一种重组菌株及其应用和制备9‑氟甾体激素前体的方法与流程

本发明涉及基因工程
技术领域：
，更具体的说是涉及一种重组菌株及其应用和制备9-氟甾体激素前体的方法。
背景技术：
：甾体激素药物作为抗生素之后的第二大类药物广泛用于治疗和预防许多疾病，例如消炎，利尿，避孕，促孕，抗雄激素和抗癌剂等。甾药的高需求促生了另一重要产业的蓬勃发展—甾药中间体(甾药前体)的提取与制备。微生物法制备甾药前体的工艺因其环境污染小，反应步骤少、产品损失低、收率高等突出优势，广泛应用于工业生产。近年来，通过微生物的生物转化对甾体化合物进行脱氢、氧化、羟化及侧链切割等反应而获得多种药物中间体。例如，9β,11β-环氧-17α,21-二羟基-16β-甲基孕-1,4-二烯-3,20-二酮(式ⅳ)是生产9-氟甾体激素(如地塞米松，倍他米松，曲安西龙等)的关键前体，以9β,11β-环氧-17α,21-二羟基-16β-甲基孕-4-烯-3,20-二酮-21-醋酸酯(式ⅰ)为底物合成ⅳ是工业化生产ⅳ的重要方法。但是关于9(11)-环氧甾体生物转化的研究还未见报道，反应机制也没有完全阐明。目前，对于甾体化合物的生物转化大多都基于基因工程改造的微生物或分离纯化的酶催化。这些方法可以使甾体化合物的转化率有一定的提高，但甾体底物溶解度差、微生物发酵过程染菌以及分离纯化酶的高成本都是制约其工业应用的关键问题。技术实现要素：有鉴于此，本发明的目的在于提供一种重组菌株，使得所述重组分支杆菌能够显著提高9β,11β-环氧-17α,21-二羟基-16β-甲基孕-1,4-二烯-3,20-二酮的转化率；本发明的另一个目的在于提供所述重组菌株在生产9β,11β-环氧-17α,21-二羟基-16β-甲基孕-1,4-二烯-3,20-二酮中的应用；本发明的第三个目的在于提供基于所述重组菌株生产9β,11β-环氧-17α,21-二羟基-16β-甲基孕-1,4-二烯-3,20-二酮中的方法。为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：一种重组菌株，在分枝杆菌或大肠杆菌中转化有包含kstd、kstd3、kstdm中一种或两种以上基因的质粒；或在分枝杆菌或大肠杆菌基因组上整合有kstd、kstd3、kstdm中一种或两种以上基因。针对现有甾体化合物的生物转化工艺中缺少以9β,11β-环氧-17α,21-二羟基-16β-甲基孕-4-烯-3,20-二酮-21-醋酸酯(式ⅰ，以下简称ⅰ)为底物合成9β,11β-环氧-17α,21-二羟基-16β-甲基孕-1,4-二烯-3,20-二酮(式ⅳ，以下简称ⅳ)的方法，本发明通过在分枝杆菌或大肠杆菌中转化表达kstd、kstd3和kstdm基因的质粒，以重组菌株的细胞裂解液进行生物转化，最终获得具有较高转化率的甾药前体ⅳ。作为优选，所述kstd、kstd3、kstdm均来源于新金分枝杆菌mycobacteriumneoaurum。在本发明具体实施过程中，所述kstd、kstd3均来源于新金分枝杆菌mycobacteriumneoaurumatcc25795(kstdgenbankid：gq476982，kstd3genbankid：kf772210)，序列分别如seqidno:1和seqidno:2所示。所述kstdm来源于新金分枝杆菌mycobacteriumneoaurumnwib-01(kstdmgenbankid：gq228843)，序列如seqidno:3所示。本发明中所转化的质粒可使用本领域各种常用质粒，在具体实施过程中，本发明所述质粒采用商用pmv261质粒，购于biosci公司。在本发明具体实施过程中，所述分枝杆菌为保藏编号为cgmccno.13532的分枝杆菌，分类命名为mycobacteriumsp.，于2017年1月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。所述大肠杆菌为大肠杆菌bl21(de)，可购买或根据本领域常规构建方法构建获得。采用本发明所述重组菌株的细胞裂解液对底物ⅰ进行转化，重组分枝杆菌可获得至少60％转化率的ⅳ，在对反应体系的缓冲液ph值优化后，ⅳ的转化率最高可达到90％以上。重组大肠杆菌可获得至少45％转化率的ⅳ，在最高可达到80％左右。基于上述优异的技术效果，本发明提出了所述重组菌株或/和其细胞裂解液在制备以9β,11β-环氧-17α,21-二羟基-16β-甲基孕-4-烯-3,20-二酮-21-醋酸酯为底物合成9β,11β-环氧-17α,21-二羟基-16β-甲基孕-1,4-二烯-3,20-二酮中的应用。与此同时，基于所述重组菌株在生物转化方面的优异表现，本发明还提供了一种制备9-氟甾体激素前体(即ⅳ)的方法，包括：步骤1、制备所述重组菌株的细胞裂解液；步骤2、向步骤1中的细胞裂解液加入底物9β,11β-环氧-17α,21-二羟基-16β-甲基孕-4-烯-3,20-二酮-21-醋酸酯进行反应，获得β,11β-环氧-17α,21-二羟基-16β-甲基孕-1,4-二烯-3,20-二酮。其中，作为优选，步骤1包括：步骤1.1、将所述重组菌株进行扩繁，然后加入氢化可的松诱导培养，收集菌体用缓冲液(如pbs)洗涤并重悬；步骤1.2、将重悬后的菌体细胞超声破碎，获得所述重组菌株的细胞裂解液。在本发明具体实施过程中，步骤1.1为：将所述重组菌株接种于5ml液体培养基(甘油10g/l、酵母提取物10g/l、磷酸氢二铵1.5g/l、磷酸氢二钾0.5g/l、磷酸二氢钾0.5g/l、吐温802.5g/l、无水硫酸镁10g/l、硫酸亚铁0.5g/l、硫酸锌0.2g/l，ph7.2-7.3；固体培养基添加15g/l琼脂粉)中30℃过夜培养，然后转移至50ml新鲜液体培养基中，在30℃、200r/min培养至od600为0.5-0.6，然后添加终浓度为0.1g/l的氢化可的松在30℃、200r/min诱导培养24h，收集菌体pbs缓冲液洗涤并重悬至od600为2.0。在本发明具体实施过程中，所述缓冲液的ph值为6、6.5、7、7.5或8，所述pbs缓冲液可采用kh2po4/k2hpo4体系的pbs缓冲液，通过调整两者的比例来控制缓冲液的ph值。在对ph值的试验中发现，缓冲液ph值对转化率有明显的影响，其中以ph值为7.5时转化率最高。在本发明具体实施过程中，步骤1.2为：将重悬后的菌体细胞在500w功率下超声破碎，以每破碎5s间歇5s的方式进行，共20min，全程冰上操作，获得所述重组菌株的细胞裂解液。作为优选，步骤2为：向步骤1中的细胞裂解液加入底物9β,11β-环氧-17α,21-二羟基-16β-甲基孕-4-烯-3,20-二酮-21-醋酸酯、pms(吩嗪硫酸甲酯)和助溶剂(如乙醇、n,n-二甲基甲酰胺、tween80或tween20)在摇床上进行反应，获得β,11β-环氧-17α,21-二羟基-16β-甲基孕-1,4-二烯-3,20-二酮。在本发明具体实施过程中，步骤2为：向步骤1中的细胞裂解液加入终浓度为1g/l的底物9β,11β-环氧-17α,21-二羟基-16β-甲基孕-4-烯-3,20-二酮-21-醋酸酯，2.5mm的pms和7％的乙醇，在30℃、200r/min摇床上进行反应，获得β,11β-环氧-17α,21-二羟基-16β-甲基孕-1,4-二烯-3,20-二酮。此外，本发明还通过试验首次确定了由底物ⅰ转化为产物ⅳ的反应机理(本申请相关内容非公知常识和现有技术)，在确认正确的反应机理前，对于由底物ⅰ转化为产物ⅳ，本发明推测可能存在以下两种反应途径：经过试验验证，在生物转化时底物ⅰ先转化为ii，然后转化为产物ⅳ。由以上技术方案可知，本发明通过引入外源基因kstd、kstd3和kstdm，构建重组分枝杆菌或大肠杆菌，并使用重组菌株细胞裂解液生产甾药前体，所获得的9β,11β-环氧-17α,21-二羟基-16β-甲基孕-1,4-二烯-3,20-二酮具有极高转化率，同时阐明了生物转化的反应机理，为将来的工业化生产提供理论依据。生物材料保藏信息说明ms136，分类命名为分枝杆菌mycobacteriumsp.，于2017年1月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmccno.13532。附图说明图1所示为重组质粒pmv261-kstd的构建示意图；图2所示为kstd、kstd3和kstdm的琼脂糖凝胶电泳验证结果；其中，泳道1-3依次对应kstd、kstd3和kstdm；图3所示为分枝杆菌出发菌和重组菌的转化率比较图；图4所示为大肠杆菌重组菌的转化率比较图；图5所示为ph值对产物ⅳ转化率的影响；图6所示为分枝杆菌出发菌细胞裂解液转化ⅳ的产物生成曲线；图7所示为分枝杆菌出发菌株细胞裂解液转化ⅰ的产物生成曲线；图8所示为磷酸盐缓冲液转化ⅰ的产物生成曲线；图9所示为分枝杆菌细胞裂解液转化ⅰ和ⅱ的产物生成曲线。具体实施方式本发明公开了一种重组菌株及其应用和制备9-氟甾体激素前体的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述菌株、方法和应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文所述的菌株、方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。下面结合实施例，进一步阐述本发明。实施例1：重组质粒的构建1、kstd、kstd3、kstdm基因的合成将三个基因通过genewiz公司合成，以商品化质粒puc57作为承载载体，分别命名为puc57-kstd，puc57-kstd3，puc57-kstdm。2、重组质粒pmv261-kstd、pmv261-kstd3和pmv261-kstdm的构建如图1所示，以pmv261-kstd的构建为例，以合成的质粒puc57-kstd为模板，按照表1的引物扩增各目的基因片段并纯化回收。所得pcr产物kstd基因片段分别与线性化的pmv261载体(hindiii和bamhi限制性酶切)通过gibsonassembly无缝连接法组装在一起，从而构建重组质粒pmv261-kstd，使基因片段置于hsp60启动子的控制下。重组质粒pmv261-kstd3和pmv261-kstdm的构建方法相同。表1pcr引物表primerssequences(5’-3’)kstd-fcccgatccggaggaatcacggatccatgaccaccgaaaccgctggkstd-raactacgtcgacatcgataagcttttaagacggctgagcagattckstd3-fcccgatccggaggaatcacggatccatgtctgactctgacctggaattckstd3-rtaactacgtcgacatcgataagcttttattcagcagaagactgggtagckstdm-fcccgatccggaggaatcacggatccatgttctacatgaccgctcaggkstdm-rtaactacgtcgacatcgataagcttttaagctttaccagccaggtgcpmv261-fcagcgaggacaacttgagccgtpmv261-racatcagagattttgagacaca3、重组质粒的验证kstd、kstd3和kstdm的基因长度分别为1200bp、1560bp和1713bp，以合成的质粒为模板进行扩增pcr，产物经1％琼脂糖电泳检测，在2000bp以下可见三条明显的特异性条带(图2)，与目的片段的大小位置相符。将目的基因连接到载体pmv261上，转入e.colidh5α中，提取重组质粒pmv261-kstd、pmv261-kstd3和pmv261-kstdm，采用质粒测序引物pmv261-f和pmv261-r进行pcr验证和测序验证，结果表明各重组质粒构建成功。实施例2：重组菌株的构建1、重组分枝杆菌的构建将菌体用无菌水洗2次，5000r/min离心，最终重悬于无菌水中。利用电转化法分别将重组质粒pmv261-kstd，pmv261-kstd3和pmv261-kstdm导入保藏编号为cgmccno.13532的宿主菌株mycobacteriumsp.ms136，电转化条件：电压1.8kv，电击杯孔径1mm，电击两次；确认电击频率(4-5ms)-1范围，电击处理后的感受态于冰上放置5min，利用终浓度为50μg/ml卡那霉素抗性平板筛选转化子，获得三种重组分枝杆菌ms136-kstd，ms136-kstd3，ms136-kstdm。2、重组大肠杆菌的构建方法与1相同，宿主菌株更换为大肠杆菌bl21(de3)，获得三种重组大肠杆菌bl21(de3)-kstd，bl21(de3)-kstd3，bl21(de3)-kstdm。实施例3：制备重组菌株的细胞裂解液将实施例2中的各重组菌株分别接种于5ml液体培养基(甘油10g/l、酵母提取物10g/l、磷酸氢二铵1.5g/l、磷酸氢二钾0.5g/l、磷酸二氢钾0.5g/l、吐温802.5g/l、无水硫酸镁10g/l、硫酸亚铁0.5g/l、硫酸锌0.2g/l，ph7.2-7.3；固体培养基添加15g/l琼脂粉)中30℃过夜培养，然后转移至50ml新鲜液体培养基中，在30℃、200r/min培养至od600为0.5-0.6，然后添加终浓度为0.1g/l的氢化可的松在30℃、200r/min诱导培养24h，收集菌体用ph为6-8的pbs缓冲液(kh2po4/k2hpo4)洗涤并重悬至od600为2.0。将重悬后的菌体细胞在500w功率下超声破碎，以每破碎5s间歇5s的方式进行，共20min，全程冰上操作，如果破碎后的细胞出现混浊现象，应重复超声操作，获得所述重组菌株的细胞裂解液。实施例4：重组菌株细胞裂解液的生物转化试验1、反应过程向实施例3中的各细胞裂解液中加入终浓度为1g/l的底物9β,11β-环氧-17α,21-二羟基-16β-甲基孕-4-烯-3,20-二酮-21-醋酸酯，2.5mm的pms和7％的乙醇，在30℃、200r/min摇床上进行反应，获得β,11β-环氧-17α,21-二羟基-16β-甲基孕-1,4-二烯-3,20-二酮。2、底物i、过渡产物ⅱ/ⅲ和产物ⅳ的检测反应液混匀后，迅速吸取适量，用稀释剂(乙腈∶水＝5∶5)稀释10倍后经0.25μm滤膜过滤，取滤液上紫外液相检测。色谱条件：色谱柱：bdshypersilc18色谱柱(150mm×4.6mm，5μm)；检测器：waters2489uv/vis；泵：waterse2695；流动相：乙腈∶水＝3∶7；柱温：40℃；检测波长为240nm；流速1.2ml/min。定量方法：使用相同的色谱条件测定标准品的标准溶液，绘制浓度-峰面积标准曲线，对反应液中目标物质定量。用生成产物的摩尔数除以底物的摩尔数即可得生成物的转化率。3、结果对分枝杆菌重组菌株ms136-kstd，ms136-kstd3，ms136-kstdm细胞裂解液的转化特性进行研究，考察其对ⅰ的转化效率，用hplc法检测产物ⅳ的生成情况，同时以导入pmv261空白载体的出发菌株(即ms136)细胞裂解液作对照。如图3所示，1g/l底物ⅰ在ph7.0(pbsph值)的分枝杆菌细胞裂解液中反应45h后，重组菌株ms136-kstd，ms136-kstd3和ms136-kstdmⅳ的转化率分别为60.6％，69.5％和78.4％，出发菌株ⅳ的转化率为56.8％，最多提高了38.9％。以上数据表明过表达kstd基因(特别是kstdm)后，可实现ⅳ大量积累，显著提高其转化率。对大肠杆菌重组菌株bl21(de3)-kstd，bl21(de3)-kstd3，bl21(de3)-kstdm细胞裂解液的转化特性进行研究，考察其对ⅰ的转化效率，用hplc法检测产物ⅳ的生成情况。如图4所示，1g/l底物ⅰ在ph7.5(pbsph值)的大肠杆菌细胞裂解液中反应45h后，重组菌株bl21(de3)-kstd，bl21(de3)-kstd3，bl21(de3)-kstdmⅳ的转化率分别为48.7％，71.6％和79.5％。大肠杆菌bl21(de3)本身并不能将底物ⅰ转化为产物ⅳ，而本发明重组大肠杆菌能够实现生物转化并具有较高的转化率。实施例5：重组菌株细胞裂解液的ph值的影响在制备重组菌株细胞裂解液时所采用的缓冲液的ph不同会影响底物ⅰ的转化。本实施例对比了重组菌株ms136-kstdm细胞裂解液ph值分别为6，6.5，7，7.5，8时ⅳ的转化率，反应条件为底物投料量1g/l反应45h(参照实施例4)。由图5可知，ph7.5最佳，此时ⅳ的转化率达到92.8％。实施例6：底物ⅰ转化为产物ⅳ的机理研究1、比较全细胞转化法与细胞裂解液转化法(1)全细胞转化法：将mycobacteriumsp.ms136(未经重组)细胞接种于5ml液体培养基中，30℃过夜培养。转接到另一装有50ml液体培养基的250ml锥形瓶中，30℃、200r/min培养5h(od600达到0.5-0.6)，添加终浓度为0.1g/l的诱导剂氢化可的松，30℃200r/min培养24h。10000rpm离心5min收集菌体，用ph7.0的0.2m磷酸盐缓冲液(pbs)洗涤两次后重悬菌体至od600达到2.0。取50ml细胞悬浮液转入250ml锥形瓶中，加入1g/lⅰ、2.5mmpms和7％乙醇，30℃、200r/min反应。(2)细胞裂解液转化法：参照实施例3和4方法，区别在于使用未经重组的出发菌株mycobacteriumsp.ms136。(3)结果表2中，利用分枝杆菌ms136全细胞转化1g/l底物ⅰ反应45h，底物ⅰ只残余5％的量，对产物ⅱ的转化率为60.3％，反应体系中检测不到产物ⅳ的积累；表明分枝杆菌ms136菌株有可能将底物ⅰ水解后进一步代谢，导致产物ⅳ无法积累。而细胞裂解液转化1g/l底物ⅰ反应45h，底物ⅰ残余量为20％，反应体系中产物ⅳ转化率为56.8％。由图6可知，1g/l底物ⅳ在细胞裂解液中反应45h后，ⅳ剩余0.94g/l，说明以ⅳ为底物时，细胞裂解液不能将其进一步降解。表2全细胞与细胞裂解液以ⅰ为底物的转化情况转化45h全细胞转化法细胞裂解液转化法ⅰ(g/l)0.0520.204ⅱ(g/l)0.5190.054ⅲ(g/l)ntntⅳ(g/l)nt0.4852、研究分枝杆菌细胞裂解液转化底物ⅰ的反应机制(1)1g/l底物ⅰ在ph7.0的分枝杆菌细胞裂解液中反应，分别在2h，5h，10h，21h，33h、45h和76h取样，检测产物的生成情况。如图7所示，产物ⅳ随时间不断增加，45hⅳ的转化率达到最高值56.8％，而ⅱ的转化率始终较低。在产物中始终未检测到ⅲ，说明分枝杆菌细胞裂解液转化ⅰ的反应顺序是ⅰ、ⅱ、ⅳ。(2)1g/l底物ⅰ在ph7.0的pbs中反应，只有产物ⅱ的生成，45h后，ⅱ的转化率为6.7％(如图8)。说明ⅰ转化为ⅱ(c-21脱乙酰化反应)是自发进行的，而ⅱ转化为ⅳ(c1,2脱氢反应)是需要分枝杆菌或本发明分枝杆菌重组菌的催化作用。(3)分枝杆菌细胞裂解液分别以ⅰ和ⅱ为底物进行生物转化，如图9所示，45hⅳ的转化率几乎相同(分别是56.8％和57.3％)。以上数据说明在分枝杆菌细胞裂解液转化ⅰ的反应中：1)反应顺序为ⅰ自发水解形成ⅱ，ⅱ经催化为ⅳ；2)从ⅱ到ⅳ的c1,2催化反应是关键步骤。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。sequencelisting<110>天津大学<120>一种重组菌株及其应用和制备9-氟甾体激素前体的方法<130>mp1708696<160>3<170>patentinversion3.3<210>1<211>1200<212>dna<213>人工序列<400>1catatgatgaccaccgaaaccgctggtatccgtgaaatcgacaccggtgacctgccggac60cgttacgctcgtggttggcactgcctgggtccggttaaagactacctggacggtaaacca120cacggtgttgaaatcttcgacactatgctggttgtgttcgcagactctgaaggtgaactg180aaagttctggacggttactgccgtcacatgggtggtaacctggctcagggtaccatcaaa240ggtgacaccgttgcttgcccgttccacgactggcgttggggtggtgacggtaaatgcaaa300ctggttccgtacgctaaacgtaccccgcgtctggctcgtacccgtgcttggcacaccgac360gttcgtggtggtctgctgttcgtttggcacgaccacgaaggtaacccgccgcagccggaa420gttcgtatcccggaaatcccggaattcgcttctgacgactggaccgactggcgttggaac480accatgctgatcgaaggttctaactgccgtgaaatcatcgacaacgttaccgacatggct540cacttcttctacatccactacggtctgccgacctacttcaaaaacgttttcgaaggtcac600atcgcttctcagtacctgcacaacgttggtcgtccggacgttaacgacctgggtaccacc660tacggtgaagctcacctggactctgaagctagttacttcggtccgtctttcatgatcaac720tggctgcacaacaactacggtggtttcaaagctgaatctatcctgatcaaccgtcactac780ccggtttcgcaggacagcttcgttctgcagtggggtgttatcgttgaaaaaccgaaaggt840ctggacgaaaaaaccaccgacaaactggctcgtgttttcacagagggtgtaagcaaaggt900ttcctgcaggacgttgaaatctggaaacacaaaacccgtatcgacaaaccgctgctggtt960gaagaagacggtgctgtttaccagatgcgtcgttggtaccagcagttctacgttgacgtt1020gctgacgttaccccggacaccaccgaccgtttcgaaatggaagttgacaccaccatcgct1080aacgaaaaatggcacgttgaagttgaagaaaacctgaaactgcagcaggacgctgctgaa1140caggacgctgctgaacagggtgaaccgcagaaagaatctgctcagccgtcttaaggatcc1200<210>2<211>1560<212>dna<213>人工序列<400>2catatgatgtctgactctgacctggaattcgacgttatcgttgctggttctggtggtggt60ctggctggtgcttacaccgctgctcgtgaaaacctgtctgttctgctggttgaagctacc120gacctgttcggcggcaccaccagcttctctggtggtggcggtatgtggttcccgtgcaac180ccggttctgcagcgtgctggtaccgacgacaccatcgacaaagctctgacctacttccac240gctgttgttggtgaacgtaccccgcgtgaactgcaggacgcttacgttcgtggtggtgct300aaactgatcgaatacctggaacaggacccggctttcgaattcaccgctctgccgtggccg360gactactacggtaccgctccggaagctcgtaccgacggttaccgtcacaccatcccgctg420ccggttccggacgctgctctgggtaaatacgctggtctggttcgtggtccgctggacacc480gaacgtctgggtgctgaagctccggacctgctggttggtggtcgtgctctggttggtcgt540ttcctggctgctctggacaaactgccgaccgttacctgctggctgaacgctccgctggtt600gacctgatcaccgaaaacggtcgtgttgttggtgctgttatcgaacgtgacggtgctccg660gttcgtgttaccacccgtcgtggtgttctgctggcttctggtggtttcgaacagaacgct720gaaatgcgtgctgaatacggtgttccgggtcacgctaccgactctatgggtggtccgggt780tctaccggtcgtgctcaccgtgctgctatcgctgttggtgctgacgttgacctgatggac840caggcttggtggtctccgggtatgacccacccggacggtcgttctgctttcgctctgtgg900ttcaccggtggtatcttcgttaaccagcagggtcgtcgtttcgttaacgaatctgctccg960tacgaccgtatcggtcgtgacatcatcgaccagatgcagaacggttctacccgtctgccg1020ttctggatgatctacgacaaccgtgacggtgacatcccgccggttaaagctaccaacgtt1080tctatggttgaaccggaaaaataccgtaccgctggtctgtggcactctgctgacaccctg1140gctgaactggctggtgctatcggtgttccggctgctgaactggaagctaccgttgctcgt1200tacaacgaactggctgctaccggtatcgacgacgacttcggtcgtggtggtgaagcgtat1260gaccgtgcgttctctggtggtgagtctccgatggttccgctggacaccccgccgtaccac1320gctgctgttttcggtctgtctgacctgggtaccaaaggtggtctgcgtaccgacacccac1380gctcgtgttctggacgctgacggtgctgctatcccgggtctgtacgctgctggtaacacc1440atggctgctgtttctggtaccacctacccgggtggtggtaacccgatcggtgcttctatg1500ctgttctctcacctggctgctctggacatggctacccagtcttctgctgaataaggatcc1560<210>3<211>1713<212>dna<213>人工序列<400>3catatgatgttctacatgaccgctcaggactactctgttttcgacgttgttgttgttggt60tctggtgctgctggtatggttgctgctctgaccgctgctcaccagggtctgtctaccgtt120gttgttgaaaaagctccgcactacggtggttctaccgctcgttctggtggtggtgtttgg180ataccgaacaacgaagttctgcagcgtgacggtgttaaagacaccccggctgaagctcgt240aaatacctgcacgctatcatcggtgacgttgttccggctgaaaaaatcgacacctacctg300gaccgttctccggaaatgctgtctttcgttctgaaaaactctccgctgaaactgtgctgg360gttccgggttactctgactactacccggaaaccccgggtggtaaagctaccggtcgttct420gttgaaccgaaaccgttcaacgctaaaaaactgggtccggacgaaaaaggtctggaaccg480ccgtacggtaaagttccgctgaacatggttgttctgcagcaggactacgttcgtctgaac540cagctgaaacgtcacccgcgtggtgttctgcgttctatcaaagctggtgttcgttctgtt600tgggctaacgctaccggtaaaaacctggttggtatgggtcgtgctctgatcgctccgctg660cgtatcggtctgcagaaagctggtgttccggttctgctgaacaccgctctgaccgacctg720tacctggaagacggtgttgttcgtggtatctacgttcgtgaagctggtgctccggaatct780gctgaaccgaaactgatccgtgctcgtaaaggtgttatcctgggttctggtggtttcgaa840cacaaccaggaaatgcgtaccaaataccagcgtcagccgatcaccaccgaatggaccgtt900ggtgctgttgctaacaccggtgacggtatcgttgctgctgaaaaactgggtgctgctctg960gaactgatggaagacgcttggtggggtccgaccgttccgctggttggtgctccgtggttc1020gctctgtctgaacgtaactctccgggttctatcatcgttaacatgaacggtaaacgtttc1080atgaacgaatctatgccgtacgttgaagcgtgccaccacatgtacggtggtcagtacggt1140cagggtgctggtccgggtgaaaacgttccggcttggatggttttcgaccagcagtaccgt1200gaccgttacatcttcgctggtctgcagccgggtcagcgtatcccgaaaaaatggatggaa1260tctggtgttatcgttaaagctgactctgttgctgaactggctgaaaaaaccggtctggct1320ccggacgctctgaccgctaccatcgaacgtttcaacggtttcgctcgttctggtgttgac1380gaagacttccaccgtggtgaatctgcttacgaccgttactacggtgacccgaccaacaaa1440ccgaacccgaacctgggtgaaatcaaaaacggtccgttctacgctgctaaaatggttccg1500ggtgacctgggtaccaaaggtggtatccgtaccgacgttcacggtcgtgctctgcgtgac1560gacaactctgttatcgaaggtctgtacgctgctggtaacgtttcttctccggttatgggt1620cacacctacccgggtccgggtggtaccatcggtccggctatgaccttcggttacctggct1680gctctgcacctggctggtaaagcttaaggatcc1713当前第1页12