一种快速、大量获得菜心炭疽病菌分生孢子的培养方法与流程

本发明属于植物保护技术领域，涉及一种快速、大量获得菜心炭疽病菌分生孢子的培养方法。

背景技术：

菜心是广东省乃至华南地区最具特色的蔬菜作物之一。在广东及华南地区，许多大型蔬菜基地都以生产菜心为主。由菜心炭疽病菌(也即希金斯炭疽菌colletotrichumhigginsanum)侵染引起的菜心炭疽病是菜心生产上最主要病害，为害菜心叶片造成“麻点”，从而使菜心失去商品价值。防治该病害措施主要是监测菜心炭疽病菌致病力动态、种植抗病菜心品种和发病初期喷施药剂防控，而评价菜心品种的抗病性水平、筛选高活性的杀菌剂和监测病株菌的致病力差异等应用研究，均需要获得大量的菜心炭疽病菌分生孢子。

目前，植物炭疽病菌分子孢子的获得方法主要有3种。(1)植物组织或者煎汁培养基诱导培养，例如将炭疽病菌丝接到干豆荚的果面，培养一段时间后豆荚外面会产生分生孢子。该方法是诱导植物炭疽病菌产分子孢子的主要方法，产孢时间较短，适用范围较广，但是要想获得大量分子孢子需要较多的植物组织(如干豆荚)，操作烦琐。(2)延长病原菌培养时间。将植物炭疽病菌丝置于pda培养基上长时间培养或者使培养基逐渐干燥，可促使炭疽病菌产生孢子。该方法操作简便，但培养时间长，一般需要培养1个月以上的时间。(3)损伤菌丝诱导培养。将植物炭疽病菌接种到在pda培养基上，待菌丝长满培养皿后，用灭菌的手术刀将平板表面的菌落划破，使菌丝体受到损伤，再经过一段时间培养，损伤的菌丝体周围会产生分生孢子。该方法操作简便，但获得分生孢子的时间也较长，一般也要20天以上，且获得的分子孢子量也有限。

技术实现要素：

为了克服现有技术的产孢量少、培养时间长的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种快速、大量获得菜心炭疽病菌分生孢子的培养方法。该方法可在短时间内获得大量分生孢子，用于室内人工接种评价菜心品种的抗病性水平、筛选高活性杀菌剂和监测菜心炭疽病菌致病力差异等应用研究。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种快速、大量获得菜心炭疽病菌分生孢子的培养方法，包括如下步骤：

(1)菜心炭疽病菌分离与培养；

(2)诱导菜心炭疽病菌产生分生孢子：将纯化培养的菌丝块接到无菌、晒干的豇豆荚组织块内，然后将其插入到水琼脂培养基上培养；镜检豇豆荚组织块，若能在豇豆荚组织块表皮镜检到大量的长椭圆形分生孢子，即可初步确定获得了菜心炭疽病菌的分生孢子；将获得的分生孢子接种菜心，确认其对菜心致病并引起典型的炭疽病症状；然后进行单孢分离和纯化培养，从而获得菜心炭疽病菌；

(3)获得大量菜心炭疽病菌分生孢子：取步骤(2)确认为菜心炭疽病菌的分子孢子配制成孢子悬浮液，将孢子悬浮液涂布于pda培养基平板上，放置于超净工作台上吹干；置于27±2℃培养5～10d；然后用无菌水将分生孢子洗下，即获得了大量的菜心炭疽病菌分生孢子。

步骤(1)中所述的菜心炭疽病菌分离与培养，包括如下步骤：

采集菜心炭疽病样，选取带有典型病斑的组织，用清水冲洗干净，在病健交界处剪取组织块；依次在75％的酒精和1％的次氯酸钠溶液中消毒处理后，在无菌水中漂洗3次；用灭菌的滤纸吸去多余的水分，待干燥后放在pda培养基平板上，于27±2℃培养箱中培养；待长出菌丝后，挑取边缘菌丝块进行纯化培养。

所述的组织块为0.3cm×0.5cm大小的组织块。

所述的消毒处理时间为15s～45s，优选为30s。

步骤(2)中所述的培养条件为27±2℃培养4d～7d，优选为27±2℃培养5d。

步骤(2)中所述的豇豆荚组织块为晒干去掉籽的组织块。

步骤(3)中所述的孢子悬浮液浓度为1×10⁴个/ml～1×10⁶个/ml。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)大量产生分生孢子的时间短：从诱导菜心炭疽病菌产生分生孢子到大量获得分生孢子所需的时间为10d～15d。

(2)分生孢子产生量大：用诱导获得的菜心炭疽病菌分生孢子悬浮液再涂布于pda培养基平板上培养，其产生的菌丝体很少，培养产生的基本都是分子孢子，产孢量大。

(3)操作简便：从分离、诱导、纯化培养到大量获得分生孢子的整个流程操作简便，且仅需要超净工作台、恒温培养箱、灭菌锅即可，无需特殊的仪器设备，一般实验室均可实现。

附图说明

图1是大量获得菜心炭疽病菌分生孢子的操作流程图。

图2是菜心炭疽病菌在豇豆荚组织块内的产孢培养图。

图3是菜心炭疽病菌大量产孢时的菌落形态图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

原材料及规格：

豇豆荚：市购稍老一点的豇豆，冲洗干净，40～50℃烘干，然后剪成3～5cm长，去掉籽粒后备用。

实验操作所需要的材料或工具：普通超净工作台、灭菌锅、培养箱、培养皿、移液器、涂布用玻璃棒、pda培养基、蒸馏水、75％酒精和1％次氯酸钠溶液等。

所述的sna(合成低营养琼脂培养基)培养基：1g/lkh2po4，1g/lkno3，0.5g/lmgso4·7h2o，0.5g/lkcl，0.2g/l葡萄糖，0.2g/l蔗糖，15g/l琼脂粉；120℃灭菌20min后备用。

所述的水琼脂培养基：15g/l琼脂粉，120℃灭菌20min后备用。

大量获得菜心炭疽病菌分生孢子的操作流程图，如图1所示。

实施例1对来源于田间菜心炭疽病样中病菌分离和产孢效果

(1)在田间采集典型的菜心炭疽病新鲜病样，清水冲洗干净后剪取病健交界处组织块(约0.3cm×0.5cm)，在超净工作台上分别用75％酒精和1％次氯酸钠溶液各消毒30s，无菌水冲洗三遍后晾干；然后移至pda培养基平板上，27℃培养5d，挑取边缘菌丝块进行纯化培养。

(2)将菌丝块接到无菌、晒干的豇豆荚组织块(去掉籽粒)内，然后将其插入到水琼脂培养基上浸润；27℃培养5d后镜检豇豆荚组织块。若能在豇豆荚组织块表皮镜检到大量的长椭圆形分生孢子，即初步确定为菜心炭疽病菌(希金斯炭疽菌)分生孢子。将获得的分生孢子接种菜心，确认其对菜心致病并引起典型的炭疽病症状；然后进行单孢分离和纯化培养，从而获得菜心炭疽病菌。菜心炭疽病菌在豇豆荚组织块内的产孢培养见图2。

(3)收集菜心炭疽病菌分生孢子，配制孢子浓度为1×10⁵个孢子/ml的孢子悬浮液，用移液枪吸取100μl孢子悬浮液涂布于直径为9cm的pda培养基平板上，在超净工作台上吹干，27℃培养5d；然后用50ml无菌水洗下分生孢子，三层无菌纱布过滤，收集过滤菌液并配制10倍梯度的稀释液，用移液枪吸取1μl的稀释液至于载玻片上，在10倍镜视野下观察分生孢子的数量。当观察到1μl的稀释液中分子孢子的数量为10～30个时，取样20次，计算出1μl稀释液中分生孢子平均数；然后换算成每毫升分生孢子悬浮液的浓度。结果显示，应用本方法，对来源于田间菜心炭疽病样的炭疽菌，获得分生孢子悬浮液的浓度可达1.5×10⁶个孢子/ml。菜心炭疽病菌大量产孢时的菌落形态见图3。

实施例2对中长期保存的菜心炭疽病菌产孢效果

(1)取在sna培养基中10℃保存3年的菜心炭疽病菌，在pda培养基平板上27℃培养5d；待长出菌丝后，将菌丝块接到无菌、晒干的豇豆荚组织块(去掉籽粒)内，然后将其插入到水琼脂培养基上浸润，27℃培养5d；用无菌水洗下豇豆荚组织块表皮的分生孢子。

(2)收集菜心炭疽病菌分生孢子洗出液，配制孢子浓度为1×10⁵个孢子/ml的孢子悬浮液。采用实施例1步骤用(3)的操作方法，获得分子孢子液并计算出分生孢子悬浮液浓度。结果显示，应用本方法，对中长期保存的菜心炭疽病菌，获得分生孢子悬浮液的浓度可达1.2×10⁶个孢子/ml。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。