一种基于过渡金属纳米材料特异性还原细胞色素c的方法与流程

本发明属于纳米材料与生物检测技术领域，具体涉及一种基于过渡金属纳米材料特异性还原细胞色素c(cytc)的方法。

背景技术：

细胞色素是一类以铁卟啉或血红素作为辅基的电子传递蛋白，根据蛋白质中血红素辅基的不同，可分为不同的种类，例如细胞色素a、细胞色素b、细胞色素c等，细胞色素广泛参与细胞内的能量传递、新陈代谢和细胞凋亡等生命过程。体外研究细胞色素的结构和功能对于生物化学、药物代谢、毒理学、临床医学、肿瘤生化等领域具有重大的意义。而其中的细胞色素c(cytc)为生物氧化过程中的电子传递体，其作用原理为在酶存在的情况下，对组织的氧化、还原有迅速的酶促作用。通常外源性细胞色素c(cytc)不能进入健康细胞，但在缺氧时，细胞膜的通透性增加，细胞色素c便有可能进入细胞及线粒体内，增强细胞氧化，能提高氧的利用。在有关细胞凋亡的研究表明，细胞色素c与细胞凋亡有关，从线粒体中泄露出的细胞色素c有诱导细胞凋亡的作用。

随着纳米技术的快速发展，金属纳米材料在医学成像、疾病诊断、药物传输、癌症治疗、基因治疗等领域的应用和基础研究也在飞速发展。由于过渡金属纳米材料的特性，它有着很高的催化性能，广泛应用于密封减震、医疗器械、声音调节、光显示等。

而在这之中我们以镍和钴作为示例进行研究，镍(ni)作为廉价的催化剂，具有多种关键特性，包括氧化添加和容易获得多种氧化态，以此来实现广泛的创新反应。另一方面，镍纳米材料已被用于表面增强拉曼散射(sers)，它的增强能力取决于电磁机制引起的表面形态。

在近年镍有着治疗癌症的巨大潜力，其作为诱导剂或细胞死亡的调节剂在癌症生物医学应用方面引起越来越多的关注。而且由于镍纳米材料具有固有的磁性，可以通过外部磁体靶向某些癌细胞，而不会对正常细胞造成不必要的损伤。研究细胞色素c氧化还原状态的转化及细胞色素c氧化还原状态如何调控细胞凋亡机制以及如何开发具有特定电子给体性质的cytc人工纳米材料，并将其引入细胞，具有重要的意义。同时，ni纳米材料对细胞色素氧化还原态的影响有助于更好地理解ni纳米材料的形成机制。

为此，在研究细胞功能中利用ni和co纳米材料的还原活性。作为氧化还原蛋白cytc的新型还原性纳米材料，ni和co纳米材料显示出优于其他蛋白质还原方法的优点也是其创新点：(1)磁性使得能够通过外部磁体快速分离和收集ni和co纳米材料(在一分钟内)。因此，氧化的cytc可以被快速还原并直接使用而无需复杂的纯化步骤；(2)镍和钴纳米材料的还原活性(对于cytc是特异性的，这有助于研究复杂生物样品如cytc-配体复合物或细胞蛋白提取物中cytc的氧化还原状态的依赖性功能。

技术实现要素：

针对上面的问题，我们首次将过渡金属镍(ni)和钴(co)纳米材料与几种细胞色素结合，发现细胞色素c与过渡金属纳米材料之间的特异性还原的性质，超越了现有的过渡金属纳米粒子和细胞的反应过程。

本发明的第一目的是提供一种基于过渡金属纳米材料特异性还原细胞色素c的方法(实施例1)，传统的和生物学的cytc还原和纯化方法是交换层析，它需要用还原剂(连二亚硫酸钠)将还原的cytc与几个洗脱步骤分离，而此方法非常简单；本发明的第二目的是提供一种基于过渡金属纳米材料还原cytc-心磷脂脂质体混合物中的cytc的方法(实施例1)。在这里，与心磷脂脂质体结合的cytc过氧化物酶活性与氧化还原状态的关系首次借助镍纳米材料揭示；本发明的第三目的是提供一种基于过渡金属纳米材料检测线粒体中的细胞色素c的方法(实施例2)，此方法设计了一种非常简单易操作的实验过程来检测线粒体中的细胞色素c。

本发明所述的是一种基于过渡金属纳米材料特异性还原细胞色素c(cytc)的方法，其步骤如下：

①将六水合氯化镍或氯化钴以乙二醇作为溶剂，制成浓度为0.05～0.2mol/l的氯化镍或氯化钴的乙二醇溶液；

②向1.0～1.2g氢氧化钠固体中加入30～40ml乙二醇，磁力搅拌30～60分钟，得到氢氧化钠的乙二醇溶液；

③在步骤②得到的氢氧化钠的乙二醇溶液中加入10～20ml、质量分数为70％～80％的水合肼水溶液，搅拌至获得均匀的溶液；

④将步骤③得到的溶液在磁场中加热至70～90℃后，将5～10ml步骤①得到的氯化镍或氯化钴的乙二醇溶液逐滴加入其中，继续搅拌10～20min，在溶液中得到黑色固体；

⑤将步骤④得到的黑色固体产物用磁铁取出后，用去离子水和乙醇洗涤，然后在50～80℃下干燥10～20小时，得到ni纳米材料或co纳米材料；

⑥称取细胞色素c，溶解于ph＝7.0～7.3的磷酸缓冲溶液中，制成100～200μmol/l细胞色素c的溶液，利用紫外可见近红外分光光度计进行检测，得到该溶液的吸光度曲线；

⑦称取0.0020～0.0030gni纳米材料或co纳米材料，与150～200μl步骤⑥制得的细胞色素c的溶液混合后，搅拌10～15分钟；

⑧待细胞色素c溶液变色后，用磁铁将ni纳米粒子或co纳米粒子吸附在混合溶液底部，将上层溶液取出，然后利用紫外可见近红外分光光度计进行检测，得到该溶液的吸光度曲线；通过对比步骤⑥和本步骤得到的吸光度曲线可以看到，曲线的特征峰位发生了红移，从而表明细胞色素c已被ni纳米材料或co纳米材料还原。

进一步，

①称取肌红蛋白或辣根过氧化物酶，分别溶解于ph＝7.0～7.3的磷酸缓冲溶液中，制成100～200μmol/l的溶液，利用紫外可见近红外分光光度计进行检测，得到溶液的吸光度曲线；

②称取0.0020～0.0030gni纳米材料或co纳米材料，分别与150～200μl步骤⑤制得的几种溶液混合，搅拌10～15分钟；

③待溶液变色后，用磁铁将ni纳米材料或co纳米材料吸附在混合溶液底部，将上层溶液取出，然后利用紫外可见近红外分光光度计进行检测，发现在紫外检测到的特征峰没有发生峰位的移动，证明镍和钴纳米材料没有将这两种细胞色素还原。

上述操作，可以说明镍和钴纳米材料只能特异性还原细胞色素c。传统的和生物学的cytc还原和纯化方法是交换层析，它需要用还原剂(连二亚硫酸钠)将还原的cytc洗脱分离。在这里，作为氧化还原蛋白cytc的新型还原性纳米材料，镍和钴纳米材料显示出优于其他蛋白质还原方法的优点：镍和钴纳米材料的还原活性对于cytc是特异性的，这对于选择性还原复杂生物样品(例如像蛋白质提取物)中的cytc是非常重要的。

本发明所述的一种基于过渡金属纳米材料还原cytc-心磷脂脂质体混合物中的cytc的方法，其步骤如下(步骤①～⑤与前面所述的完全相同)：

⑥配置成150～200μmol/l的fe³⁺cytc样品溶液，将0.002～0.003gni纳米材料或co纳米材料加入到150～200μl的fe³⁺cytc样品溶液中，然后利用磁铁将ni纳米材料或co纳米材料收集在样品溶液底部，ni纳米材料或co纳米材料将fe³⁺cytc还原成fe²⁺cytc；然后再将350～400μl、0.51～1.02mg/l的心磷脂脂质体溶液加入到上述样品溶液中，随后将心磷脂脂质体与cytc溶液室温下一起温育20～30分钟，心磷脂脂质体与fe²⁺cytc结合，从而将样品溶液中的fe²⁺cytc氧化成fe³⁺cytc；

⑦摇晃样品溶液让ni纳米材料或co纳米材料与混合溶液充分接触，再用磁铁将ni纳米材料或co纳米材料吸附在混合溶液底部，从而将样品溶液中的fe³⁺cytc再次还原成fe²⁺cytc。

因为镍和钴纳米材料的磁性，能够通过外部磁体快速分离和收集(在一分钟内)。因此，氧化的cytc可以迅速还原并直接使用，无需复杂的纯化程序。这在一定程度上减少了复杂的纯化顺序，提供了一种新型的还原细胞色素c的方法。

本发明所述的一种基于过渡金属纳米材料检测线粒体中的细胞色素c的方法，其步骤如下(步骤①～⑤与前面所述的完全相同)：

⑥将hela细胞以ph＝7.4的磷酸缓冲溶液为溶剂配置成浓度为2×10⁵ml^-1的溶液，将放线菌素d以ph＝7.4的磷酸缓冲溶液为溶剂配置成浓度为1μmol/l的溶液，将两种溶液以体积比1：1的比例混合后孵育1h～1.5h，然后分离出线粒体，线粒体中含有fe³⁺cytc，保存在ph＝7.4的磷酸缓冲溶液中，得到线粒体溶液；

⑦向步骤⑥得到的500μl线粒体溶液的上清液中加入0.02g～0.03g的ni纳米材料或co纳米材料，将线粒体溶液中的fe³⁺cytc转换成fe²⁺cytc，然后对线粒体溶液进行raman测试，由于fe²⁺cytc拉曼信号比fe³⁺cytc拉曼信号的强度高，从而可以检测出cytc的特征信号，并可通过对步骤⑥溶液拉曼信号的相对强度定量检测线粒体释放的fe³⁺cytc的含量。

传统的检测线粒体释放的cytc的方法是蛋白质印迹法。近年来，人们开发了一些新的方法，如质谱法和荧光法，具有很高的选择性和灵敏度。然而，几乎所有这些方法都需要耗费时间来制备用于基于生物识别特异性捕获cytc的特异性适体或抗体。而且，这些方法都不能区分释放的cytc的氧化还原状态。在本发明所述方法中，可以直接在分离的线粒体溶液中使用镍或钴纳米材料，并通过拉曼光谱法立即检测线粒体释放的cytc。

本发明使用的是日本岛津公司的uv-3600紫外可见近红外分光光度计和英国雷尼绍公司renishaw1000model型共聚焦显微拉曼光谱仪。

附图说明

图1：对应实施例1，为细胞色素c-心磷脂复合物溶液加入3,3',5,5'-四甲基联苯胺(tmb)和过氧化氢(h2o2)混合溶液后的紫外图。插图a为fe²⁺cytc-心磷脂脂质体混合溶液加入tmb和h2o2混合溶液的变为深蓝色，图b为fe³⁺cytc-心磷脂脂质体混合溶液加入tmb和h2o2后变为浅蓝色。

曲线a在409nm处的soret带看出心磷脂脂质体结合后大部分还原型cytc被氧化。曲线b在413nm处的典型soret带和在519和549nm处的两个更强的q带，证明镍纳米材料在减少。通过tmb和h2o2检测两种cytc-cl复合物的过氧化物酶活性。如插图的颜色变化和紫外图中氧化tmb在656nm处的吸光度差值表明，fe³⁺cytc-cl复合物(标记b)诱导过氧化物酶的活性低于fe²⁺cytc-cl复合物(标记a)。

图2：对应实施例2，为在放线菌素d处理后的线粒体溶液中加入镍纳米粒材料前后的raman图。曲线a为还型细胞色素c的特征拉曼图。曲线c为在放线菌素d处理后，直接检测的线粒体溶液拉曼图，可以看到在没有加入镍纳米粒子时，是没有检测到细胞色素c的存在。在加入镍纳米粒子后，可以检测到在750cm^-1和1583cm^-1处出现了细胞色素c的特征峰(曲线b)。

具体实施方式

实施例1：还原结合心磷脂的细胞色素c

①将六水合氯化镍(nicl2·6h2o)以乙二醇作为溶剂，制成浓度为0.1mol/l的氯化镍的乙二醇溶液；

②向1.2g氢氧化钠固体中加入35ml乙二醇，磁力搅拌50分钟，得到氢氧化钠的乙二醇溶液；

③在步骤②得到的氢氧化钠的乙二醇溶液中加入10ml、质量分数为75％的水合肼水溶液，搅拌至获得均匀的溶液；

④将步骤③得到的溶液在磁场中加热至80℃后，将10ml步骤①得到的氯化镍的乙二醇溶液逐滴加入，继续搅拌10min，在溶液中得到黑色毛绒固体；

⑤将步骤④得到的黑色毛绒固体产物用磁铁取出后用磁铁取出后，用去离子水和乙醇洗涤，然后60℃下干燥12小时，得到镍纳米材料0.13g；

⑥将从西格玛奥德里奇公司购买的fe³⁺cytc样品以ph＝7.0的缓冲溶液为溶剂配置成200μmol/l的fe³⁺cytc样品溶液备用。

⑦将0.003g镍纳米材料加入到两个自然状态的200μmol/l的200μlfe³⁺cytc样品溶液中，然后利用磁铁将ni纳米材料收集在样品溶液的底部，这时镍纳米材料将fe³⁺cytc还原成fe²⁺cytc，然后再将1.02mg/l的400μl心磷脂脂质体溶液加入到上述两个样品中，随后将心磷脂脂质体与cytc溶液室温下一起温育30分钟，这时心磷脂脂质体与fe²⁺cytc结合将fe²⁺cytc氧化成fe³⁺cytc。

⑧摇晃其中一个样品让镍纳米材料与混合溶液充分接触，然后用磁铁将纳米材料吸附在样品底部后，在步骤⑦已经和心磷脂溶液结合后变成fe³⁺cytc溶液再次被还原成fe²⁺cytc，另一个样品不做处理，并且将tmb和h2o2的混合溶液加入到两个样品中，然后cytc促进h2o2氧化tmb后溶液均变成蓝色，其中fe²⁺cytc中溶液颜色更深。

⑨将两种颜色深浅程度不同的溶液用紫外可见近红外分光光度计检测。

在心磷脂(cl)和cytc结合后，可诱导cytc的过氧化物酶活性，这是触发细胞凋亡的重要事件。cl和fe²⁺cytc结合后，可以将fe²⁺cytc氧化为fe³⁺cytc，fe²⁺cytc可显示出比fe³⁺cytc更高的过氧化物酶活性。与cl脂质体结合后，fe²⁺cytc会发生微量的氧化，从而难以研究和cl结合的fe²⁺cytc后诱导的过氧化物酶活性。而在上述方法的基础上，cytc与cl结合后诱导过氧化物酶活性是和cytc氧化还原状态有关的，这表明在凋亡早期，fe²⁺cytc与线粒体内膜的cl结合，而低生理含氧水平会加速cl的过氧化。

实施例2：还原线粒体释放的细胞色素c

①将氯化钴以乙二醇作为溶剂，制成0.1mol/l的乙二醇溶液，备用。

②向1.1g氢氧化钠固体中加入35ml乙二醇，磁力搅拌60分钟，得到氢氧化钠的乙二醇溶液。

③在步骤②得到的氢氧化钠的乙二醇溶液中加入15ml、质量分数为75％的水合肼水溶液，搅拌至获得均匀的溶液；

④将步骤③得到的溶液在磁场中加热至80℃后，将10ml步骤①得到的氯化钴的乙二醇溶液逐滴加入，继续搅拌15min，在溶液中得到黑色固体；

⑤将步骤④得到的黑色固体产物用磁铁取出后，用去离子水和乙醇洗涤，然后70℃下干燥15小时，得到钴纳米材料0.17g；

⑥将hela细胞以ph＝7.4的磷酸缓冲溶液为溶剂配置成浓度为2×10⁵ml^-1的溶液，将放线菌素d以ph＝7.4的磷酸缓冲溶液为溶剂配置成浓度为1μmol/l的溶液，将两种溶液以体积比1：1的比例混合后孵育1h，随后分离出线粒体，线粒体中含有fe³⁺cytc，保存在磷酸缓冲溶液中，得到线粒体溶液；

⑦使用激发线为532nm的raman仪器检测步骤⑥得到的线粒体溶液的上清液得到raman曲线，再加入镍纳米材料0.02g，对上清液进行raman检测。

在镍纳米粒子对细胞色素c特异性还原下，可以将线粒体中的fe³⁺cytc转换成fe²⁺cytc，fe²⁺cytc拉曼信号比fe³⁺cytc拉曼信号的强度高，可以检测出cytc的特征信号，并可通过对步骤⑥溶液拉曼信号的相对强度定量检测线粒体释放的fe³⁺cytc的含量。