本发明涉及生物柴油制备技术领域，特别是涉及一种微藻油脂的提取方法。
背景技术：
微藻具有光合作用效率高、生长速率快、环境适应能力强和油脂产率高等优势，是最有潜力的生物柴油原料。现有技术一般采用有机溶剂萃取法来提取微藻中的油脂。然而，大多数种类的微藻细胞具有纤维素性细胞壁，细胞壁厚且质地坚硬，将微藻油脂包裹在其中，如果直接使用传统有机溶剂萃取微藻油脂，在萃取过程中微藻细胞的细胞壁难以破裂，导致从细胞中释放的微藻油脂量少，造成提取效率偏低。因此，若要进一步提高有机溶剂萃取法对微藻油脂的提取效率，往往需要在萃取前对微藻细胞进行预处理，使微藻细胞壁在萃取时更容易破裂。
现有技术中已出现用酸或碱对微藻细胞进行预处理的方法。微藻细胞壁的主要结构成分是纤维素和半纤维素。硫酸、盐酸等能导致纤维素和半纤维素发生水解，从而降低纤维素和半纤维素的聚合度和结晶度，使微藻细胞壁发生降解因此在萃取过程中更容易破裂。氢氧化钠、氢氧化钾等能削弱纤维素与半纤维素之间的氢键，同样能使微藻细胞壁发生降解。但是，酸或碱会腐蚀生产设备，而且微藻细胞预处理所产生的废水的酸碱浓度下降，难以回收利用，直接排放又会对水体、农田等环境造成污染，必须经过处理才能排放。
离子液体，是指由阴阳离子组成的室温熔盐，其具有不挥发、化学性质稳定、宽电化学电位窗口及性质可调控性等优点。离子液体对生物材料，包括纤维素、半纤维素、木质素等都表现出良好的溶解性，目前已尝试用离子液体对微藻细胞进行预处理。常见的应用较多的是咪唑类、吡啶类离子液体，此类离子液体的主要原料如烷基取代咪唑、烷基取代吡啶等来源于石油，大多是挥发性有机物，并且价格昂贵。离子液体的制备方法有直接合成法、间接合成法、微波合成法、超声波合成法和电化学合成法等，这些制备方法过程复杂，通常需要用到挥发性溶剂，合成过程中易产生污染环境的物质，并且耗能高。有研究表明，离子液体具有毒性并且生物降解性差。以上缺点严重限制了离子液体在微藻细胞预处理中的广泛应用。
技术实现要素：
基于此，本发明的目的在于，提供一种微藻油脂的提取方法，该提取方法选用低共熔溶剂对微藻细胞进行预处理，并结合有机溶剂提取微藻油脂的技术，具有成本低和提取率高的优点。
本发明采用的技术方案如下：
一种微藻油脂的提取方法，包括以下步骤：
(1)预处理：取低共熔溶剂与微藻藻粉混合均匀，室温下搅拌混合液，然后对混合液进行离心分离，将所得固相冷冻干燥后，得到经过预处理的微藻藻粉；所述低共熔溶剂由氢键受体和氢键供体混合加热制得，所述氢键受体为氯化胆碱、甜菜碱和季铵盐中的一种或多种组合，所述氢键供体为多元醇、羧酸类化合物和酰胺类化合物中的一种或多种组合；
(2)油脂提取：将经过预处理的微藻藻粉和有机溶剂加入提取罐中，加热进行提取；
(3)后处理：将油脂提取后所得的提取液冷却至室温，再加入去离子水，搅拌后静置，最后取上层有机相于旋转蒸发器中蒸去有机溶剂，得到微藻油脂。
低共熔溶剂(deepeutecticsolvent,des)是由氢键受体和氢键供体通过氢键作用相互缔合形成的，由于组分间形成的氢键和范德华力阻碍了体系的再结晶，进而降低了体系的熔点，因此低共熔溶剂的熔点低于各组分的熔点，其在常温条件下通常以液态的形式存在，所以预处理可以在室温下进行，方便操作。
在预处理过程中，低共熔溶剂中的氢键受体与纤维素分子链、半纤维素分子链上的羟基形成了氢键作用，使得纤维素和半纤维素的分子间及各自分子内的氢键作用减弱，从而降低了纤维素和半纤维素的聚合度和结晶度，使微藻细胞壁发生降解因此在步骤(2)油脂提取的过程中更容易破裂，更容易释放出微藻油脂，进而有效提高提取率。
本发明选用低共熔溶剂对微藻细胞进行预处理，相比于酸、碱试剂，低共熔溶剂在预处理的离心操作后可直接循环使用，降低了生产成本和后处理成本，相比于离子液体，低共熔溶剂由原料混合加热制得，制备方法简单、耗能低，制备过程中不需要用到挥发性溶剂，并且无副产物产生，因此更绿色环保。本发明提供的微藻油脂的提取方法解决了酸、碱和离子液体预处理微藻的成本偏高和污染环境的难题，具有较高的经济效益和环境效益。
进一步地，步骤(1)中，所述低共熔溶剂中的氢键受体为氯化胆碱，氢键供体为甘油、乙二酸、柠檬酸、乳酸或尿素，所述氢键受体和氢键供体的摩尔比为1:1～3。
氯化胆碱的分子式为hoch2ch2n(ch3)3cl，是常用的低共熔溶剂氢键受体，其来源易得，常作为禽畜饲料添加剂，也是一种植物光合作用促进剂，无毒无害，对环境友好。在预处理中，氯化胆碱中的cl-与纤维素或半纤维素中的羟基氢形成o—h…cl-连接，实现降低纤维素和半纤维素的聚合度和结晶度，使微藻细胞壁发生降解的目的。甘油、乳酸、尿素都是人体和动物的代谢产物，无毒无害。乙二酸、柠檬酸广泛存在与植物体中，无毒无害，对环境友好。
低共熔溶剂的熔点随氢键供体与氢键受体形成氢键的能力增强而降低，与组分间的配比也密切相关。低共熔溶剂的熔点越低，其在室温下的操作温度范围越大，使预处理可以在较宽的室温范围内下进行。此外，低共熔溶剂由于组分之间的氢键作用，流动性降低，其黏度也和组分间的配比有关，如果低共熔溶剂的黏度过大，不利于预处理中离心分离操作的进行及分离效果。本发明通过选用合适的氢键供体和氢键受体，并将氢键受体与氢键供体的配比调整至适宜范围，使低共熔溶剂获得较低的熔点和黏度。
进一步地，步骤(1)中，所述微藻藻粉为小球藻、绿球藻或栅藻。所述微藻藻粉为市售产品或培育所得。
进一步地，步骤(1)中，所述微藻藻粉按质量百分比计的含水率为1％～3％，总脂含量为10％～25％。以干燥的微藻藻粉为原料，能减少水分对预处理过程造成的不良影响。
进一步地，步骤(1)中，所述低共熔溶剂与微藻藻粉的用量比为(5～10)ml低共熔溶剂:1g微藻藻粉，保证有足够的低共熔溶剂与微藻细胞壁作用，同时减少不必要的低共熔溶剂用量，减少离心分离的处理量，降低能耗。
进一步地，步骤(1)中，室温下搅拌混合液的时间为12h～72h，避免处理时间过短，低共熔溶剂对微藻细胞壁的降解效果不足，也避免处理时间过长，微藻细胞壁在预处理时就提前破裂，释放出微藻油脂与低共熔溶剂混合，两者难以分离，不利于微藻油脂的提取。
进一步地，步骤(1)中，冷冻干燥的温度为-80℃～-40℃，时间为24h～48h，既确保微藻藻粉中的油脂品质不被破坏，又能彻底除去水分，避免水分对油脂提取过程造成不良影响。
进一步地，步骤(2)中，步骤(2)中，所述有机溶剂为正己烷、乙酸乙酯、乙醇和甲醇中的一种或多种组合。
进一步地，步骤(2)中，所述有机溶剂与微藻藻粉的用量比为(10～40)ml有机溶剂:1g微藻藻粉，保证有足够的有机溶剂充分萃取微藻油脂，同时减少不必要的有机溶剂用量，减少后处理的处理量，降低能耗。
进一步地，步骤(2)中，加热进行提取的温度为50℃～90℃，时间为0.25h～2.5h，适宜的提取条件有助于提高有机溶剂对微藻油脂的提取率。
具体实施方式
实施例1
制备低共熔溶剂：按1:1的摩尔比将氯化胆碱和尿素混合均匀，在90℃恒温下加热搅拌2h，得到无色透明液体，冷却至室温后得到低共熔溶剂。
微藻油脂的提取按以下步骤进行：
(1)预处理：按5ml低共熔溶剂:1g小球藻藻粉的用量比，取制备好的低共熔溶剂与小球藻藻粉混合均匀，在室温23℃～28℃下磁力搅拌混合液24h，然后以10000rpm的转速对混合液离心处理10min，取下层固相。再用去离子水洗涤下层固相3次，每次洗涤后以6000rpm的转速对洗涤混合液离心处理10min，然后将洗涤好的固相置于-80℃的冷冻干燥机中冷冻干燥48h，得到经过预处理的小球藻藻粉。
(2)油脂提取：按10ml正己烷:1g小球藻藻粉的用量比，将正己烷和经过预处理的小球藻藻粉加入提取罐中，在50℃下提取2h。
(3)后处理：将油脂提取后所得的提取液冷却至室温，再加入去离子水，搅拌10min后静置，最后取上层有机相于旋转蒸发器中蒸去正己烷，得到小球藻油脂。
本实施例中，所用的原料小球藻藻粉按质量百分比计的含水率为1.05％，总脂含量为10.33％，总碳水化合物含量为33.03％。
本实施例的小球藻藻粉油脂提取率为75.52％。
实施例2
制备低共熔溶剂：按1:2的摩尔比将氯化胆碱和甘油混合均匀，在80℃恒温下加热搅拌2h，得到无色透明液体，冷却至室温后得到低共熔溶剂。
微藻油脂的提取按以下步骤进行：
(1)预处理：按25ml低共熔溶剂:1g绿球藻藻粉的用量比，取制备好的低共熔溶剂与绿球藻藻粉混合均匀，在室温23℃～28℃下磁力搅拌混合液24h，然后以10000rpm的转速对混合液离心处理10min，取下层固相。再用去离子水洗涤下层固相3次，每次洗涤后以6000rpm的转速对洗涤混合液离心处理10min，然后将洗涤好的固相置于-80℃的冷冻干燥机中冷冻干燥48h，得到经过预处理的绿球藻藻粉。
(2)油脂提取：按10ml乙酸乙酯:1g绿球藻藻粉的用量比，将乙酸乙酯和经过预处理的绿球藻藻粉加入提取罐中，在50℃下提取2h。
(3)后处理：将油脂提取后所得的提取液冷却至室温，然后加入去离子水，搅拌10min后静置，最后取上层有机相于旋转蒸发器中蒸去乙酸乙酯，得到绿球藻油脂。
本实施例中，所用的原料绿球藻藻粉按质量百分比计的含水率为2.25％，总脂含量为20.58％，总碳水化合物含量为34.18％。
本实施例的绿球藻藻粉油脂提取率为80.90％。
实施例3
制备低共熔溶剂：按1:3的摩尔比将氯化胆碱和乙二酸混合均匀，在70℃恒温下加热搅拌2h，得到无色透明液体，冷却至室温后得到低共熔溶剂。
微藻油脂的提取按以下步骤进行：
(1)预处理：按40ml低共熔溶剂:1g栅藻藻粉的用量比，取制备好的低共熔溶剂与栅藻藻粉混合均匀，在室温23℃～28℃下磁力搅拌混合液72h，然后以10000rpm的转速对混合液离心处理10min，取下层固相。再用去离子水洗涤下层固相3次，每次洗涤后以6000rpm的转速对洗涤混合液离心处理10min，然后将洗涤好的固相置于-80℃的冷冻干燥机中冷冻干燥48h，得到经过预处理的栅藻藻粉。
(2)油脂提取：按10ml乙酸乙酯-乙醇混合溶剂:1g栅藻藻粉的用量比，将乙酸乙酯-乙醇混合溶剂和经过预处理的栅藻藻粉加入提取罐中，在50℃下提取2h。所述乙酸乙酯-乙醇混合溶剂中，乙酸乙酯与乙醇的体积比为1:1。
(3)后处理：将油脂提取后所得的提取液冷却至室温，然后加入去离子水，搅拌10min后静置，最后取上层有机相于旋转蒸发器中蒸去乙酸乙酯-乙醇混合溶剂，得到栅藻油脂。
本实施例中，所用的原料栅藻藻粉按质量百分比计的含水率为3.00％，总脂含量为24.67％，总碳水化合物含量为36.78％。
本实施例的栅藻藻粉油脂提取率为66.92％。
对比例1
本对比例提取微藻油脂省去了步骤(1)预处理，其他步骤、原料、试剂及工艺参数均与实施例1的相同。
本对比例的小球藻藻粉油脂提取率为52.3％。
对比例2
本对比例提取微藻油脂省去了步骤(1)预处理，其他步骤、原料、试剂及工艺参数均与实施例2的相同。
本对比例的绿球藻藻粉油脂提取率为54.83％。
对比例3
本对比例提取微藻油脂省去了步骤(1)预处理，其他步骤、原料、试剂及工艺参数均与实施例3的相同。
本对比例的栅藻藻粉油脂提取率为55.46％。
本发明选用低共熔溶剂对微藻细胞进行预处理，使油脂提取率从不经过预处理时的52.03％～55.46％提高至66.92％～80.90％。
相对于现有技术，本发明提高了微藻油脂提取工艺的环保性和可持续性，其经济效益和环境效益可观。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。