本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及一种抗猪流行性腹泻病毒的单链抗体及其应用。
背景技术：
：猪流行性腹泻(porcineepidemicdiarrhea，ped)是由猪流行性腹泻病毒(porcineepidemicdiarrheavirus，pedv)引起的一种肠道传染病，该病通常多发于寒冷的冬春季节，临床症状主要表现为腹泻、呕吐、消瘦、脱水，最终导致死亡。目前尽管疫苗的应用对该病的控制起到了一定的作用，但该疫病在部分地区仍有不同程度的发生和流行。噬菌体抗体展示技术为基因工程抗体的高效筛选和定向改造提供了更高效的途径。随着动物免疫技术的发展，空间将会变得越来越狭小，利用体外方法筛选抗体将会越来越受到关注。噬菌体展示技术在筛选抗体方面与传统的单克隆抗体制备有所差异，该技术通过在噬菌体表面展示，与靶抗原结合，通过简单易行的96孔微孔板法，利用抗原抗体结合，“吸附-洗脱-富集”大大缩减了筛选时间及步骤。噬菌体抗体展示技术可以实现抗体的靶动物源化，减少抗体在使用过程中的抗抗体现象。目前，猪源噬菌体抗体展示平台较少，抗体分子量偏大，与抗原结合区域容易被封闭，且单链抗体的折叠能力有限，并且传统单抗基本为鼠源抗体，在使用过程中容易产生抗抗体，影响其治疗效果。现有的猪流行性腹泻疫苗无法全部防控该病的爆发，给养猪业带来了巨大的经济损失。技术实现要素：本发明的目的是提供一种抗猪流行性腹泻病毒的单链抗体。本发明所提供的单链抗体，是由轻链可变区、连接肽和重链可变区组成的多肽；所述连接肽位于所述轻链可变区和所述重链可变区之间；所述轻链可变区可如序列表中序列1自n末端起第1至107位氨基酸残基所示；所述重链可变区可如序列表中序列1自n末端起第123至240位氨基酸残基所示。上述单链抗体中，所述连接肽可如序列表中序列1自n末端起第108至122位氨基酸残基所示。所述单链抗体具体可为序列表中序列1所示的多肽。本发明还保护编码上述任一所述单链抗体的核酸分子。上述任一所述单链抗体的核酸分子可由所述轻链可变区的编码基因、所述连接肽的编码基因和所述重链可变区的编码基因组成。所述轻链可变区的编码基因可如序列表中序列2自5’末端起第1至321位核苷酸所示。所述重链可变区的编码基因可如序列表中序列2自5’末端起第367至720位核苷酸所示。所述连接肽的编码基因可如序列表中序列2自5’末端起第322至366位核苷酸所示。上述任一所述单链抗体的核酸分子具体可为a1)或a2)或a3)或a4)所示的dna分子：a1)编码区是序列表中序列2所示的dna分子；a2)核苷酸序列是序列表中序列2所示的dna分子；a3)与a1)或a2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述任一所述单链抗体的dna分子；a4)在严格条件下与a1)或a2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述任一所述单链抗体的dna分子。其中，所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna或hnrna等。其中，序列表中序列1由720个核苷酸组成，序列表中序列1的核苷酸编码序列表中序列2所示的氨基酸序列。本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码所述单链抗体的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明的所述单链抗体的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码所述单链抗体且抗猪流行性腹泻病毒，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列表的序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。上述任一所述的单链抗体或上述任一所述核酸分子的应用也属于本发明的保护范围。上述任一所述的单链抗体或上述任一所述核酸分子的应用可为b1)或b2)或b3)或b4)：b1)制备用于中和猪流行性腹泻病毒的产品；b2)中和猪流行性腹泻病毒；b3)制备用于预防和/或治疗猪流行性腹泻病毒引起的疾病的产品；b4)预防和/或治疗猪流行性腹泻病毒引起的疾病。上述应用中，所述产品具体可为药物。本发明还保护一种产品，其含有上述任一所述的单链抗体；所述产品的功能可为c1)或c2)：c1)中和猪流行性腹泻病毒；c2)预防和/或治疗猪流行性腹泻病毒引起的疾病。所述产品具体可为药物。上述任一所述猪流行性腹泻病毒具体可为猪流行性腹泻病毒s蛋白。上述任一所述猪流行性腹泻病毒引起的疾病具体可为猪流行性腹泻。实验证明，本发明提供的单链抗体可以中和猪流行性腹泻病毒，在预防和/或治疗猪流行性腹泻中具有重要的应用价值。附图说明图1为三个pcr扩增产物的1.0％琼脂糖凝胶电泳结果。图2为scfv片段甲和scfv片段乙的1.0％琼脂糖凝胶电泳结果。图3为噬菌体单链抗体初级库的鉴定。图4为噬菌体抗体结合活性。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。xli-blue感受态细胞为康为世纪生物科技有限公司的产品。限制性内切酶sfii为美国neb公司的产品。trizol试剂、primescripttmii1ststrandcdnasynthesiskit和dnamakerdl2000均为takara公司的产品。m13k07为invitrogen公司的产品。猪外周血淋巴细胞分离试剂盒为北京索莱宝科技有限公司的产品。pcomb3xss载体为青岛博隆实验动物有限公司的产品。猪流行性腹泻病毒s蛋白为青岛博隆基因工程有限公司的产品。实施例1、噬菌体抗体展示文库的制备一、引物的设计与合成根据猪igg重链(genbank号：am177137、轻链kappa链(genbank号：ay518084)和轻链lambda链(genbank号：af345512)的序列分别设计引物。各个引物的核苷酸序列和扩增片段长度见表1。表1注：斜体部分表示linker，下划线表示限制性内切酶sfii的酶切识别位点。名称中含“for”的表示上游，名称中含“back”的表示下游，vh为重链，vl(kappa)为轻链kappa链，vl(lambda)为轻链lambda链，s为c或g，y为c或y，k为g或t，r为a或g，w为a或t。由生工生物工程(上海)股份有限公司合成表1所示的各个引物。二、外周血淋巴细胞的提取1、取耐过猪流行性腹泻的发病猪，皮下注射猪流行性腹泻疫苗(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所的产品)免疫3次。每次注射剂量为1ml。每次免疫间隔天数为14d。2、完成步骤1后第14d，采集猪外周血。3、将1体积份10ml猪外周血和1—2体积份全血及组织稀释液混匀，然后采用猪外周血淋巴细胞分离试剂盒提取外周血淋巴细胞。三、噬菌体单链抗体初级库的制备1、采用trizol试剂提取步骤二制备的外周血淋巴细胞的总rna。2、以步骤1提取的总rna为模板，按照primescripttmii1ststrandcdnasynthesiskit的操作步骤反转录合成cdna。3、以步骤2合成的cdna为模板，分别采用引物对1(由vhfor和vhback组成)、引物对2(由vl(kappa)for和vl(kappa)back组成)和引物对3(由vl(lambda)for和vl(lambda)back组成)进行pcr扩增，依次得到pcr扩增产物1、pcr扩增产物2和pcr扩增产物3。反应条件：95℃5min；95℃30s，58℃30s，72℃40s，35个循环；72℃延伸10min。4、将pcr扩增产物1进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，回收约400bp的dna片段1。将pcr扩增产物2进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，回收约350bp的dna片段2。将pcr扩增产物3进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，回收约350bp的dna片段3。三个pcr扩增产物的1.0％琼脂糖凝胶电泳结果见图1(m为dnamakerdl2000，泳道1为pcr扩增产物1，泳道2为pcr扩增产物2，泳道3为pcr扩增产物3)。5、取ep管，加入1质量份dna片段1和1质量份dna片段2，混合，得到混合dna甲。取ep管，加入1质量份dna片段1和1质量份dna片段3，混合，得到混合dna乙。以混合dna甲为模板，采用vl(kappa)for和vhback组成的引物对进行pcr扩增，得到的pcr扩增产物即为拼接的scfv片段甲。scfv片段甲的结构式为：vl(kappa)-linker-vh。以混合dna乙为模板，采用vl(lambda)for和vhback组成的引物对进行pcr扩增，得到的pcr扩增产物即为拼接的scfv片段乙。scfv片段乙的结构式为：vl(lambda)-linker-vh。反应条件：95℃5min；95℃30s，58℃30s，72℃40s，共35个循环；72℃延伸10min。6、取scfv片段甲，进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，回收；然后采用限制性内切酶sfii酶切，进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，再次回收，得到dna片段甲。按照上述步骤，将scfv片段甲替换为scfv片段乙，其它步骤均不变，得到dna片段乙。scfv片段甲和scfv片段乙进行1.0％琼脂糖凝胶电泳的结果见图2(m为dnamakerdl2000，泳道1为scfv片段甲，泳道2为scfv片段乙)。7、采用限制性内切酶sfii酶切pcomb3xss载体，回收约3800bp的载体骨架。8、将dna片段甲和载体骨架连接，得到连接产物甲。将dna片段乙和载体骨架连接，得到连接产物乙。9、将200μl连接产物甲和200μl连接产物乙分10次电击转化至xli-blue感受态细胞，将10次得到的菌液混合，命名为混合菌液。每次电击转化的步骤为：取80μlxli-blue感受态细胞，加入20μl连接产物甲和20μl连接产物乙，进行电击转化(电击参数为2.5kv、800ω)，然后用1mlsoc培养基重悬，转移至离心管(规格为50ml)，37℃、220r/min振荡培养1h，得到菌液。将100μl混合菌液均匀涂布于含100μg/ml氨苄霉素的lb固体平板上，检测重组率。检测结果表明，混合菌液的重组率为90％。10、取步骤9的剩余混合菌液，加入氨苄霉素和葡萄糖，得到培养体系；培养体系中，氨苄霉素的浓度为100μg/ml，葡萄糖的浓度为0.02m。将所述培养体系置于37℃培养至od600nm为0.5，先加入20μlm13k07，37℃感染30min；然后37℃、220r/min振荡培养1h，弃培养基，加入等体积含100μg/ml氨苄霉素、50μg/ml卡那霉素、0.1mm/mliptg的soc培养基，37℃、220r/min振荡培养6h。11、完成步骤10后，离心，收集上清液；然后将1体积份上清液和5体积份peg8000混合，4℃过夜；离心，收集沉淀并用1.3mlph7.4、10mm的pbs缓冲液重悬，得到噬菌体单链抗体初级库。四、噬菌体单链抗体初级库的鉴定取1μl噬菌体单链抗体初级库，分别采用引物对1(由vhfor和vhback组成)、引物对2(由vl(kappa)for和vl(kappa)back组成)、引物对3(由vl(lambda)for和vl(lambda)back组成)、通用引物对1(由vl(kappa)for和vhback组成)和通用引物对2(由vl(lambda)for和vhback组成)进行pcr扩增，得到pcr扩增产物。反应条件：95℃5min；95℃30s，58℃30s，72℃40s，35个循环；72℃延伸10min。将各个pcr扩增产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳。结果见图3(m为dnamakerdl2000，泳道1为引物对1，泳道2为引物对2，泳道3为引物对3，泳道4为引物对4，泳道5为引物对5)。五、噬菌体单链抗体初级库滴度的测定取1μl噬菌体单链抗体初级库，加入999μlph7.4、10mm的pbs缓冲液，混匀，得到稀释液1。取10μl稀释液1，加入990μlph7.4、10mm的pbs缓冲液，得到稀释液2；然后10倍比稀释，稀释4～5个梯度。从每个稀释度的溶液中取20μl，加入180μlod600nm值为0.5的菌液中感染15min，然后从中取出20μl涂布在含100μg/ml氨苄霉素的lb固体平板上，计算噬菌体单链抗体初级库的滴度。结果表明，噬菌体单链抗体初级库的滴度为9.5×109pfu/ml。六、噬菌体抗体展示文库的制备取猪流行性腹泻病毒s蛋白(即抗原)，用ph9.6、0.1m的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液稀释，得到浓度为100μg/μl的抗原稀释液。利用抗原抗体结合筛选抗体库。对噬菌体单链抗体初级库进行了3轮“吸附-洗脱-富集”的淘选，并对每一轮的输入和输出噬菌体进行滴度测定。经过淘选，抗体库(即噬菌体抗体展示文库)的滴度比噬菌体单链抗体初级库高了80倍(见表2)，有效的富集了特异性较好的噬菌体。具体步骤如下：1、第1轮选淘(1)取96孔板，每孔加入100μl抗原稀释液，4℃过夜。(2)完成步骤(1)后，取所述96孔板，每孔加入100μl封闭液(将0.05gbsa溶于100mlph7.4、10mm的pbs缓冲液得到)，37℃静置2h。(3)完成步骤(2)后，取所述96孔板，每孔加入100μl噬菌体单链抗体初级库，37℃静置1h。(4)完成步骤(3)后，取所述96孔板，用pbst缓冲液(将8.0gnacl、0.2gkcl、1.15gna2hpo4和0.2gkh2po4溶于去离子水，然后用去离子水定容至1000ml；最后加入100μl吐温20)洗涤3～4遍，最后用elutionbuffer(将0.5gbsa和0.75g甘氨酸溶于100mlddh2o，然后用1m盐酸调节ph至2.2)洗脱，得到洗脱液1。取20μl洗脱液1，测定滴度。2、第2轮和第3轮选淘(1)取剩余的洗脱液1，电击转化至xli-blue感受态细胞，得到菌液。(2)按照步骤1中的(1)至(4)，将噬菌体单链抗体初级库替换为步骤(1)得到的菌液，其它步骤均不变，得到洗脱液2。(3)取20μl洗脱液2，测定滴度。(4)取剩余的洗脱液2，电击转化至xli-blue感受态细胞，得到菌液。(5)按照步骤1中的(1)至(4)，将噬菌体单链抗体初级库替换为步骤(4)得到的菌液，其它步骤均不变，得到洗脱液3。取20μl洗脱液3，测定滴度。洗脱液3即为制备的噬菌体抗体展示文库。表2选淘次数输入噬菌体(pfu)输出噬菌体(pfu)输出/输入11.0×10113.0×1043.0×10-725.0×10103.7×1047.4×10-735.0×10101.2×1062.4×10-5实施例2、检测噬菌体抗体展示文库的结合活性采用elisa方法检测噬菌体抗体展示文库的结合活性。取猪流行性腹泻病毒s蛋白(即抗原)，用ph9.6、0.1m的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液稀释，得到浓度为100μg/μl的抗原稀释液。1、取96孔板，每孔加入100μl抗原稀释液，4℃过夜。2、完成步骤1后，取所述96孔板，每孔加入100μl封闭液(将0.05gbsa溶于100mlph7.4、10mm的pbs缓冲液得到)，37℃静置2h。3、完成步骤2后，取所述96孔板，每孔加入100μl噬菌体抗体展示文库，37℃静置2h。4、完成步骤3后，取所述96孔板，每孔加入100μlhrp标记的抗m13的抗体(作为酶标二抗)，37℃静置1h，最后采用酶标仪检测每孔的od450nm。将步骤3中的“噬菌体抗体展示文库”替换为m13k07，其它步骤均不变，作为阴性对照。将步骤3中的“噬菌体抗体展示文库”替换为ph7.4、10mm的pbs缓冲液，其它步骤均不变，作为空白对照。实验结果发现一株和猪流行性腹泻病毒s蛋白亲和活性较好的抗猪流行性腹泻病毒的单链抗体，其od450nm为0.762(见图4，control为m13k07，clonea为发现的亲和活性较好的抗猪流行性腹泻病毒的单链抗体)。经测序，该抗猪流行性腹泻病毒的单链抗体如序列表中序列1所示。序列表中序列1中，自n末端起第1至107位氨基酸残基为轻链可变区，第108至122位氨基酸残基为连接肽，第123至240位氨基酸残基为重链可变区。<110>青岛博隆基因工程有限公司<120>一种抗猪流行性腹泻病毒的单链抗体及其应用<160>2<170>patentinversion3.5<210>1<211>720<212>dna<213>人工序列<220><223><400>1gccatccagatgacccagtctccagcctccctggctgcatctctcggagacacggtctcc60atcacttgccgggccagtcagagcattagcagttatttagcctggtatcaacaacaacca120gggacggctcctaaacgcttgatctatgctgcatccagtttgcaaagtggggtcccatcc180cggttcaagggcagtggatctggcaccgatttcaccctcaccatcagtggcctgcaggct240gaagatgttgcaacttattactgtttgcagaataataatgtacctccgacgttcggccaa300ggaaccaagctggaactcaaacgggctgatgccaagccatccgtcggtggttcctctaga360tcttcccaggagaagctggtggagtctggaggaggcctggtgcagcctggggggtctctc420agactctcctgtgtcggctctggattcaccttcagtagtacctggattaactgggtccgc480caggctccagggaaggggctggagtggctggcaggcatttatagtagtgcaggtagcacc540gtccactcagactctgtgaagggccgattcaccgtctcaggagacaactcccagaacacg600gcctatctgcaaatgaacagcctgagaaccgaagacacggcccgctattactgtacaaaa660tccaactggtatacgttggatgtctggggcccaggcgttgaggtcgtcgtgtcctcaggc720<210>2<211>240<212>prt<213>人工序列<220><223><400>2alaileglnmetthrglnserproalaserleualaalaserleugly151015aspthrvalserilethrcysargalaserglnserilesersertyr202530leualatrptyrglnglnglnproglythralaprolysargleuile354045tyralaalaserserleuglnserglyvalproserargphelysgly505560serglyserglythraspphethrleuthrileserglyleuglnala65707580gluaspvalalathrtyrtyrcysleuglnasnasnasnvalpropro859095thrpheglyglnglythrlysleugluleulysargalaaspalalys100105110proservalglyglyserserargserserglnglulysleuvalglu115120125serglyglyglyleuvalglnproglyglyserleuargleusercys130135140valglyserglyphethrpheserserthrtrpileasntrpvalarg145150155160glnalaproglylysglyleuglutrpleualaglyiletyrserser165170175alaglyserthrvalhisseraspservallysglyargphethrval180185190serglyaspasnserglnasnthralatyrleuglnmetasnserleu195200205argthrgluaspthralaargtyrtyrcysthrlysserasntrptyr210215220thrleuaspvaltrpglyproglyvalgluvalvalvalsersergly225230235240当前第1页12