本发明属于生物检测领域，具体涉及一种抗人载脂蛋白a1(apoa1)鼠源单克隆抗体d11-10及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株，以及利用该单克隆抗体在临床检测人外周血中apoa1蛋白的含量以预测发生心脑血管疾病的风险及其对该疾病的诊断。
背景技术：
载脂蛋白a1(apoa1)是高密度脂蛋白(hdl)的主要结构蛋白，其生理作用在于能帮助hdl捕获游离胆固醇。此外，apoa1还有稳定环前列腺素，促进血管舒张并抑制血小板凝聚，抵抗血管斑块形成等作用。
传统上，临床使用hdl-c和apoa1蛋白的检测来反映体内hdl代谢的水平。血清/血浆中apoa1和hdl-c水平的降低，提示心脑血管疾病(chd、脑卒中等)的危险性增加，是心脑血管疾病危险性评价的灵敏指标之一。
然而目前有研究显示，在超过13万chd患者中，逾4成患者的hdl-c水平处于正常范围，所以hdl-c并不能完全有效地反映疾病风险。贝特类、烟酸和胆甾醇酯转运蛋白(cetp)阻滞剂等提升hdl-c水平的药物都不能减少终点事件(全因或chd引起的死亡率)，且无法降低卒中风险率，进一步提示hdl-c不能真实反应体内hdl的代谢情况。hdl由新生到成熟，再到被肝脏回收降解是一系列复杂的动态过程。通过超速离心和双向电泳的方法可以将体内代谢过程中的hdl分为不同的亚型，临床相关性研究显示hdl的亚型变化较hdl-c更能反应与心脑血管疾病的相关性。因此，监测体内特定的与疾病相关的功能性hdl亚型显得尤为重要。
目前实验室采用的hdl亚型分离和鉴定方法操作难度大、技术要求高、实验时间长，难于满足临床快速、高通量的检测要求，不适合临床应用。虽然检测血清中hdl的主要蛋白成分apoa1，在一定程度能够反映体内hdl的代谢状态。但是，检测方法大多是基于apoa1多克隆抗体的免疫学法，不能检测到hdl亚型的变化。因此，开发一种全新的、既能满足临床快速和高通量要求，又能检测与心脑血管疾病相关的hdl亚型的方法，对于心脑血管疾病的预防和管理具有重要的临床意义。
技术实现要素：
本发明制备了一种apoa1单克隆抗体d11-10，所述apoa1单克隆抗体d11-10的重链亚型为igg2b，轻链亚型为κ，由balb/c小鼠杂交瘤细胞株d11-10所分泌，所述balb/c小鼠杂交瘤细胞株d11-10保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏日期为2017年3月9日，保藏编号cgmccno.13807。保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明提供了一种apoa1单克隆抗体d11-10，所述apoa1单克隆抗体d11-10能够识别apoa1蛋白特异抗原表位，并能据此甄别与心脑血管疾病相关的hdl特定亚型(d11-10亚型)。
本发明中，所述apoa1单克隆抗体d11-10的重链可变区、轻链可变区的氨基酸序列分别如seqidno.3和seqidno.4所示；编码所述重链可变区、轻链可变区的核苷酸序列分别如seqidno.1和seqidno.2所示。
所述apoa1单抗d11-10能与重组的人apoa1发生特异性的反应，所述apoa1单抗d11-10与重组的人apoa1结合力为1.73×10-10m，其不与相同表达系统中得到的重组蛋白血清淀粉样蛋白a1(saa1)和β2微球蛋白(β2m)发生反应，也不与市售天然的牛血清白蛋白(bsa)发生反应。
本发明中，所述apoa1单抗d11-10的制备过程包括：利用杂交瘤细胞系在小鼠腹腔制备含d11-10单抗的腹水，经proteina/g柱亲和层析纯化获得单抗。使用酶联免疫吸附试验(elisa)测定抗体的亚型和亲和力。
本发明中，所述apoa1单抗d11-10能够甄别特定构象hdl颗粒中的apoa1，所述能被该单抗甄别的特定hdl构象被称为hdld11-10亚型。
本发明发现了hdld11-10亚型与chd的高度相关性，提出了apoa1单抗d11-10在制备用于诊断心脑血管疾病的产品中的应用。其中，所述心脑血管疾病体外诊断产品包括试剂盒、试纸、固体支持体免疫检测工具；所述固体支持体包括阵列、微阵列或蛋白质阵列。
本发明还提供了一种心脑血管疾病的诊断产品，包括如上所述的apoa1单抗d11-10；其中，所述心脑血管疾病的诊断产品包括试剂盒、试纸、固体支持体等免疫检测工具；所述固体支持体包括阵列、微阵列或蛋白质阵列。
本发明还提供了一种预测待测对象发生心脑血管疾病的风险的方法，通过所述心脑血管疾病的诊断产品测定待测对象的apoa1蛋白含量，对待测对象发生心脑血管疾病的风险进行预测，当待测对象的apoa1蛋白含量低于正常人群的参考值时，预测发生心脑血管疾病的风险较高。
本发明还提供了一种诊断心脑血管疾病的方法，通过所述心脑血管疾病的诊断产品测定待测对象的apoa1蛋白的含量，对心脑血管疾病进行诊断。
本发明还提供了一种试剂盒，其包括如上所述的apoa1单抗d11-10。
本发明还提供了所述心脑血管疾病的诊断产品的应用，所述心脑血管疾病的诊断产品可通过apoa1单抗d11-10识别、定量特定的apoa1抗原表位，来反映外周血中hdld11-10亚型的水平，以监测心脑血管疾病风险及用于心脑血管疾病的诊断。
本发明中，所述心脑血管疾病的诊断产品可以用于全血、血清或血浆中以及组织提取物中的apoa1的检测。
本发明中，所述心脑血管疾病主要包括由血管斑块形成导致的疾病。
本发明中，所述心脑血管疾病为chd、脑卒中或动脉粥样硬化。
本发明的有益效果在于，本发明所述apoa1单抗d11-10能够通过识别特定apoa1抗原表位来甄别hdld11-10亚型，该单抗与重组人apoa1蛋白的结合力为1.73×10-10m，具有较高的亲和力和特异性；并且在本发明所测定的蛋白中，该单抗只与重组的以及血中天然的apoa1发生特异性反应，不与如saa1、β2m和bsa等无关蛋白反应。所述apoa1单抗d11-10对群体不同样本的测试结果呈离散型分布，提示其能够反映样本间的hdl异质性，即能够通过对apoa1的检测，来反映样本中hdld11-10亚型的水平。相较于现有hdl-c检测技术和apoa1免疫比浊试剂盒(以apoa1多抗为基础)的检测结果，本发明hdld11-10亚型与chd疾病更具相关性，能够更显著区分chd和对照组，尤其提高了hdl-c在正常参考范围内的经冠状动脉造影术确诊(临床诊断金标准)的chd病患的一致率。因此，利用apoa1单抗d11-10发展的检测方法可以改善现有技术的灵敏度，提高对心脑血管疾病的检出率。采用本发明的apoa1单抗d11-10，发展适用于临床高通量免疫比浊自动化检测的试剂盒，可实现对心脑血管疾病的风险预测和临床监测，同时又进一步地为阐明疾病的发生发展机制打下了基础。
附图说明
图1为apoa1单抗d11-10的结合力检测。用重组人apoa1蛋白包被板，系列稀释apoa1单抗d11-10，采用直接elisa方法检测，apoa1单抗d11-10与重组人apoa1蛋白的结合力为1.73×10-10m。
图2为apoa1单抗d11-10的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列，及编码其重链可变区和轻链可变区的核苷酸序列。
图3为apoa1单抗d11-10和多抗对临床样本的检测结果及比较。a：分别利用apoa1单抗d11-10和apoa1免疫比浊试剂盒测定的对照组和冠心病组样本中apoa1的含量；b：分别利用apoa1单抗d11-10和apoa1免疫比浊试剂盒测定的对照组和冠心病组hdl-c≥1mm的样本中apoa1的含量。
图4用apoa1单抗d11-10的检测chd及对照组中的apoa1三分位比较。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
下述实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：apoa1单克隆抗体d11-10的制备和纯化
1.材料：融合蛋白6×his-apoa1，8周龄雌性balb/c小鼠
2.方法和结果
2.1抗原制备
2.1.1人apoa1重组蛋白表达质粒的构建
在genbank查询获得apoa1的基因序列(geneid:335)，根据序列设计聚合酶链式反应(pcr)引物。以人源cdna为模板扩增出人apoa1基因的dna片段，pcr产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并用胶回收试剂盒回收相应片段，pcr扩增的apoa1基因片段大小为875bp。pcr产物连接入表达载体pcoldtmii(该载体含有的6×his标签用于纯化)，转化至takaradh5α宿主菌，挑取单克隆进行质粒提取并测序验证，测序结果与genbank检索序列一致。
2.1.2人apoa1重组蛋白的表达与纯化
将表达人apoa1蛋白的pcoldtmii重组质粒转化大肠杆菌bl21。用iptg诱导表达，经qiagen镍亲和层析柱纯化后(根据说明书操作规程)，得到人apoa1重组蛋白6×his-apoa1(6×his-apoa1融合蛋白)。
2.2小鼠免疫
根据《currentprotocolsinimmunology》中操作流程，使用人apoa1重组蛋白与等体积的弗氏完全佐剂乳化，对8周龄的balb/c小鼠进行免疫，然后用弗氏不完全佐剂乳化，共免疫四次，每次免疫注射量为200μg蛋白。
2.3杂交瘤细胞的制备、筛选和单克隆化
分离免疫的balb/c小鼠的脾细胞，与小鼠骨髓瘤细胞sp2/0融合。通过elisa方法，对杂交瘤细胞进行检测。测定6×his-apoa1结果为阳性，且测定his-saa结果为阴性的克隆被保留。通过有限稀释培养，直至获得稳定的杂交瘤单克隆细胞。含有抗体的培养上清，用proteina亲和层析柱进行纯化后，用于后续检测。
2.4apoa1单克隆抗体d11-10亚型、特异性和亲和力检测
2.4.1apoa1单克隆抗体d11-10亚型鉴定
使用southernbiotech公司sbaclonotypingtmsystem/hrp单克隆抗体轻链和重链分型试剂盒，按照厂商说明书，采用酶联免疫吸附试验(elisa)方法鉴定本发明所述apoa1单抗d11-10的重链亚型为igg2b，轻链亚型为κ。
2.4.2apoa1单克隆抗体d11-10的特异性和亲和力检测
使用直接elisa检测apoa1单抗d11-10的特异性，分别在固相介质上包被市售天然的apoa1蛋白和bsa或带有6×his标签的不同重组蛋白如：apoa1、saa1和β2m，检测单抗对其的识别情况。结果显示apoa1单抗d11-10只与重组的以及天然的人apoa1蛋白发生特异性反应，不与相同表达系统中得到的重组蛋白saa1和β2m发生反应，也不与市售的天然bsa发生反应，显示出良好的特异性。
采用直接elisa方法检测该单抗对其抗原的亲和力(结合力)。将96孔elisa板包被apoa1蛋白，包被液为50mmph8.5的tris.hcl。放置于湿盒中，4℃过夜，pbst洗涤4次后，2％的bsa37℃封闭2h，洗涤2次。加入浓度为系列稀释的apoa1单抗d11-10，37℃孵育1小时；pbst洗涤4次。对辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase,hrp)标记的山羊抗小鼠抗体进行1∶2000稀释，每孔加50μl，室温孵育1.5小时；pbst洗涤4次。然后每孔加入50μlhrp底物(h2o2+tmb)，室温避光孵育约0.5小时，然后每孔加入50μl2nh2so4，测a450nm值。吸收值大于阴性对照孔两倍以上判断为阳性。通过浓度梯度稀释阳性孔的吸光值计算apoa1单抗d11-10的结合力，结果显示apoa1单抗d11-10与apoa1蛋白发生浓度梯度依赖的特异性反应(图1)，计算得到该抗体与人apoa1蛋白的结合力为1.73×10-10m。
综上所述，apoa1单抗d11-10为igg2b亚类，抗体的结合力为1.73×10-10m，只与人apoa1天然蛋白和重组蛋白发生特异性反应，而与无关蛋白saa1、β2m和bsa不发生反应(表1)。
表1apoa1单克隆抗体d11-10的特征
+：发生反应；－：不发生反应。
实施例2：apoa1单抗d11-10的可变区序列的测定
1.材料：trizol(invitrogen)，引物由生工生物工程公司合成，反转录和pcr试剂均采购自takara公司。
2.方法和结果：
2.1总rna提取和cdna的第一链合成
收集处于对数生长期的杂交瘤细胞，根据trizol说明书操作流程提取总rna。使用分光光度计和琼脂糖凝胶电泳对总rna定性定量鉴定。
根据takara公司primescripttmii1ststrandcdnasynthesiskit的说明合成cdna。
2.2apoa1单抗d11-10重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)的基因片段扩增和测序
根据takara公司taq酶说明书，采用50μlpcr的反应体系。
根据wang等发表的文章universalpcramplificationofmouseimmunoglobulingenevariableregions:thedesignofdegenerateprimersandanassessmentoftheeffectofdnapolymerase3’to5’exonucleaseactivity，由生工生物工程公司合成引物。
扩增条件：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒；57℃退火30秒；72℃延伸30秒，共35个循环，72℃10分钟。
pcr产物使用axygen公司胶回收剂盒(操作根据厂商说明书)，简述如下：将apoa1单抗d11-10重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)基因pcr产物的琼脂糖凝胶电泳条带切胶回收后，进行定量测定和电泳分析。将目的片段连接入t-a克隆载体，经转化、筛选后，挑取阳性克隆交由生工生物工程公司测序。将测序得到的dna序列通过在线软件imgt/v-quest分析，编码其重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)的核苷酸序列分别为seqidno.1和seqidno.2，重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)的氨基酸序列分别为seqidno.3和seqidno.4(图2)。
实施例3：基于apoa1单抗d11-10建立的检测方法在心脑血管疾病的风险预测及诊断的临床应用
1.材料：
apoa1单抗d11-10；健康体检人群(无冠心病史)和冠心病(chd)患者的血清样本。
2.方法和结果：
2.1制备混合血清校准品及赋值
使用20例健康体检人群的血清样本，每例取等体积血清至离心管中(各100μl)，置于4℃充分混匀后200μl/管分装，冻存于-80℃冰箱。第二天取出一支，置于4℃解冻，平衡至室温后，使用德赛公司的apoa1免疫比浊试剂盒对混合血清样本赋值。混合血清样本apoa1的浓度为1.66g/l，并以此作为后续建立elisa检测方法的校准品。
2.2临床样本的检测和心脑血管疾病相关性分析
2.2.1临床样本和相关临床信息的收集：
分别收集对照组血清样本38例和冠心病(chd)组血清样本52例。对照组为体检健康人群，甘油三酯、胆固醇、高密度和低密度脂蛋白均处于正常生理值范围，且无炎症反应、无冠心病和肝肾疾病史；冠心病组为冠脉造影确诊的冠心病人群。
2.2.2双抗体夹心elisa对临床样本进行检测及结果分析
2.2.2.1标准曲线的绘制和临床样本的检测
包被兔抗apoa1抗体至96孔elisa板，浓度为1μg/ml，包被液为50mmph8.5的tris.hcl。将elisa板放置于湿盒中，4℃过夜。第二天用清洗液(2％bsa的pbs溶液)洗涤4次后，每孔加200μl2％bsa的pbs溶液，37℃封闭2h。用清洗液洗涤4次，分别在板中加入校准品及临床血清样本。将步骤2.1制备的混合血清以1/20，1/40，1/80，1/160，1/320，1/640，1/1280比例进行稀释，并分别加入板中，50μl/孔，作为校准品，稀释液为含有2％bsa的pbs溶液。以加稀释液的孔作为空白对照。收集到的临床血清样本分别用稀释液进行1/80倍的稀释，以保证样本浓度位于绘制的校准曲线浓度范围内。每个临床样本使用两个复孔进行测试。elisa板中加入样本后在37℃孵育1小时，清洗液洗涤4次。使用稀释液将apoa单抗d11-10稀释至1μg/ml，每孔加50μl，室温孵育1.5小时后，洗涤4次。使用稀释液以1∶2000比例稀释辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase,hrp)标记的山羊抗小鼠二抗，每孔加50μl，37℃孵育1小时后，清洗液洗涤4次。然后每孔加入50μlhrp底物(h2o2+tmb)，室温孵育约0.5小时，最后每孔加入50μl2nh2so4，测a450nm值。根据不同浓度混合血清的apoa1理论蛋白浓度值和实测a450nm值拟合出校准曲线。每个临床样本可根据其a450nm值，在校准曲线中计算出apoa1的测定浓度值。
2.2.2.2apoa1单抗d11-10检测结果的分析及与多抗检测结果的比较
根据临床诊断信息将样本分为对照组和chd组(经冠状动脉造影术确诊，即临床诊断金标准诊断的chd病患组)，将每个样本利用本发明所述apoa1单抗d11-10的实测值和apoa1免疫比浊试剂盒(多抗)的测定值用graphpadprism6进行分析，作出点分布图(图3a)：每个点的纵坐标代表所测该样本的apoa1含量，横坐标代表所属分组。
图3a显示了对照组和chd组各样本通过apoa1单抗d11-10和apoa1免疫比浊试剂盒(多抗)的检测结果。单抗测得chd组中apoa1的分布较对照组的总体要低；多抗也在图3a中显示出类似的结果，但是非常明显的差异在于多抗测试结果分布非常集中，不能体现出个体异质性。反观单抗的测试结果，由于apoa1单抗有甄别特定构象hdl(d11-10亚型)颗粒中的apoa1表位的能力，所以apoa1含量分布呈离散型，提示d11-10亚型的hdl在不同个体的分布不同。
由于单抗只识别一个hdl颗粒上暴露的apoa1蛋白抗原决定簇而多抗可以识别多个抗原决定簇的差异，造成基于多抗的apoa1免疫比浊试剂盒的正常参考范围不适用于基于d11-10单抗发展的检测方法。因此，单抗d11-10测定结果的判定需要建立独立的参考范围。由于检测结果汇总后呈非正态分布，故采用中位数(25％百分位数，75％百分位数)方式表述：apoa1单抗d11-10测定的对照组apoa1含量为4.05(2.43，6.00)g/l，对照组apoa1单抗d11-10测定结果90％的置信区间的cut-off值为1.37g/l(图3中
进一步对chd患者的hdl-c的水平进行分析发现，38例对照组中的hdl-c均处于正常参考区间范围(hdl-c≥1mm)，但是在收集的52例chd患者也有32例hdl-c处于正常参考区间范围(hdl-c≥1mm)，再次说明仅仅检测hdl-c无法完全反映体内hdl的异质性及与疾病的相关性，因此hdl-c作为chd风险因子具有很大局限性。进一步对32例hdl-c≥1mm的chd病人亚组和38例对照组用graphpadprism6进行分析，作出点分布图(图3b)。同样的单抗检测结果仍呈离散分布，单抗测定chd组中apoa1含量为1.63(0.86，2.91)g/l，且在cut-off值下方有13个样本(13/32，41％)；反观多抗的测试结果，分布仍然集中，提示不能区分个体间hdl的异质性。多抗测定chd组中apoa1含量1.27(1.19，1.40)g/l，全部在正常值范围内，即在多抗测定结果的cut-off值以下没有样本分布(0/32)(图3b，表2)，即在32例hdl-c≥1mm的chd患者中，单抗相较于现有的apoa1免疫比浊试剂盒可增加41％的检出率。提示单抗测试可以改善多抗检测及hdl-c检测中的不足，说明利用本发明的apoa1单抗d11-10发展的检测方法可以提高apoa1及hdl-c在预测chd患病风险的准确性和灵敏度。
综上，相较于现有的apoa1免疫比浊试剂盒(多抗)，利用本发明apoa1单抗d11-10建立的检测方法与临床诊断结果具有更高的一致性，特别是在hdl-c≥1mm的chd人群中，多抗检测结果与临床诊断结果无一相符，而单抗的检出率为41％，大大提高了apoa1及hdl-c在预测chd患病风险的准确性和灵敏度。
表2冠心病组apoa1单抗d11-10和多抗检测的apoa1含量比较
§单抗测试结果cut-off值为1.37g/l(参考对照组单抗测试结果的90％置信区间)。
※多抗测试结果cut-off值为1.00g/l(参考临床检验操作规程)。
apoa1含量表示方式为：中位数(25％百分位数，75％百分位数)。
由于单抗识别了人群中hdld11-10亚型，在人群中呈离散分布，且在对照组和chd间的分布有差异，即chd组较多的分布于cut-off值下方。以chd组apoa1单抗d11-10测定结果的三分位数将对照组及chd组进行分组分析(图4)。如图4a及4c所示，在apoa1最低分位t1(0.10～0.90g/l)组内，对照组中仅有2例落于该组(2/38，5.3％)，既对照组大部分不在低于cut-off值，与chd组正相反。而在中分位组t2(0.91～2.80g/l)组中，对照组有11例(11/38，28.9％)，其中仅2例低于cut-off值；在高分位组t3(>2.90g/l)中，66％的对照组样本(25/38)均位于此。因此对照组在该三分位组中所占比例分别从5.3％，28.9％上升至66％，卡方检验其具有显著性差异(p<0.01)；进一步对该三分位组数据进行相关性分析发现，apoa1单抗测定的结果与疾病呈负相关(r＝－0.377，p<0.01)；由于在chd病人中，有相当一部分患者的hdl并没有降低，仍在正常范围内，因此，对于该部分hdl在正常范围内的亚群(hdl≥1mm)同样按照上述三分位数进行分组分析，如图4b及4d所示，对照组所占比例分别为7.9％(3/38)、15.8％(6/38)、76.3％(29/38)，大于3/4的对照组人群在高分位组，卡方检验显示具有显著性差异(p<0.01)；进一步的相关性分析发现，在该hdl≥1mm的亚群中，apoa1单抗d11-10测定的结果与疾病相关性更高(从r＝-0.377升高至r＝－0.435p<0.01)；说明利用apoa1单抗d11-10发展的检测方法比现有的hdl-c和apoa1免疫比浊方法更加灵敏和准确，特别是与hdl-c处于正常参考区间内的chd病患人群的相关性有显著提高。
综上所述，本发明apoa1单抗d11-10及其发展的检测方法和试剂盒可以甄别与chd负相关的特定hdl亚型，即hdld11-10亚型。该亚型的分布在chd病人及其对照组都呈离散型，提示群体的hdl异质性。在chd中，单抗的检测结果不均一并且总体比较低，提示hdld11-10亚型可能随着chd病程而减少，可能与疾病的严重程度相关；而对照组中的该亚型相对较多，提示该亚型可能有抗斑块形成的功能。在对临床chd患者的检测中，依赖apoa1单抗d11-10的检测方法能够显著提高chd的检出率，尤其在hdl-c正常(hdl-c≥1mm)的chd患者中，在现有的apoa1免疫比浊试剂完全阴性的情况下，依然能有41％的检出率，大大提高了与临床冠脉造影诊断(临床诊断金标准)的一致性。因此本发明的apoa1单抗d11-10即基于该单抗发展的检测方法和试剂盒可以改善现有apoa1检测试剂盒和方法的缺陷，对心脑血管疾病的临床监测具有重要意义。
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。
<110>德赛诊断系统（上海）有限公司
<120>抗人apoa1单克隆抗体及其制备方法和应用
<160>4
<210>1
<211>352
<212>dna
<213>人工序列
<400>1
caggtccagcttcagcagtctggggctgaactggcaaaacctggggcctcagtgaagatgtcctgcaaggctt
ctggctacagttttacaagctactggatgcattggataaaacagaggcctggacagggtctggaatggattgg
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cctatggtaactacaaatttgtttactggggccaagggagtctggtcacggtctctgcaa
<210>2
<211>322
<212>dna
<213>人工序列
<400>2
gatattgtgatcacacagtctacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatcagttgcaggg
caagtcaggacattaacaattatttacactggtatcagcagaaaccagatggaactgttaaactcctgatcta
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<211>117
<212>氨基酸
<213>人工序列
<400>3
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kysttayiqlssvtstdsavyycasygnykfvywgqgslvtvsa
<210>4
<211>107
<212>氨基酸
<213>人工序列
<400>4
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iitnleqedfatyfcqqgdtlpitfgsgtnleik