本发明涉及一种太子参抗真菌胰蛋白酶抑制剂的分离与纯化方法，属于生物技术领域。
背景技术：
太子参[pseudostellariaheterophyllaroots(miq.)pax.]又名孩儿参，石竹科太子参属植物。太子参略有甘味，属于温和滋补型食材，具有生津润肺之特性，历史悠久，常用于治疗各种肺部和脾脏疾病，民间常作为药膳来食用。太子参中包含各类有效的化学成分，如氨基酸、环肽类、糖类等，这些化学成分与太子参具有降血糖、抗氧化、抗应激和增强机体免疫等功能有密切关系。目前，大多数研究专注于太子参多糖和皂苷等，而对太子参中丰富的蛋白质研究较少。因此，本研究从太子参中分离纯化出胰蛋白酶抑制剂的研究能有效的填补这一不足。
胰蛋白酶抑制剂（trypsininhibitor）是一类能够抑制蛋白水解酶催化活性的蛋白质或肽，属于丝氨酸蛋白酶抑制剂家族。胰蛋白酶抑制剂广泛分布于动物、植物和微生物中，其中在乔本科植物和豆类中的研究较为深入。胰蛋白酶抑制剂具有调节蛋白酶、抗虫害、抗病毒、抗细胞增殖和抗真菌等活性。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种太子参抗真菌胰蛋白酶抑制剂的分离与纯化方法，该方法操作简单、设备成本低，且得到的胰蛋白酶抑制剂活性强、稳定性好且具有抑制尖孢镰刀菌和锥栗炭疽病病菌的作用。
为实现上述目的，采用以下技术方案：
本发明太子参中抗真菌胰蛋白酶抑制剂的分离与纯化方法，包括如下步骤：
（1）太子参蛋白粗提液的制备：新鲜太子参块根匀浆，浸提，过滤，离心取上清液；
（2）硫酸铵分级沉降：利用质量分数为20%-80%硫酸铵分级沉降初步纯化蛋白粗提液；
（3）柱层析：利用sephadexg-50凝胶过滤层析及deae阴离子交换层析进一步分离纯化以得到高纯度的胰蛋白酶抑制。
步骤（1）中胰蛋白酶抑制剂粗提液的制备如下：新鲜太子参块根清洗干净，以1:5-10质量体积比加入10-50mm、ph6.5-8.0tris-hcl缓冲液，匀浆，4℃下搅拌浸提5-10h，砂布过滤，在10000r/min下离心10-30min，取上清液，即得太子参蛋白粗提液。
步骤（2）中的硫酸铵分级沉降操作如下：将硫酸铵均匀缓慢加入太子参蛋白的粗提液中，通过质量分数为20%-80%硫酸铵分级沉降太子参蛋白，以1:5-10w/v加入10-50mm、ph6.5-8.0tris-hcl缓冲液溶解沉淀，用相同的缓冲液在4℃下透析24-36h，期间更换3-4次缓冲液，透析结束后4℃、10000r/min离心10-30min，收集上清液。
步骤（3）中所述柱层析具体操作如下：透析后的上清液上样到预先用10-50mm、ph6.5-8.0tris-hcl缓冲液平衡好的sephadexg-50凝胶过滤色谱柱上，相同缓冲液进行洗脱，流速为3ml/10min，在280nm波长下测定样品吸光值。收集具有胰蛋白酶抑制活性的组分，进行超滤浓缩后，上样到预先用10-50mm、ph6.5-8.0tris-hcl缓冲液平衡好的deae-650m阴离子交换色谱上，洗去未吸附的蛋白后，用含0~1.0mnacl的上述缓冲液进行梯度洗脱，流速为1ml/min，在280nm波长下测定样品吸光值和胰蛋白酶抑制活性，收集达到电泳纯的组分，即为所述胰蛋白酶抑制剂。利用edman降解法鉴定蛋白n端氨基酸序列，得到所述的胰蛋白酶抑制剂n端氨基酸序列为：phe-val-val-asp-leu-asp-gly-asp-pro-leu-asp-gly。
分离纯化得到的胰蛋白酶抑制剂具有显著的抗真菌活性。
所述胰蛋白酶抑制活性测定方法如下：
以na-苯甲酰-dl-精氨酸-对硝基苯胺为底物测定胰蛋白酶抑制剂活性。将0.25mg/ml的胰蛋白酶抑制剂0.20ml与0.40mg/ml的底物1ml混合后于37℃下保温10min后，加入0.50ml0.20mg/ml的胰蛋白酶继续在37℃下保温10min，加入0.20ml乙酸溶液（w/v为33%）终止反应，在波长410nm下测吸光值。以无抑制剂为空白对照。一单位的胰蛋白酶抑制剂的抑制活力定义为：在测定条件下，每分钟引起吸光度改变0.001所需酶的量。
所述抗真菌活性具体操作如下：
（1）滤纸片法：将灭菌好的培养基倒入无菌的培养皿，自然冷却凝固成平整均匀的液面。挑取活化好的菌丝置于培养皿中心位置，恒温（30℃）培养24h。用镊子将灭菌好的四个滤纸片贴在离菌丝体约0.5cm的位置，各取8μl不同浓度的样品滴在滤纸片上，继续培养、观察真菌生长情况。
（2）96孔板稀释法：将胰蛋白酶抑制剂溶解于pdb培养基，每孔加入300μl培养液，用二倍浓度稀释法，得到样品溶液浓度分别20、10、5、2.5、1.25、0.625mg/ml。每孔加入2μl活化后的菌液，等体积的无菌培养液加入对照组，恒温（37℃）共培养10h，每隔1h在600nm波长下测其吸光值。
（3）扫描电子显微镜制样具体操作如下：
①收集菌液：取5ml中后期的菌悬液，8000r/min离心5min，取沉淀，无菌生理盐水反复清洗3次，用无菌生理盐水配制样品，恒温（30℃）培养6h。
②固定：取4ml戊二醛（2.5%）溶解在沉淀物，充分混匀，4℃下静置过夜。离心机转速设为8000r/min离心5min，弃上清，用生理盐水清洗2-3次。
③脱水：用乙醇（20、50、80%）各脱水一次，100%乙醇脱水2次，每次10min，每次均离心5min。
④干燥：用灭菌过的去离子水，将菌液稀释到最佳浓度，取5μl菌液滴到灭菌后的单晶硅片上，做好标记，自然风干。
⑤喷金：在干燥好的单晶硅片上镀金，以便于导电。
本发明立足于新鲜太子参块根中蛋白质含量高且天然存在的胰蛋白酶抑制剂抑制活性强，利用柱层析对太子参蛋白进行分离纯化，得到新型胰蛋白酶抑制剂。本发明利用常规分离纯化方法、便于生产放大，得到的胰蛋白酶抑制剂具有强的ph和温度稳定性及抗真菌活性，为全面、合理利用太子参活性蛋白提供一定的理论指导，有助于太子参资源的开发，以便其应用在农业及医药等领域。
附图说明
图1-a为sephadexg-50凝胶过滤层析洗脱曲线。
图1-b为deae阴离子交换层析洗脱曲线。
图1-c为组分a2-2的sds-page图。
图2为phti对尖孢镰刀菌和锥栗炭疽病病菌的定性分析，其中a为尖孢镰刀菌，b为锥栗炭疽病病菌。
图3为phti对尖孢镰刀菌和锥栗炭疽病病菌生长曲线的影响，其中a为尖孢镰刀菌，b为锥栗炭疽病病菌。
图4为扫描电镜图，其中a1和a2分别为经phti处理前后尖孢镰刀菌的扫描电镜图；b1和b2分别为经phti处理前后锥栗炭疽病病菌的扫描电镜图。
具体实施方式
实施例1
第一步：新鲜太子参清洗干净，自然晾干，备用。取20g新鲜太子参中加入150ml的50mm，ph7.4tris-hcl缓冲液，匀浆，4℃下搅拌浸提6h，四层砂布过滤。在10000rpm下离心15min，取上清液，即得太子参蛋白粗提液。
第二步：在粗提液中缓慢加入固体硫酸铵使其饱和度达到20%，完全溶解后4℃下静置4h，10000r/min离心15min，收集上清液，继续加入固体硫酸铵使其饱和度达到80%，完全溶解后4℃下静置12h，10000r/min离心15min，收集沉淀。以少量tris-hcl缓冲液溶解后，用相同的缓冲液在4℃下透析24h，期间更换3次缓冲液，透析结束后4℃、12000r/min离心15min，收集上清液。
第三步：透析后的上清液上样到预先用50mm、ph7.4tris-hcl缓冲液平衡好的sephadexg-50凝胶过滤色谱，相同缓冲液进行洗脱，流速为3ml/10min，在280nm波长下测定样品吸光值。经sephadexg-50凝胶过滤色谱分离后得到三个组分，胰蛋白酶抑制活性只保存于组分a2上，收集组分a2，如图1-a所示。
第四步：将组分a2进行超滤浓缩后，上样到预先用50mm，ph7.4tris-hcl缓冲液平衡好的deae-650m阴离子交换色谱柱上，洗去未吸附的蛋白后，用含0~1.0mnacl的上述缓冲液进行梯度洗脱，流速为1ml/min，在280nm波长下测定样品吸光值。组分a2经deae阴离子交换色谱分离为三个组分，如图1-b所示。经sds-page鉴定组分a2-2只包含一条蛋白带。将达到电泳纯且具有抑制胰蛋白酶活性的蛋白命名为胰蛋白酶抑制剂（phti），分子量为20.5kda，如图1-c所示。分离纯化得到的phti胰蛋白酶抑制比活力为14790.2u/mg。
第五步：由edman降解法检测出phti的n-末端前12个氨基酸残基，测定结果为：phe-val-val-asp-leu-asp-gly-asp-pro-leu-asp-gly（fvvdldgdpldg）。phti与部分来源不同的kunitz型胰蛋白酶抑制剂的具有一定相似度的氨基酸序列，但相似序列都远离它们的n-末端，故phti是一种新型胰蛋白酶抑制剂。
第六步：测定phti活性在不同温度下的变化。如表1所示，phti经20-70℃水浴处理30min后，其胰蛋白酶抑制活性基本不受影响；当温度大于80℃时，其残留抑制率大幅度开始出现较大幅度下降。
表1温度对phti蛋白抑制活性的影响
第七步：测定phti活性在不同ph下的变化。如表2所示，phti在ph2-10条件下处理30min后，其抑制活性没有发生显著性变化，残留抑制率均保留在90%以上，说明phti具有很强的ph稳定性。
表2ph对phti蛋白抑制活性的影响
第八步：通过滤纸片法检测不同浓度的phti对尖孢镰刀菌和锥栗炭疽病病菌的作用，图2中的a和b表示为phti分别对尖孢镰刀菌和锥栗炭疽病病菌的作用；a、b、c、d分别表示0、0.1、0.25、0.5mm的phti。菌丝在不加入抑制剂物质的滤纸片中，培养两三天后，菌丝能在滤纸片上继续生长，在培养基上整体为圆形、且边缘整齐，如图2中a和b的a所示。在滤纸片上滴加不同浓度的phti，phti溶液通过滤纸片渗透到培养基中，从而抑制了附近菌丝的生长，在其周围出现了月牙形的抑菌圈，如图2中的a和b的b、c、d所示。
第九步：菌悬液在波长600nm下的吸光值可用来衡量菌悬液中菌体数。图3中的a和b分别为phti（0.5mm）对尖孢镰刀菌和锥栗炭疽病病菌的生长抑制曲线。尖孢镰刀菌在未加入phti溶液时保持较为快速的生长，在加入phti（0.5mm）后，生长受到一定程度的抑制。对照组的锥栗炭疽病病菌保持快速的生长，加入phti（0.5mm）的实验组生长总体受较大程度的抑制。在前期培养过程中，由于菌处于调整期，实验组的菌数略微减少；随着培养时间的增加，尖孢镰刀菌和锥栗炭疽病病菌进入生长期，实验组延缓前2h的培养过程中，由于菌处于调整期，实验组的菌数略微减少，与对照组差异小；随着培养时间的增加，尖孢镰刀菌和锥栗炭疽病病菌进入生长期，实验组延缓病菌的生长趋势逐渐明显，但在后期无法控制菌体的生长速度，这是因为菌的生长旺盛，phti的抑制作用受限。
第十步：扫描电镜显微镜可以直观地观察菌体表面形态变化。如图4-a1所示，未经phti处理后的尖孢镰刀菌细胞形态较为饱满、表面光滑平整、大小均匀，呈典型的棒状形态，说明菌体结构完整、生长状态良好。经phti（0.5mm）作用后，尖孢镰刀菌的形态发生变化，出现一定程度的皱缩、干瘪、表现出不均匀的表面形态并开始毛糙，且膜表面出现一定的膜的突起，甚至有局部菌体向内凹陷，如图4-a2所示。如图4-b1所示，未经phti处理后的锥栗炭疽病病菌细胞形态出现一定程度的凹陷，可能是在实验过程中脱水干燥造成的，但表面细胞界线完整，说明菌体结构完整。经phti（0.5mm）处理后锥栗炭疽病病菌的形态发生巨大变化，细胞界线变得模糊不清，多处凹陷，出现严重的细胞粘连聚集现象，如图4-b2所示，说明此时锥栗炭疽病病菌的细胞壁被严重破坏，导致了内溶物质的泄漏，表明phti对尖孢镰刀菌和锥栗炭疽病病菌均有抑制作用。
从图1分离纯化实验结果、表1、表2温度和ph对phti活性影响结果及phti的抗真菌结果可以看出，本发明分离纯化制备了一种高纯度、强活性，具有强的酸碱稳定性和良好的热稳定性及抗真菌活性的胰蛋白酶抑制剂。
以上所述仅为本发明的较佳实施实例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
序列表
<110>福州大学
<120>一种太子参抗真菌胰蛋白酶抑制剂的分离与纯化方法
<130>1
<160>1
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>12
<212>prt
<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum
<400>1
phevalvalaspleuaspglyaspproleuaspgly
1510