酸片段，包括rs1057910上游引物seqidno:9、seqidno:10、seqidno:11或seqidno:12，以及rs1057910下游引物seqidno:13、seqidno:14、seqidno:15或seqidno:16；
所述rs9923231引物组用于特异性扩增含rs9923231位点的核酸片段，包括rs9923231上游引物seqidno:17、seqidno:18、seqidno:19或seqidno:20，以及rs9923231下游引物seqidno:21、seqidno:22、seqidno:23或seqidno:24。
本方案提供的基因检测引物组，能够特异性扩增含待测位点的核酸片段，降低了扩增非目的片段的可能性，从而使得对待测位点检测的灵敏度高，假阳性率低。
本发明提出第二实施例，一种基因检测引物组，包括用于对含待测位点的核酸片段进行特异性扩增的引物组，所述待测位点包括cyp2c9基因上的rs1799853位点、rs1057910位点以及vkorc1基因上的rs9923231位点中的至少一种，所述引物组包括rs1799853引物组、rs1057910引物组以及rs9923231引物组中的至少一种；
所述rs1799853引物组包括第一rs1799853引物组和第二rs1799853引物组，所述第一rs1799853引物组包括第一rs1799853上游引物seqidno:1或seqidno:2，以及第一rs1799853下游引物seqidno:5或seqidno:6；所述第二rs1799853引物组包括第二rs1799853上游引物seqidno:3或seqidno:4，以及第二rs1799853下游引物seqidno:7或seqidno:8；
所述rs1057910引物组包括第一rs1057910引物组和第二rs1057910引物组，所述第一rs1057910引物组包括第一rs1057910上游引物seqidno:9或seqidno:10，以及第一rs1057910下游引物seqidno:13或seqidno:14；所述第二rs1057910引物组包括第二rs1057910上游引物seqidno:11或seqidno:12，以及第二rs1057910下游引物seqidno:15或seqidno:16；
所述rs9923231引物组包括第一rs9923231引物组和第二rs9923231引物组，所述第一rs9923231引物组包括第一rs9923231上游引物seqidno:17或seqidno:18，以及第一rs9923231下游引物seqidno:21或seqidno:22；所述第二rs9923231引物组包括第二rs9923231上游引物seqidno:19或seqidno:20，以及第二rs9923231下游引物seqidno:23或seqidno:24。
采用本方案提供的两组基因检测引物组对含待测位点的核酸片段进行两轮巢式扩增，由于同时与两组引物组都互补的序列很少，从而降低了非特异性扩增的可能性，增加了对待测位点检测的敏感度。本方案中，seqidno:7、seqidno:8、seqidno:11、seqidno:12、seqidno:19、seqidno:20中均含有cggu序列，采用本方案的基因检测引物组对含待测位点的核酸片段进行扩增，得到的扩增产物上也包含cggu序列，在后续的测序过程中，采用特异性切割尿嘧啶的酶对扩增产物进行切割，在扩增产物上可以形成粘性末端，该粘性末端在后续过程中与接头的连接效率更高。
本发明提出第三实施例，一种基因检测试剂盒，含有上述任一种基因检测引物组。
本发明的试剂盒，能够特异性扩增含待测位点的核酸片段，降低了扩增非目的片段的可能性，从而使得对待测位点进行检测的灵敏度高，假阳性率低。
优选的，所述基因检测试剂盒还包括含有标签序列的接头，所述接头由seqidno:25和seqidno:26组成，用于直接与所述含待测位点的扩增产物连接。所述接头中的nnnn为标签序列，所述n为a、g、c或t。
本发明的接头可以采用多种形式，包括但不限于平末端接头、突出末端接头。
优选的，所述接头为突出末端接头，所述突出末端与所述扩增产物经特异性切割尿嘧啶的酶切割后形成的粘性末端完全互补配对，本方案使得扩增产物与接头之间的连接效率更高。
优选的，所述接头上含有生物素标记，用于使其固定在含亲和素的磁珠上。
优选的，所述seqidno:25的5’末端上含有生物素标记，且生物素标记被预先固定在含链霉亲和素或亲和素的磁珠上。利用该生物素标记，可以在连接反应结束后，很方便的将含待测位点和接头的核酸片段分离出来。
需要说明的是，本发明提供的试剂盒，对不同待测位点的扩增步骤是分开进行的，对多个含不同待测位点的扩增产物可以混合在一起同时进行测序。当采用本发明的试剂盒在同一体系中对同一样本的rs1799853位点、rs1057910位点和rs9923231位点中的至少两个同时进行检测时，与含各待测位点的扩增产物连接的接头，其上的标签序列可以相同，也可以不同。当接头上的标签序列不同时，可以通过对接头标签序列的检测来区分待测位点，当接头上的标签序列相同时，可以通过所使用的测序引物的不同来区分待测位点。
当采用本发明的试剂盒对在同一体系中对不同样本的同一待测位点进行检测时，由于在测序过程中使用的测序引物是相同的，因此需要采用含不同标签序列的接头分别连接不同的样本，通过对标签序列进行测序，从而无需对样本进行多次测序即可有效区分不同样本的测序结果。
所述测序引物包括对含rs1799853位点的文库分子进行测序的rs1799853测序引物seqidno:27、对含rs1057910位点的文库分子进行测序的rs1057910测序引物seqidno:28、对含rs9923231位点的文库分子进行测序的rs9923231测序引物seqidno:29。本方案设计的测序引物，在测序过程中连接在待测位点附近区域，使得在测序过程中，仅需较少次数的测序即可确定待测位点的基因型。
优选的，所述测序引物的5’末端经磷酸化修饰。本方案的测序引物适用于采用连接测序法对待测位点进行检测，本方案使得测序探针可连接在测序引物的5’末端。
优选的，所述试剂盒还包括连接酶。在连接酶的作用下，所述扩增产物和接头之间能够稳定的连接。
优选的，所述试剂盒还包括连接缓冲液。
本发明提出第四实施例，一种基因检测方法，包括以下步骤：
a、利用引物组，分别对含待测位点的样本进行扩增，得扩增产物；所述引物组包括rs1799853引物组、rs1057910引物组以及rs9923231引物组中的至少一种；
所述rs1799853引物组用于特异性扩增含rs1799853位点的核酸片段，包括rs1799853上游引物seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3或seqidno:4，以及rs1799853下游引物seqidno:5、seqidno:6、seqidno:7或seqidno:8；
所述rs1057910引物组用于特异性扩增含rs1057910位点的核酸片段，包括rs1057910上游引物seqidno:9、seqidno:10、seqidno:11或seqidno:12，以及rs1057910下游引物seqidno:13、seqidno:14、seqidno:15或seqidno:16；
所述rs9923231引物组用于特异性扩增含rs9923231位点的核酸片段，包括rs9923231上游引物seqidno:17、seqidno:18、seqidno:19或seqidno:20，以及rs9923231下游引物seqidno:21、seqidno:22、seqidno:23或seqidno:24；
b、在所述扩增产物上连接接头，得到文库分子；
c、采用第二代高通量基因测序技术对所述文库分子进行测序，确定待测位点的基因型。
本发明提供的基因检测方法，采用对待测位点进行特异性扩增的引物组扩增含待测位点的核酸片段，提高了对待测位点检测的灵敏度，降低检测的假阳性率。
优选的，所述步骤a包括以下步骤：
a1、采用第一rs1799853引物组扩增cyp2c9基因2号等位基因区域，得第一rs1799853扩增产物；采用第一rs1057910引物组扩增cyp2c9基因3号等位基因区域，得第一rs1057910扩增产物；采用第一rs9923231引物组扩增vkorc1基因启动子区域，得第一rs9923231扩增产物；
所述第一rs1799853引物组包括第一rs1799853上游引物seqidno:1或seqidno:2，以及第一rs1799853下游引物seqidno:5或seqidno:6；所述第一rs1057910引物组包括第一rs1057910上游引物seqidno:9或seqidno:10，以及第一rs1057910下游引物seqidno:13或seqidno:14；所述第一rs9923231引物组包括第一rs9923231上游引物seqidno:17或seqidno:18，以及第一rs9923231下游引物seqidno:21或seqidno:22；
a2、采用第二rs1799853引物组对第一rs1799853扩增产物进行扩增，得第二rs1799853扩增产物；采用第二rs1057910引物组对第一rs1057910扩增产物为进行扩增，得第二rs1057910扩增产物；采用第二rs9923231引物组扩增第一rs9923231扩增产物，得第二rs9923231扩增产物；
所述第二rs1799853引物组包括第二rs1799853上游引物seqidno:3或seqidno:4，以及第二rs1799853下游引物seqidno:7或seqidno:8；所述第二rs1057910引物组包括第二rs1057910上游引物seqidno:11或seqidno:12，以及第二rs1057910下游引物seqidno:15或seqidno:16；所述第二rs9923231引物组包括第二rs9923231上游引物seqidno:19或seqidno:20，以及第二rs9923231下游引物seqidno:23或seqidno:24。
本方案通过设计两对pcr扩增引物组，对含待测位点的核酸片段进行两轮特异性扩增，能够有效确保第二扩增产物中没有因引物配对特异性不强造成的非特异性扩增的污染，降低了扩增多个靶位点的可能性，增加了扩增的特异性和灵敏度。
优选的，所述步骤b中还包括对第二rs1799853扩增产物、第二rs1057910扩增产物或第二rs9923231扩增产物上的尿嘧啶进行特异性切割的步骤，所述第二rs1799853扩增产物、第二rs1057910扩增产物或第二rs9923231扩增产物经切割形成第一粘性末端。由于seqidno:7、seqidno:8、seqidno:11、seqidno:12、seqidno:19、seqidno:20中均含有cggu片段，通过pcr扩增得到第二扩增产物后，特异性切割尿嘧啶的酶切割第二扩增产物g和u之间的磷酸二酯键，形成5’末端含有磷酸基团的第一粘性末端，该第一粘性末端有利于在后续反应过程中连接接头。
优选的，所述接头含有第二粘性末端，所述第二粘性末端与扩增产物的第一粘性末端完全互补配对。接头通过第二粘性末端与扩增产物的第一粘性末端互补配对连接，提高了连接效率。
优选的，所述接头与第二粘性末端相对的末端上含有生物素标记，且被预先固定在含链霉亲和素或亲和素的磁珠上。利用该生物素标记，可以在步骤b结束后，很方便的将含待测位点和接头的核酸片段分离出来。
优选的，所述接头由seqidno:25和seqidno:26组成，用于直接与所述含待测位点的扩增产物连接。所述接头中的nnnn为标签序列，所述n为a、g、c或t。
需要说明的是，本发明检测方法，对不同待测位点的扩增步骤是分开进行的，对多个含不同待测位点的扩增产物可以混合在一起同时进行测序。当采用本发明的试剂盒在同一体系中对同一样本的rs1799853位点、rs1057910位点和rs9923231位点中的至少两个同时进行检测时，与含各待测位点的扩增产物连接的接头，其上的标签序列可以相同，也可以不同。当接头上的标签序列不同时，可以通过对接头标签序列的检测来区分待测位点，当接头上的标签序列相同时，可以通过所使用的测序引物的不同来区分待测位点。
当采用本发明的试剂盒对在同一体系中对不同样本的同一待测位点进行检测时，由于在测序过程中使用的测序引物是相同的，因此需要采用含不同标签序列的接头分别连接不同的样本，通过对标签序列进行测序，从而无需对样本进行多次测序即可有效区分不同样本的测序结果。
需要说明的是，当对不同待测位点进行扩增时，第一轮巢式扩增可以分开进行，也可以在同一体系中进行；第二轮巢式扩增分开进行。本方案可以通过第二轮巢式引物区分样品。
当对不同的待测位点进行扩增时，第一轮和第二轮巢式扩增均需分开进行。
优选的，所述第二代高通量基因测序技术包括但不仅限于连接测序法或合成测序法。
优选的，步骤c中对含rs1799853位点的文库分子进行测序的rs1799853测序引物为seqidno:27；对含rs1057910位点的文库分子进行测序的rs1057910测序引物为seqidno:28；对含rs9923231位点的文库分子进行测序的rs9923231测序引物为seqidno:29。本方案设计的测序引物，在测序过程中连接在待测位点附近区域，使得在测序过程中，仅需较少次数的测序即可确定待测位点的基因型。
优选的，所述测序引物的5’末端经磷酸化修饰。本方案的测序引物尤其适用于采用连接测序法，在测序过程中，测序探针连接在该测序引物5’末端。
本发明提供了第五实施例，一种基因检测方法，以人类全血基因组样本为模板，按以下步骤建立反应体系：
a1、分别配制一个扩增反应体系，向其中加入第一上游引物组，同时对cyp2c9基因2号等位基因区域、3号等位基因区域和vkorc1基因启动子区域进行扩增。扩增反应体系按以下配比配制：50ng/μl的人类全血dna分子1.0μl；2×longtaqmix（深圳华因康基因科技有限公司生产）10μl；10μm的第一引物组各0.8μl；6.6μl去离子水；混匀并离心。然后将离心管置于pcr仪中，设置反应程序：95℃条件下持续10分钟；95℃条件下持续20秒，57℃条件下持续20秒，72℃条件下持续20秒，一共30个循环；72℃条件下持续5分钟；pcr反应完成后，得到第一扩增产物。其中，第一上游引物包括用于特异性扩增cyp2c9基因2号等位基因区域的第一rs1799853引物组为seqidno:1和seqidno:5；用于特异性扩增cyp2c9基因3号等位基因区域的第一rs1057910引物组为seqidno:9和seqidno:13；用于特异性扩增vkorc1基因启动子区域的第一rs9923231引物组为seqidno:17和seqidno:21；
a2、分别配制一个扩增第一rs1799853扩增产物、一个扩增第一rs1057910产物，一个扩增第一rs9923231扩增产物共3个pcr扩增反应体系；按以下配比配制各反应体系：稀释100倍的第一扩增产物1.0μl；2×longtaqmix10μl；10μm的第二引物组0.8μl；8.2μl去离子水；混匀并离心。将离心管置于pcr仪中，设置反应程序：94℃条件下持续5分钟；94℃条件下持续20秒，57℃条件下持续20秒，72℃条件下持续20秒，一共30个循环；72℃条件下持续5分钟；pcr反应完成后，得第二扩增产物。其中，用于特异性扩增包含rs1799853位点的核酸片段的第二rs1799853引物组为seqidno:3和seqidno:7；用于特异性扩增包含rs1057910位点的核酸片段的第二rs1057910引物组为seqidno:11和seqidno:15；用于特异性扩增包含rs9923231位点的核酸片段的第二rs9923231引物组为seqidno:19和seqidno:23。
b、针对上述第二扩增产物，分别配制切割-连接反应体系如下：第二扩增产物20μl，t4连接酶缓冲液8μl，t4dna连接酶1μl，user酶2μl，0.2μmol/ml的预先固定在磁珠上的f接头1μl。上述反应体系在25℃条件下反应10分钟，反应完成后，将离心管置于磁力架上，分离去除上清，加入0.1nnaoh洗涤1次，加入50μl的te缓冲液反复清洗2次，得到吸附在磁珠上的含有接头以及待检测位点的核酸片段的文库分子。其中，本实施例中各切割-连接反应体系中的接头由seqidno:25和seqidno:26组成，其中标签序列不同。
如图1所示，对含接头和待测位点的文库分子进行page胶电泳图检测，图中泳道0为分子大小标记物，泳道1、2为含rs1057910位点的文库分子，泳道3、4为含rs1799853位点的文库分子，泳道5、6为含rs9923231位点的文库分子。其分别在172bp、88bp、185bp附近出现目标条带，与理论预期文库分子大小完全相符，说明本发明的扩增引物组可以很好的扩增含待测位点的核酸片段。
c、将步骤b得到的文库分子，点样至异硫氰基修饰的载样片上，于45℃固定1h。采用深圳华因康基因科技有限公司的高通量基因测序仪pstarⅱa，以连接测序法进行测序，确定rs1799853位点为c，为野生型；rs1057910位点为a，为野生型；rs9923231位点为a，为突变型。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
sequencelisting
<110>广州康昕瑞基因健康科技有限公司
<120>基因检测引物组、试剂盒及检测方法
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