技术领域：
本发明涉及具有高杀伤力的自然杀伤性细胞高效体外扩增培养方法，属于细胞培养技术领域。
背景技术：
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综合治疗是恶性肿瘤的重要治疗原则,除传统的化疗、放疗及手术等治疗方法外,免疫治疗的地位日益增强。自20世纪80年代，科学家发现淋巴因子激活的自体杀伤细胞(lymphokineactivatedkiller,lak)经大剂量il-2体外扩增后,可治疗恶性肿瘤,由此提出了过继性免疫细胞治疗肿瘤的概念。肿瘤免疫过继治疗中，nk细胞是重要的效应细胞，nk细胞因不需活化即具有细胞毒作用,且抗瘤谱较广而被广泛研究,体外实验证实nk细胞对多种肿瘤细胞具有杀伤作用。然而由于nk细胞的杀伤活性与il-2的剂量高低、体内活化nk的数量及肿瘤表面mhc-ⅰ类抗原的表达高低有关,致使nk细胞在临床应用中的疗效不一，nk细胞杀伤活性对于肿瘤细胞的根除至关重要。研究表明,nk细胞表面有抑制性受体及活化性受体,通过调节其受体的表达可影响nk细胞的杀伤活性。因此,如何提高nk细胞的杀伤活性,提高nk细胞对表达mhc-ⅰ类抗原的肿瘤细胞的识别,成为解决过继免疫治疗效果的关键问题。
目前尚未有真正简单高效的nk细胞扩增方法，这制约着nk细胞的临床应用。因此，对nk细胞的生物学特性及体外扩增的进一步研究，必将对恶性肿瘤的临床免疫过继治疗产生巨大的推动作用。nk细胞由于无需抗原预先致敏即可直接杀伤靶细胞,且不具有“mhc限制性”,而肿瘤细胞往往缺乏mhc-ⅰ类分子的有效表达,故nk细胞是肿瘤免疫治疗中的一个重要部分。除了nk细胞获得性免疫治疗,增强nk细胞活性和探索nk细胞介导的间接或直接抗肿瘤免疫联合治疗是未来nk细胞肿瘤免疫治疗的研究方向。目前,增强nk细胞活性的策略可以是通过细胞因子、多功能抗体介导nk细胞活性,通过调节抑制性信号和活化性信号传递促进nk活化,或通过免疫药物及基因修饰提高nk细胞功能等。
尽管近年来nk细胞体外大规模扩增取得了较大进展，已有的扩增方案仍然需要进一步优化，并通过大量体内、体外的试验对新的扩增方案进行评估。与传统使用il-2短期培养nk细胞不同，大规模长期扩增nk细胞所需的硬件设施和软件管理需要符合现行的药品生产质量规范(goodmanufacturingpractice，gmp)，培养的细胞需要经过严格的细菌和真菌水平检验，以控制nk细胞产品的安全。在nk细胞应用于肿瘤患者之前，还需要检测nk细胞受体和杀伤功能的变化。目前nk细胞免疫治疗面临的挑战还包括：如何增强体外扩增的nk细胞对肿瘤的识别和浸润，如何提高nk细胞在体内的存活率。我们仍需要进一步研究更新的扩增方案，提高扩增nk细胞的数量和功能，为nk细胞免疫治疗清除最终的障碍。
技术实现要素：
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针对上述问题，本发明要解决的技术问题是提供的具有高杀伤力的自然杀伤性细胞高效体外扩增培养方法。
本发明的具有高杀伤力的自然杀伤性细胞高效体外扩增培养方法为：步骤一：配置培养基，每100mlmem-a培养基加入5ml血浆，加入il-210u/ml，il-15100u/ml，il-2110u/ml，以及scf50ng/ml，包被培养瓶，将纤黏蛋白用pbs或生理盐水稀释至0.1mg/ml，吸取5ml加入10cm培养皿中，在4℃包被过夜后，将残留液体吸出，待用；
步骤二：取样：取5ml-10ml静脉血或者脐血，活率≥90％，用于制备单个核细胞，取5ml-10ml淋巴细胞分离液，小心转移静脉血至分离液之上，轻柔操作避免打破交界液面，在1800r/min下，离心15min，吸取上层液体即血浆层，用于后期细胞培养，小心吸取中间白膜层，即单个核细胞层，转移至新离心管中；
步骤三：单个核细胞用500u/ml双抗的pbs，400g离心10min，充分漂洗3遍，接种在0.1mg/ml纤黏蛋白铺底的10cm培养皿中，将分离获得的单个核细胞按1.0-2.0×106个/ml的浓度接种于包被过的细胞培养皿中，放置在37℃下，5％的co2的饱和湿度的培养箱内培养；
步骤四：第2-6天，观察培养基颜色并计数，每2-3天补加新鲜培养基，含5％自的体血浆，调整nk细胞密度为1.0-2.0×106个/ml；
步骤五：第7天后，可将自体血浆含量降低1％，根据细胞培养悬液体积选择扩瓶，t75培养瓶最大体积40ml，t175培养瓶最大体积200ml，利用流式细胞术检测cd3-cd56+细胞比例，此类细胞为nk细胞；
步骤六：纯化nk细胞，每107细胞加入90μlpbs.加入10μlcd56microbeads，混匀，4-8℃，15min，此后，加入1-2mlpbs，在1500r/min，4℃离心5min,弃上清，每108细胞用500μlpbs重悬，将ls/ms柱子安装到磁铁上，加入3mlpbs，重力作用自然流尽，将细胞液加入到柱子中，用3mlpbs洗脱三次，利用ls/ms柱子活塞，推出结合在磁珠上的细胞，为纯化的cd56+nk细胞；
步骤七：利用无血清冻存液将纯化的cd56+nk细胞冻存于液氮中。
本发明的有益效果：此种自然杀伤性细胞高效体外扩增培养方法取材容易、少量外周血或脐血即可获取大量具有活性的nk细胞、适宜大规模培养、对机体损伤小等优点，并且取材来源广泛，体内储备量大，适宜自体治疗，无免疫原性。它的培养过程较为简单，操作容易，适合肿瘤疾病的辅助治疗。
具体实施方式：
本具体实施方式采用以下技术方案：所述的具有高杀伤力的自然杀伤性细胞高效体外扩增培养方法为：步骤一：配置培养基，每100mlmem-a培养基加入5ml血浆，加入il-210u/ml，il-15100u/ml，il-2110u/ml，以及scf50ng/ml，包被培养瓶，将纤黏蛋白用pbs或生理盐水稀释至0.1mg/ml，吸取5ml加入10cm培养皿中，在4℃包被过夜后，将残留液体吸出，待用；
步骤二：取样：取5ml-10ml静脉血或者脐血，活率≥90％，用于制备单个核细胞，取5ml-10ml淋巴细胞分离液，小心转移静脉血至分离液之上，轻柔操作避免打破交界液面，在1800r/min下，离心15min，吸取上层液体即血浆层，用于后期细胞培养，小心吸取中间白膜层，即单个核细胞层，转移至新离心管中；
步骤三：单个核细胞用500u/ml双抗的pbs，400g离心10min，充分漂洗3遍，接种在0.1mg/ml纤黏蛋白铺底的10cm培养皿中，将分离获得的单个核细胞按1.0-2.0×106个/ml的浓度接种于包被过的细胞培养皿中，放置在37℃下，5％的co2的饱和湿度的培养箱内培养；
步骤四：第2-6天，观察培养基颜色并计数，每2-3天补加新鲜培养基，含5％自的体血浆，调整nk细胞密度为1.0-2.0×106个/ml；
步骤五：第7天后，可将自体血浆含量降低1％，根据细胞培养悬液体积选择扩瓶，t75培养瓶最大体积40ml，t175培养瓶最大体积200ml，利用流式细胞术检测cd3-cd56+细胞比例，此类细胞为nk细胞；
步骤六：纯化nk细胞，每107细胞加入90μlpbs.加入10μlcd56microbeads，混匀，4-8℃，15min，此后，加入1-2mlpbs，在1500r/min，4℃离心5min,弃上清，每108细胞用500μlpbs重悬，将ls/ms柱子安装到磁铁上，加入3mlpbs，重力作用自然流尽，将细胞液加入到柱子中，用3mlpbs洗脱三次，利用ls/ms柱子活塞，推出结合在磁珠上的细胞，为纯化的cd56+nk细胞；
步骤七：利用无血清冻存液将纯化的cd56+nk细胞冻存于液氮中。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。