本发明涉及蛋白自组装，基因工程技术和多功能超分子材料领域，特别是涉及利用一种自组装蛋白质分子制作结构复杂的多功能复合材料的方法及应用。
背景技术：
：：超分子泛指一类利用氢键、疏水作用力、π-π共轭以及范德华力等微弱的非共价相互作用将大量单体聚集在一起并维持相对稳定结构的物质1。在自然界中广泛存在，通过调控离散单体自组装形成功能化一维纳米纤维材料，比如生命体内维持细胞生存并协助细胞运动的微管及肌动纤维，即是通过单体与单体间微弱的氢键作用力，自组装形成的一维纳米纤维材料。调控单体自组装形成超分子纳米结构不仅有助于生命体中小分子物质发挥特定功能，而且在高分子化学，纳米科技以及材料科学领域也具备深刻的科学启迪意义。在此引导下，人类已经发展出多种多样的超分子自组装体系，并且在仿生矿化2，3，纳米电子器件4，5，再生医学6，7以及能源材料8，9等领域取得众多的突破。当前人工的超分子材料体系主要是基于合成的可自组装的化合物小分子以及天然蛋白质或者人为设计的短肽，比如①利用合成的小分子自组装形成活性可控的纳米纤维10；②利用基因工程化的蚕丝蛋白发展嵌段纳米纤维11；③通过可迅速形成纤维的凝胶因子发展自分类纤维网络12；④借助烷基化多肽这类双亲性分子制作功能性纤维材料2；⑤通过β折叠的多肽构建多功能性纳米纤维13；⑥依靠基因工程的淀粉样蛋白自组装形成生物纳米材料14。然而以上这些方法所制备的纳米纤维结构，却不能够很好的兼顾结构与功能性的统一，往往是实现了结构的多样化却忽视了其作为材料应具备的功能性，因而其实用价值大打折扣。1.webber，m.j.；appel，e.a.；meijer，e.w.；langer，r.，supramolecularbiomaterials.naturematerials2016，15，13-26.2.hartgerink，j.d.；beniash，e.；stupp，s.i.，self-assemblyandmineralizationofpeptide-amphiphilenanofibers.science2001，294，1684-1688.3.ryu，j.；kim，s.w.；kang，k.；park，c.b.，mineralizationofself-assembledpeptidenanofibersforrechargeablelithiumionbatteries.advmater2010，22，5537-5541.4.jin，w.；fukushima，t.；niki，m.；kosaka，a.；ishii，n.；aida，t.，self-assembledgraphiticnanotubeswithone-handedhelicalarraysofachiralamphiphilicmoleculargraphene.pnatlacadsciusa2005，102，10801-10806.5.yamamoto，y.；fukushima，t.；jin，w.s.；kosaka，a.；hara，t.；nakamura，t.；saeki，a.；seki，s.；tagawa，s.；aida，t.，aglasshookallowsfishingofhexa-peri-hexahenzocoronenegraphiticnanotubes：fabricationofamacroscopicfiberwithanisotropicelectricalconduction.advmater2006，18，1297-1300.6.shah，r.n.；shah，n.a.；lim，m.m.d.；hsieh，c.；nuber，g.；stupp，s.i.，supramoleculardesignofself-assemblingnanofibersforcartilageregeneration.pnatlacadsciusa2010，107，3293-3298.7.spoerke，e.d.；anthony，s.g.；stupp，s.i.，enzymedirectedtemplatingofartificialbonemineral.advmater2009，21，425.8.yamamoto，y.；fukushima，t.；suna，y.；ishii，n.；saeki，a.；seki，s.；tagawa，s.；taniguchi，m.；kawai，t.；aida，t.，photoconductivecoaxialnanotubesofmolecularlyconnectedelectrondonorandacceptorlayers.science2006，314，1761-1764.9.sakai，n.；bhosale，r.；emery，d.；mareda，j.；matile，s.，supramolecularn/p-heterojunctionphotosystemswithantiparallelredoxgradientsinelectron-andhole-transportingpathways.jamchemsoc2010，132，6923.10.kang，j.；miyajima，d.；mori，t.；inoue，y.；itoh，y.；aida，t.，arationalstrategyfortherealizationofchain-growthsupramolecularpolymerization.science2015，347，646-651.11.beun，l.h.；albertazzi，l.；vanderzwaag，d.；devries，r.；stuart，m.a.c.，unidirectionallivinggrowthofselfassembledproteinnanofibrilsrevealedbysuper-resolutionmicroscopy.acsnano2016，10，4973-4980.12.onogi，s.；shigemitsu，h.；yoshii，t.；tanida，t.；ikeda，m.；kubota，r.；hamachi，i.，insitureal-timeimagingofself-sortedsupramolecularnanofibres.natchem2016，8，743-752.13.hudalla，g.a.；sun，t.；gasiorowski，j.z.；han，h.f.；tian，y.f.；chong，a.s.；collier，j.h.，gradatedassemblyofmultipleproteinsintosupramolecularnanomaterials.naturematerials2014，13，829-836.14.zhong，c.；gurry，t.；cheng，a.a.；downey，j.；deng，z.t.；stultz，c.m.；lu，t.k.，strongunderwateradhesivesmadebyself-assemblingmulti-proteinnanofibres.natnanotechnol2014，9，858-866.技术实现要素：本发明的目的是设计一种兼顾结构与功能的超分子自组装体系，以及利用该体系制作结构复杂且功能多样的超分子纳米材料的方法。为了达到上述目的，本发明提供了以下技术方案：一种多功能复合超分子纳米纤维自组装体系，其特征在于，包含至少一种与功能蛋白r结合的fuslc蛋白(r-fuslc，r为功能蛋白，fuslc为纤维自组装蛋白)。优选地，所述的功能蛋白r含有荧光蛋白，黏性蛋白，氢化酶，固氮酶或者甲烷单加氧酶中的至少一种。优选地，所述的功能蛋白r含有组氨酸标签histag、spycatcher、绿色荧光蛋白egfp、红色荧光蛋白mcherry、光激活荧光蛋白mmaple3和patagrfp、贻贝足丝蛋白mefp3和mefp5、贻贝足丝蛋白mefp3和mefp5、贻贝足丝蛋白mgfp3和mgfp5、甲烷单加氧酶、镍铁氢化酶、铁铁氢化酶以及固氮酶中的至少一种。优选地，所述的r为his、mmaple3、patagrfp、egfp、spycatcher、mefp5、mcherry、cfp以及egfp中的至少一种。优选地，所述的多功能复合超分子纳米纤维自组装体系还包含至少一种由与功能蛋白r结合的fuslc蛋白形成的纳米纤维。一种用于构建上述多功能复合超分子纳米纤维自组装体系的载体，其特征在于，包含至少一种能够表达上述的多功能复合超分子纳米纤维自组装体系的载体。优选地，所述的载体包括phis-fuslc，phis-egfp-fuslc，phis-mcherry-fuslc，phis-mmaple3-fuslc，phis-patagrfp-fuslc，phis-egfp-fuslc-spycatcher与phis-egfp-fuslc-mefp5质粒中的至少一种。一种超分子纳米材料，其特征在于，利用上述的多功能复合超分子纳米纤维自组装体系制成。优选地，所述的超分子纳米材料为单组份纳米纤维、无规共聚纳米纤维、嵌段纳米纤维、自分类纳米纤维、纳米物件修饰和定向组装的纳米纤维中的至少一种。更优选地，所述的纳米物件为co-nta修饰的cdses@zns量子点、co-nta修饰的金纳米颗粒、co-nta修饰的cds纳米棒以及spytag修饰的金纳米颗粒中的至少一种。本发明还提供了一种利用上述的多功能复合超分子纳米纤维自组装体系制作超分子纳米材料的方法，其特征在于，包括将多功能复合超分子纳米纤维自组装体系浓缩，于4℃或室温条件下静置过夜，得到超分子纳米纤维。本发明还提供了上述的超分子纳米材料在生物催化、生物标记、制备生物材料、生物防伪和生物粘性材料以及生物医药和能源领域中的应用。本发明基于哺乳动物核内蛋白fus(fusedinsarcoma)的一段可缓慢自组装形成纳米纤维的蛋白序列(216个氨基酸，氨基酸种类较单一，又称为低复杂度序列lc)，利用基因工程使其结合多样的功能蛋白r，通过控制不同的纤维生长条件，制作结构复杂且功能多样的超分子纳米材料。r包括组氨酸标签histag、spycatcher、绿色荧光蛋白egfp、红色荧光蛋白mcherry、光激活荧光蛋白mmaple3和patagrfp以及贻贝粘性蛋白mefp5等。纤维生长条件包括几种fuslc功能蛋白单体的随机生长体系、纤维成核点的诱发体系以及基于fuslc与csga纤维生长速度差异的自分类体系。该发明提供了上述的fus-r功能蛋白的构建，提纯以及表征方法，表达质粒分别为phis-fuslc，phis-egfp-fuslc，phis-mcherry-fuslc，phis-mmaple3-fuslc，phis-patagrfp-fuslc，phis-egfp-fuslc-spycatcher与phis-egfp-fuslc-mefp5。本发明证明了上述基于功能化fuslc的随机共聚物、嵌段共聚物以及自分类的纳米纤维体系，并以这些体系为模板实现了不同纳米颗粒在纤维上的多样的排列组装模式。此外本发明也验证了所制作的多功能复合纳米材料在生物胶粘剂以及生物防伪领域的应用。本发明可同时组装几种携带不同功能蛋白的fuslc单体形成无规共聚的多功能纳米结构；可根据此淀粉样蛋白纤维协同增长的机理，在蛋白单体溶液中加入纤维种子促进纤维增长，形成多嵌段纳米纤维；可基于fuslc较慢的纤维生长速度(≈10小时)，配合使用纤维生长速度较快(≈2小时)的功能化csga蛋白，组装形成自分类多功能纳米纤维网络；可以融合各种结合无机纳米材料的功能短肽，通过对纤维结构的控制，实现特定位置绑定各种无机纳米材料(包括纳米金，量子点，半导体纳米棒)，用在催化和纳米电子领域；所得的纳米纤维，可以融合各种结合无机纳米材料的功能短肽，通过对纤维结构的控制，实现特定位置绑定各种无机纳米材料(包括纳米金，量子点，半导体纳米棒)，用在催化和纳米电子领域。本发明所述的多功能纳米纤维材料可用于生物催化、生物标记、制备生物材料、生物防伪和生物粘性材料以及生物医药和能源领域中的应用。所述的多功能纳米纤维材料以不同比例混合，不同尺度、图形阵列图案化应用于防伪生物材料。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：1.本发明通过基因工程手段对fuslc进行基因融合，从而引入具有功能可调的肽段或蛋白质，由于形成纳米纤维结构，相应的功能蛋白的稳定性也大大提高。2.fuslc具有较缓慢的纤维生长速度，因而可以调控不同的单体添加顺序实现复杂的纳米结构，结合不同的功能性蛋白，从而实现纳米材料结构与功能的统一。3.可以利用基因工程整合多种粘性蛋白，结合fuslc蛋白可成凝胶的特点，发展水下胶黏水凝胶。4.利用fus超分子纤维的不同聚合结构，以及蛋白质分子的图案化技术，将其应用于防伪领域，实现多种手段，不同尺度检测级别的防伪。5.fus超分子纤维可以融合各种结合无机纳米材料的功能短肽，通过对纤维结构的控制，实现特定位置绑定各种无机纳米材料(包括纳米金，量子点，半导体纳米棒)，用在催化和纳米电子领域。6.利用基因工程可以引入各种生物催化酶蛋白到fuslc，实现绿色催化，并在能源和可持续性技术方面有潜在引用。附图说明图1为重组fuslc蛋白的特性描述，fuslc蛋白首先聚集形成液滴，之后单体缓慢自组装形成功能性纳米纤维，浓密的纳米纤维通过物理交联形成温度可逆的水凝胶。图2为构建的重组fuslc融合质粒的图谱；图3为构建的重组csga以及mcherry-spycatcher融合质粒的图谱；图4为各种重组fuslc的纳米纤维afm形貌，a为fuslc纳米纤维，b为egfp-fuslc纳米纤维，c为mcherry-fuslc纳米纤维，d为mmaple3-fuslc纳米纤维，e为patagrfp-fuslc纳米纤维，f为egfp-fuslc-spycatcher纳米纤维，g为egfp-fuslc-mefp5纳米纤维。图5为各种重组fuslc的纳米纤维荧光显微镜观察图。a为egfp-fuslc纳米纤维，b为mcherry-fuslc纳米纤维，c为mmaple3-fuslc纳米纤维，d为patagrfp-fuslc纳米纤维，e为egfp-fuslc-spycatcher纳米纤维，f为egfp-fuslc-mefp5纳米纤维。图6为各种重组fuslc纳米纤维的xrd衍射，a为fuslc纳米纤维的xrd，b为egfp-fuslc纳米纤维的xrd，c为mcherry-fuslc纳米纤维的xrd，e为mmaple3-fuslc纳米纤维的xrd，f为patagrfp-fuslc纳米纤维的xrd。图7为fuslc，egfp-fuslc，mcherry-fuslc三种纳米纤维的圆二色谱。图8为重组fuslc的凝胶试验。a中高浓度的mcherry-fuslc与b中的egfp-fuslc可以形成温度响应的可逆水凝胶，而c中的mmaple3-fuslc与d的patagrfp-fuslc却易形成沉淀。图9为无规共聚物状重组fuslc纳米纤维的afm形貌及荧光表征。a，b，c分别指egfp-fuslc：mcherry-fuslc单体比例为3∶1，1∶1以及1∶3时形成的纳米纤维afm形貌图。d为上述无规共聚物重组fuslc的荧光显微镜观察图。图10为egfp-fuslc：mcherry-fuslc单体比例为3∶1，1∶1以及1∶3形成的无规共聚纳米纤维的圆二色谱图a与xrd衍射图b。图11为有无纤维成核点时反应fuslc淀粉样蛋白单体自组装的tht生长曲线。图12为嵌段纳米纤维的荧光纤维观察图及数量分布图。a为stage1(egfp-fuslc纤维：mcherry-fuslc单体＝1∶3)时形成的纳米纤维的荧光显微镜观察图，b为stage2(stage1纤维：egfp-fuslc单体＝1∶3)时形成的纳米纤维的荧光显微镜观察图，c为stage3(stage2纤维：mcherry-fuslc单体＝1∶3)时形成的纳米纤维的荧光显微镜观察图，d为egfp-fuslc纤维：mcherry-fuslc单体分别为1∶3，1∶6，1∶9时的嵌段纤维数目统计图，e为stage1，stage2，stage3时的嵌段纤维数目统计图。图13为egfp-fuslc纤维：mcherry-fuslc单体比例为1∶3，1∶6以及1∶9形成的嵌段纳米纤维的圆二色谱图a与xrd衍射图b。图14为由重组csga与fuslc形成的自分类纳米纤维网络。a为自分类纳米纤维的afm形貌图，b为荧光观察图图15为基于重组fuslc纳米纤维的纳米颗粒定向组装图。a为量子点，金纳米颗粒以及纳米棒在单组分fuslc纳米纤维上的绑定afm与tem图，b为金纳米颗粒与纳米棒在无规共聚纳米纤维上的特异性定向组装，c为金纳米颗粒在嵌段纳米纤维上的的特异性定向组装，d为金纳米颗粒以及量子点在自分类纳米纤维网络上的的特异性定向组装。图16为基于egfp-fuslc和mcherry-fuslc单体的不同自组装结构的纤维的涂层。其在紫外光下表现出荧光特性，在荧光显微镜下可以分辨出两种荧光纤维的简单混合，嵌段共聚，无规共聚的结构，其荧光发射光谱皆表现为和单体一致的红绿荧光的叠加。图17为基于egfp-fuslc和mcherry-fuslc单体的不同自组装结构的纤维的图案化。宏观上可以在印在不同的材料表面，如金属铝，无机玻璃片，有机聚对苯二甲酸乙二醇酯表面，展示出包含防伪信息的二维码，微观上用显微镜可以观察到微米或纳米尺度的简单图形的阵列，如三角形，圆形阵列。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作进行各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。本发明提供的基因工程超分子自组装功能蛋白技术主要是针对fuslc蛋白进行基因融合或改造，制作出基于fuslc的多种功能化重组基因r-fuslc，r为功能基团。如图1所示，纯化后的r-fuslc重组蛋白具备较缓慢的纤维生长速度。首先，在体外蛋白聚集形成蛋白液滴(liquiddroplets)，液滴局部高浓度的单体聚集有利于融合蛋白β折叠形成功能化的纳米纤维；在低温以及较高蛋白浓度下，密集的纤维之间的物理交联促使该蛋白溶液发生相转变形成功能可控的可逆水凝胶。r代表图中描述的几类功能基团，包括可结合金属的短肽histag、可与短肽spytag特异性识别的蛋白spycatcher，也有粘性蛋白mefp5以及荧光蛋白egfp，mcherry，patagrfp和mmaple3等，可在生物催化、生物防伪和生物粘性材料等领域有应用。以下实施例中，如无特殊说明，pcr扩增及pcr鉴定采用的反应体系(50μl)包括以下成份：pcr反应条件为：98℃预变性20s，98℃10s，58℃30s，72℃45s，35个循环，最后72℃延伸5min，以去离子水为阴性对照。以下实施例中，如无特殊说明，使用的lb培养基购自(中国台湾生工，l001-1kg)抗生素溶液的配制方法为：羧苄青霉素(macklin，c805408)配制成100mg/ml的水溶液于-20℃保存，使用时抗生素终浓度为50ng/ml。以下实施例中，如无特殊说明，使用的裂解液，清洗液，洗脱液，透析液配方如下：(1)裂解液：50mmtris-hci(ph＝7.5)500mmnaci20mmbme(β-巯基乙醇)1％tween-20(2)清洗液：20mmtris-hci(ph＝7.5)500mmnaci20mmbme(β-巯基乙醇)1％tween-2040mm咪唑(3)洗脱液：20mmtris-hci(ph＝7.5)500mmnaci20mmbme(β-巯基乙醇)1％tween-20400mm咪唑(4)透析液：20mmtris-hci(ph＝7.5)200mmnaci20mmbme(β-巯基乙醇)1％tween-200.5mmedta其中tris-hci购自promega，naci购自国药，bme购自安耐吉，tween-20购自bbi，咪唑购自安耐吉化学，edta购自amresco。以下实施例中所用到的大肠杆菌bl21(de3)，可从transgenebiotech(beijing)购买，目录号为cd601。以下实施例中所用到的phis-fuslc，phis-mcherry-fuslc，phis-egfp-fuslc以及phis-cfp-fuslc质粒已在申请日前于非专利文献(cell-freeformationofrnagranules：lowcomplexitysequencedomainsformdynamicfiberswithinhydrogels.2012，cell，volume149，issue4，11may2012，pages753-767.masatokato，tinaw.han，stevenl.mcknight)中公开，美国西南医学院的mcknight教授课题组已将上述质粒馈赠给本申请人，现由申请人保存，申请人保证从申请日起二十年内向公众发放上述质粒。pet11d-csga表达质粒已在申请日前于非专利文献(allenychen，urartuo.s.seker，michelleylu，robertjcitorik，timothylu.synthesizingandpatterningtunablemultiscalematerialswithengineeredbiofilms.2014.naturematerials)中公开，mit的timothy.k.lu课题组已将上述质粒馈赠给本申请人，现由申请人保存，申请人保证从申请日起二十年内向公众发放上述质粒。实施例1：功能性fuslc蛋白的构建、表达及提纯构建r-fuslc表达质粒，在bl21(de3)大肠杆菌内转入r-fuslc表达质粒，使其表达r-fuslc融合蛋白，r为功能蛋白。本发明利用了一系列表达r-fuslc的融合质粒，融合了带有不同功能化基团的肽段蛋白质，质粒图谱如图2所示。其中phis-fuslc，phis-mcherry-fuslc，phis-cfp-fuslc以及phis-egfp-fuslc质粒来源于美国西南医学院的mcknight教授课题组馈赠，fuslc的氨基酸序列见seqidno：1，egfp的氨基酸序列见seqidno：2，mcherry的氨基酸序列见seqidno：3，cfp的氨基酸序列见seqidno：4，histag的氨基酸序列见seqidno：10，以phis-mmaple3-fuslc，phis-patagrfp-fuslc，phis-egfp-fuslc-spycatcher，phis-egfp-fuslc-mefp5以phis-egfp-fuslc质粒为基础，插入目的基因片段。构建上述所需的表达质粒，其涉及的主要步骤包括：对于表达质粒phis-mmaple3-fuslc以及phis-patagrfp-fuslc的构建，利用限制性内切酶ncoi(thermo/fermentas，货号：fd0574)与bamhi(life，货号：fd0054)按照常规方法切除表达质粒phis-egfp-fuslc中的egfp基因并使质粒线性化，针对表达质粒phis-egfp-fuslc-spycatcher与phis-egfp-fuslc-mefp5的构建，利用限制性内切酶xhoi(thermo/fermentas，货号fd0694)按照常规方法使表达质粒phis-egfp-fuslc线性化，根据r片段与酶切后的表达载体的基因序列设计适用于吉布森连接(gibbsonassembly)的上下游特异引物。分别pcr扩增构建各质粒所用的mmaple3片段、patagrfp片段、spycatcher片段和mefp5片段，所用的引物如下：1)对于构建质粒phis-mmaple3-fuslc，mmaple3片段的正向引物phis-mmaple3-fuslc-f和反向引物phis-mmaple3-fuslc-r分别为：phis-mmaple3-fuslc-f(seqidno：13)和phis-mmaple3-fuslc-r(seqidno：14)。以苏州金唯智生物有限公司按照常规方法合成的mmaple3基因(mmaple3基因序列为已知序列，记载在文献characterizationanddevelopmentofphotoactivatablefluorescentproteinsforsingle-molecule-basedsuperresolutionimaging.2014.pnas.8452-8457，siyuanwang，xiaoweizhuang中)为pcr模板，对应氨基酸序列分别见seqidno：5，构建得到的质粒图谱见图2。2)对于构建质粒phis-patagrfp-fuslc：引物为phis-patagrfp-fuslc-f(seqidno：15)和phis-patagrfp-fuslc-r(seqidno：16)。。pcr以苏州金唯智生物有限公司按照常规方法合成的patagrfp基因(patagrfp基因序列为已知序列，记载在文献(brightmonomericphotoactivatableredfluorescentproteinfortwo-colorsuper-resolutionsptpalmoflivecells.j.am.chem.soc.132，6481-6491(2010).subachf.v.，pattersong.h.，renzm.，lippincott-schwartzj.，verkhushav.v中)为模板，patagrfp氨基酸序列见序列列表seqidno：6，构建得到的质粒图谱见图2。3)对于构建phis-egfp-fuslc-spycatcher质粒：引物为phis-egfp-fuslc-spycatcher-f(seqidno：17)和phis-egfp-fuslc-spycatcher-r(seqidno：18)。pcr以苏州金唯智生物有限公司按照常规方法合成的spycatcher基因(spycatcher基因序列为已知序列，记载在文献supergluefrombacteria：unbreakablebridgesforproteinnanotechnology.trendsbiotechnol，2014，32，506-512.gianlucaveggiani，bijanzakeri，andmarkhowarth.中)为模板，spycatcher的氨基酸序列见序列列表seqidno：7。构建得到的质粒图谱见图2。4)对于构建phis-egfp-fuslc-mefp5质粒：引物为phis-egfp-fuslc-mefp5-f(seqidno：19)和phis-egfp-fuslc-mefp5-r(seqidno：20)。pcr以苏州金唯智生物有限公司按照常规方法合成的mefp5基因(mefp5的基因序列为已知序列，记载在文献strongunderwateradhesivesmadebyself-assemblingmulti-proteinnanofibers.naturenanotechnol，2014，858-866.chaozhong，collinm.stultz，timothyk.lu.中)为模板，mefp5的氨基酸序列见序列列表seqidno：8。各步pcr结束后，用dna电泳分离目标条带，使用transgen(北京)凝胶回收试剂盒并按照说明书中记载的操作步骤回收目标基因的dna片段。表达载体的构建及目标菌株的获取：(1)表达载体的构建：将pcr扩增回收的目标片段(mmaple3片段、patagrfp片段、spycatcher片段和mefp5片段)分别和上述的经酶切并线性化后的phis-egfp-fuslc载体(phis-egfp-fuslc载体序列见seqidno：12)，用gibsonassembly(neb，e2611l)连接得到表达载体，根据各片段的长度和浓度，按所需比例分别加至ep管中。反应体系在50℃中恒温孵育连接1小时。gibsonassembly(neb，e2611l)反应体系如下：(2)将所得的表达载体以及phis-fuslc，phis-mcherry-fuslc，phis-cfp-fuslc以及phis-egfp-fuslc分别按照常规方法转化dh5α(康为世纪cw08085)后，采用提质粒试剂盒(天根dp103)按操作说明提取质粒，由苏州金唯智公司测序后，鉴定重组质粒正确。(3)将重组质粒用常规的化学转化法转入大肠杆菌感受态bl21de3(transgenebiotechcd601)中，涂带有50μg/ml羧苄青霉素的lb平板，37℃培养过夜。(4)挑选得到的单克隆，接种到含50μg/ml羧苄青霉素抗性的lb培养基中，经菌落pcr鉴定(目标基因的菌落pcr引物为seqidno：13至seqidno：20相对应的引物，相应的目标基因的氨基酸序列见seqidno：5至seqidno：8)是否含有目的基因片段(r片段)，如扩出条带则证明质粒转化成功。重组r-fuslc蛋白的诱导表达及提纯步骤如下：(1)挑取含有目标质粒(phis-mmaple3-fuslc，phis-patagrfp-fuslc，phis-egfp-fuslc-spycatcher，phis-egfp-fuslc-mefp5、phis-fuslc，phis-mcherry-fuslc，phis-cfp-fuslc以及phis-egfp-fuslc)的bl21de3大肠杆菌接种到100ml含有50μg/ml羧苄青霉素抗性的lb液体培养基中，37℃摇荡培养过夜。(2)取10ml过夜培养的菌液按1∶100比例接种到1l含50μg/ml羧苄青霉素的lb液体培养基中37℃摇荡培养至od600在0.5-1.0之间。(3)加入1ml0.5miptg到(2)所述菌液中，16℃摇荡诱导过夜。(4)诱导后的菌液离心收集菌体，称取菌体质量置于-80℃冷藏。(5)每克菌体加入10ml裂解液，并添加溶菌酶(bbilifesciences)至终浓度0.4mg/ml，震荡均匀，并4℃静置半小时。(6)利用超声细胞破碎仪(fisherscientific，model：fb120)裂解细胞，超声功率为30％，时间间隔为开3秒，关8秒，共计超声30分钟。(7)35000g离心一小时去除菌体沉淀保留上清，在上清中加入ni-nta柱子(generalelectriccompany，货号：17057501)并置于旋转摇床结合30分钟。(8)利用重力层析柱(bbi，镍柱)提取蛋白，将上述蛋白溶液加入到重力层析柱，并用200-300ml清洗液清洗重力层析柱。(9)用20-30ml洗脱液在重力层析柱中洗脱重力层析柱上结合的目标蛋白(phis-mmaple3-fuslc，phis-patagrfp-fuslc，phis-egfp-fuslc-spycatcher，phis-egfp-fuslc-mefp5、phis-fuslc，phis-mcherry-fuslc，phis-cfp-fuslc以及phis-egfp-fuslc)，并收集流下的目标蛋白溶液，利用nanodrop2000测定蛋白浓度。实施例2：单组分重组fuslc纳米纤维的制备及表征一种多功能复合超分子纳米纤维自组装体系，包含实施例1中得到的phis-mmaple3-fuslc，phis-patagrfp-fuslc，phis-egfp-fuslc-spycatcher，phis-egfp-fuslc-mefp5、phis-fuslc，phis-mcherry-fuslc，phis-cfp-fuslc以及phis-egfp-fuslc蛋白中的一种。利用上述的多功能复合超分子纳米纤维自组装体系制备单组分重组fuslc纳米纤维：将实施例1中得到的目标蛋白(phis-mmaple3-fuslc，phis-patagrfp-fuslc，phis-egfp-fuslc-spycatcher，phis-egfp-fuslc-mefp5、phis-fuslc，phis-mcherry-fuslc，phis-cfp-fuslc以及phis-egfp-fuslc)分别浓缩至40μm，于4℃(也可为室温条件下)静置过夜可得到大量由目标蛋白自组装产生的超分子纳米纤维，但此时体系内仍然有未完全反应的单体；(2)将所得的超分子纳米纤维体系装入30kd透析袋中并置于透析液中透析过夜，去除游离的蛋白单体，得到纯净的纳米纤维溶液。利用所得的纳米纤维溶液进行重组fuslc纳米纤维的表征：(1)afm测纤维表面形貌：200μl上述的透析过夜的纳米纤维溶液滴于平整的云母片上，在室温下静置10分钟，用300ml去离子水冲洗样品并用氮气吹干。用afm的接触模式测样品表面的形貌。phis-fuslc、phis-mcherry-fuslc、phis-mmaple3-fuslc，phis-patagrfp-fuslc，phis-egfp-fuslc-spycatcher，phis-egfp-fuslc-mefp5以及phis-egfp-fuslc蛋白形成的纳米纤维的表面形貌如图4所示。(2)荧光显微镜观察目标蛋白纤维：取2μl40μm或0.04μm(40μm溶液稀释1000倍)的上述的纳米纤维溶液于干净的载玻片，在样品上面平置盖玻片，并用指甲油密封玻片制成样品。样品置于正置荧光显微镜下，以63倍物镜观察纤维荧光。选用488nmegfp激发光波长激发样品phis-egfp-fuslc，phis-egfp-fuslc-spycatcher，phis-egfp-fuslc-mefp5，采用595nm波长激发光激发phis-mcherry-fuslc，利用405nm光线活化phis-mmaple3-fuslc与phis-patagrfp-fuslc并分别以488nm与595nm激发光激发荧光蛋白并采集数据，荧光数据如图5所示。(3)x-ray衍射实验测纤维二级结构：取上述的纳米纤维溶液静置一周后，10000g离心10分钟收集纤维沉淀，将沉淀用去离子水清洗三次，利用xrd测纳米纤维的二级结构(图6)，与圆二色谱实验相同，x-ray也证明了重组纳米纤维具备β-sheet二级结构。(4)圆二色谱实验测纤维二级结构：利用上述的透析过夜的纳米纤维溶液继续在去离子水中透析过夜，取透析后的样品利用圆二色谱仪测其纤维二级结构，phis-fuslc，phis-egfp-fuslc，phis-mcherry-fuslc的圆二色谱数据如图7所示，与phis-fuslc蛋白形成的纳米纤维相比，证明这些重组蛋白纤维都具备β-sheet二级结构。(5)重组fuslc纳米纤维相转变成凝胶实验：将phis-mcherry-fuslc与phis-egfp-fuslc，phis-mmaple3-fuslc，phis-patagrfp-fuslc蛋白形成的纳米纤维溶液分别浓缩至800μm于4℃静置过夜，结果如图8所示，phis-mcherry-fuslc与phis-egfp-fuslc可以形成可逆的水凝胶，而phis-mmaple3-fuslc与phis-patagrfp-fuslc由于缺乏增溶性蛋白标签(例如egfp与mcherry)极易形成蛋白沉淀，而失去成胶能力。实施例3：双组分无规共聚物状重组fuslc纳米纤维的制备及表征一种多功能复合超分子纳米纤维自组装体系，包含实施例1中得到的phis-egfp-fuslc与phis-mcherry-fuslc蛋白。鉴于实施例2中证明的phis-egfp-fuslc与phis-mcherry-fuslc蛋白超强的纤维生长与凝胶生成能力，将相同物质的量浓度(40μm)的实施例1得到的phis-egfp-fuslc与phis-mcherry-fuslc蛋白单体溶液按照1∶3，1∶1以及3∶1比例混合在一起形成所述的多功能复合超分子纳米纤维自组装体系在4℃静置(或透析过夜)使其自组装形成重组fuslc纳米纤维(图9a，9b，9c)。正置荧光显微镜表征如图9d所示，可以证明随着phis-mcherry-fuslc与phis-egfp-fuslc组分比值扩大，所生成的复合纤维的颜色也在由偏绿色逐渐趋向红色，说明该体系所得到的纳米纤维是两种重组fuslc单体自组装的结果，这种纳米纤维称之为双组分无规共聚物状重组fuslc纳米纤维。圆二色谱与x-ray实验也证明这种无规共聚物状纳米纤维依然具备很强的β-sheet(图10)。实施例4：多嵌段重组fuslc纳米纤维的制备及表征淀粉样蛋白一般具备种子诱发单体聚集的性质，为了证明fuslc纤维种子能否加速fuslc单体的自组装，一种专用于淀粉样蛋白的染料tht被用来检测fuslc的生长速度，具体操作如下所示：①取2ml按照实施例1方法所得的刚纯化的phis-fuslc蛋白溶液(20μm)分为两组，每组1ml，一组加入10μl成熟的phis-fuslc蛋白形成的纤维溶液(按照实施例2中记载的方法得到)(20μm)，编号a，另一组加入10μl去离子水，编号b；②取20μl1mmtht染料加入a与b中至终浓度20μm，并混合均匀；③将a与b各分为5组分别加至96孔板的孔道内，每个孔道200μl；④将96孔板加至酶标仪，利用495nm波长激光检测50小时，测样品a与b纤维的生长曲线。结果如图11所示，加入phis-fuslc蛋白形成的纤维种子可以加速phis-fuslc蛋白单体的自组装近4个小时，这不仅证明了fuslc纤维增长符合协同机理，也证明了基于重组fuslc多嵌段纳米纤维的可行性。一种多功能复合超分子纳米纤维自组装体系，包含实施例1中得到的phis-egfp-fuslc蛋白以及由实施例1中得到的phis-mcherry-fuslc蛋白形成的纳米纤维；或包含实施例1中得到的phis-mcherry-fuslc蛋白以及由实施例1中得到的phis-egfp-fuslc蛋白形成的纳米纤维。基于重组r-fuslc多嵌段纳米纤维的制备：①纯化并浓缩实施例1制得的phis-egfp-fuslc或phis-mcherry-fuslc蛋白溶液至(40μm)，置于4℃一周(或透析过夜)使其自组装完全；②纯化并浓缩phis-egfp-fuslc或phis-mcherry-fuslc蛋白溶液至(40μm)，分别对应加入①中的phis-mcherry-fuslc或phis-egfp-fuslc蛋白形成的纳米纤维溶液，调节纤维种子与蛋白单体比例为1∶3，1∶6，1∶9，形成多功能复合超分子纳米纤维自组装体系，置于4℃一周(或透析过夜)使其形成纳米纤维。以phis-egfp-fuslc蛋白形成的纳米纤维为成核点，加入phis-mcherry-fuslc蛋白单体的荧光显微镜观察以及嵌段纤维比重统计结果如图12a以及图12d所示，可以在荧光显微镜下清晰观察到红色与绿色交替的二嵌段与三嵌段纤维，而且随着纤维种子比例的升高(从1∶9至1∶3)，嵌段纤维在总纤维数目的比重也在上升(从52％至77.1％)，证明了实验的可控性，圆二色谱实验与x-ray实验(图13)也证明了重组fuslc纳米纤维β-sheet二级结构。③phis-egfp-fuslc蛋白形成的纤维：phis-mcherry-fuslc单体比例为1∶3的混合溶液置于4℃一周(或透析过夜)使其形成纳米纤维，可得到最多三嵌段的纳米结构，该纤维溶液编号stage1，取1mlstage1纤维溶液(40μm)加入3mlphis-egfp-fuslc蛋白单体溶液(40μm)置于4℃一周或透析过夜，可得到至多五嵌段的纳米纤维结构(图12b)，该溶液称为stage2，取stage2纤维溶液1ml继续添加3倍体积等浓度的phis-mcherry-fuslc蛋白单体溶液，可以得到至多七嵌段的纳米纤维(图12c)，该溶液称为stage3，从stage1到stage3，利用纤维种子成核促增长机制，逐渐改变不同功能性单体的添加顺序，可以实现多嵌段多功能自组装纳米材料的制备。实施例5：自分类纳米纤维的制备及表征从tht曲线可知(图11)，fuslc具有较缓慢的纤维自组装速度，纳米纤维一般在10小时左右开始缓慢增长，而另一种大肠杆菌功能性淀粉样蛋白csga却具备极高的自组装活性，可以在2-3小时形成大量淀粉样纤维(tht图)。由于fuslc与csga各自蛋白序列的保守以及纤维增长速度的差异，因而利用这两种淀粉样蛋白发展自分类多功能纳米纤维材料具备理论可行性。重组csga及mcherry-spycatcher的构建表达及纯化：对于构建质粒phis-csga-spytag：引物为phis-csga-spytag-f(seqidno：21)和phis-csga-spytag-r(seqidno：22)。质粒图谱见图3。csga的氨基酸序列见序列列表seqidno：9。对于构建质粒phis-mcherry-spycatcher：引物为phis-mcherry-spycatcher-f(seqidno：23)和phis-mcherry-spycatcher-r(seqidno：24)，质粒图谱见图3。表达载体的构建：针对phis-csga-spytag的构建，以pet11d-csga为模板，利用相应的引物(seqidno：21与seqidno：22)进行pcr反应扩增得到目的片段csga-spytag。pcr结束后，用dna电泳分离目标条带，使用transgen(北京)凝胶回收试剂盒并按照说明书中记载的操作步骤回收目标基因csga-spytag的dna片段。对phis-egfp-fuslc质粒用ndei(thermo/fermentas，货号：fd0584)与xhoi(thermo/fermentas，货号：fd0694)位点酶切去除基因片段egfp与fuslc，用gibsonassembly(neb，e2611l)将目的片段csga-spytag与线性化后的质粒连接。gibsonassembly(neb，e2611l)反应体系如下：针对phis-mcherry-spycatcher的构建，以苏州金唯智生物有限公司按照常规方法合成的spycatcher基因(spycatcher基因序列为已知序列，记载在文献supergluefrombacteria：unbreakablebridgesforproteinnanotechnology.trendsbiotechnol，2014，32，506-512.gianlucaveggiani，bijanzakeri，andmarkhowarth.中)为模板(氨基酸序列见seqidno：7)，利用相应的引物(seqidno：23与seqidno：24)进行pcr反应扩增得到目的片段spycatcher。pcr结束后，用dna电泳分离目标条带，使用transgen(北京)凝胶回收试剂盒并按照说明书中记载的操作步骤回收目标基因spycatcher的dna片段。对phis-mcherry-fuslc质粒用bamhi(life，货号：fd0054)与xhoi(thermo/fermentas，货号：fd0694)位点酶切去除基因片段fuslc，用gibsonassembly(neb，e2611l)将目的片段spycatcher与线性化后的质粒连接，根据各片段的长度和浓度，按所需比例分别加至ep管中。反应体系在50℃中恒温孵育连接1小时。gibsonassembly(neb，e2611l)反应体系如下：(1)表达载体转化dh5α(康为世纪cw08085)后，采用提质粒试剂盒(天根dp103)提取质粒，由苏州金唯智公司测序后，鉴定重组质粒正确。(2)将重组质粒用化学转化法转入大肠杆菌感受态bl21de3(transgenebiotechcd601)中，涂带有50μg/ml羧苄青霉素的lb平板，37℃培养过夜。(3)挑选得到的单克隆，接种到含50μg/ml羧苄青霉素抗性的lb培养基中，经菌落pcr鉴定(针对phis-csga-spycatcher的菌落pcr，引物为seqidno：21与seqidno：22，对于phis-mcherry-spycatcher，相应的引物为seqidno：23与seqidno：24)是否含有目的基因片段(r片段)，如扩出条带则证明质粒转化成功。重组csga蛋白的诱导表达及提纯步骤如下：1)挑取含有目标质粒的bl21de3大肠杆菌接种到100ml含有50μg/ml羧苄青霉素抗性的lb液体培养基中，37℃摇荡培养过夜。2)取10ml过夜培养的菌液按1∶100比例接种到1l含50μg/ml羧苄青霉素的lb液体培养基中37℃摇荡培养至od600在0.5-1.0之间。3)加入1ml0.5miptg到(2)所述菌液中，37℃摇荡诱导1小时。4)诱导后的菌液离心收集菌体，称取菌体质量置于-80℃冷藏。5)每克菌体加入10ml盐酸胍溶液(配方：50mmkpi，8m盐酸胍，ph＝7.2)置于旋转摇床裂解过夜。6)35000g离心一小时去除菌体沉淀保留上清，在上清中加入ni-nta柱子(generalelectriccompany，货号：17057501)并置于旋转摇床结合30分钟。7)利用重力层析柱(镍柱)提取蛋白，将上述蛋白溶液加入到重力层析柱，并用200-300ml清洗液清洗重力层析柱。8)用20-30ml洗脱液在重力层析柱中洗脱重力层析柱上结合的目标蛋白，并收集流下的目标蛋白溶液，利用nanodrop2000测定蛋白浓度。phis-mcherry-spycatcher蛋白的诱导表达及提纯步骤如实施例1所示。自分类纳米纤维的制备：取纯化的r-fuslc与csga-r蛋白单体按物质的量比10∶1混合，并置于4℃(或透析)过夜。以egfp-fuslc与csga自分类纳米纤维为例，80μmphis-egfp-fuslc蛋白与8μmphis-csga-spytag蛋白按体积比1∶1混合均匀并在透析液中透析过夜，得到egfp-fuslc/csga自分类纳米纤维溶液。自分类纳米纤维的表征：①afm表征：取200μl透析后的egfp-fuslc/csga自分类纳米纤维溶液滴于平整的云母片静置10分钟，用300ml去离子水冲洗样品并用氮气吹干，利用afm接触模式扫样品表面形貌，结果如图14a所示，平均高度为8nm的phis-egfp-fuslc蛋白形成的纤维与2-3nm高的phis-csga-spytag蛋白形成的纤维交叉分布，说明两类单体自组装形成彼此的纳米纤维而互不干扰。②荧光显微镜表征：为了能在荧光显微镜下分开自分类的fuslc与csga纳米纤维，80μmphis-egfp-fuslc蛋白与8μmphis-csga-spytag蛋白按体积比1∶1混合均匀并在透析液中透析过夜形成自分类纳米纤维。由于spytag可以特异性的与spycatcher蛋白发生共价连接，因而在混合溶液中加入0.1μmphis-mcherry-spycatcher蛋白使之特异性与phis-csga-spytag蛋白结合，便于荧光显微镜观察。荧光观察结果如图14b所示，可观察到团聚的绿色的重组fuslc纤维与红色的csga-spytag-spycatcher-mcherry纳米纤维，在稀释的样品中可以观察到两者单根纤维，这些结果都证明了自分类纳米纤维体系的可行性。实施例6：基于复杂纳米结构的纳米颗粒定向组装为实现用纳米物件对重组fuslc纤维的修饰和定向组装，本发明一方面利用co-nta配体与重组蛋白fuslc上面的6xhis标签特异性的结合，将被co-nta修饰后的量子点，金纳米颗粒，以及纳米棒定向组装到重组fuslc纳米结构上(图15a)，另一方面借助spytag与spycatcher之间特异的共价结合，将被spytag修饰的金纳米颗粒绑定在fuslc-spycatcher纤维上面(图15a)。这两方面技术联合运用，可以实现纳米颗粒在复杂纳米结构的定向组装。合成如下纳米物件，其中，hs-nta配体，co-nta修饰的cdses@zns量子点，金纳米颗粒，cds纳米棒的制备可参照专利cn106698332a。hs-nta的合成：溴乙酸(8.34g，60mmol)溶于30ml的2m的氢氧化钠溶液得到溴乙酸溶液，n6-cbz-l-赖氨酸(cbz-lys)(8.4g，30mmol)溶于45ml的2m的氢氧化钠溶液得到cbz-lys溶液。在冰浴条件下将cbz-lys溶液逐滴加到溴乙酸溶液中，室温搅拌过夜。加热到70℃，反应2h后冷至室温。加入1m的hcl溶液使其完全沉淀，并将沉淀重新溶解在100ml的1m氢氧化钠溶液中。最后重新加入1m的hcl溶液使其完全沉淀，抽滤并干燥，得到9.55g的cbz-nta。在三口烧瓶中加入cbz-nta(6g，15mmol)和pd/c(钯碳)催化剂(10％，0.6g)，然后加入100ml的甲醇。在h2氛围下室温搅拌过夜。过滤得到甲醇溶液，沉淀用40ml的去离子水溶解并抽滤得到水溶液。将甲醇溶液和水溶液旋干，然后将产物重新溶解于20ml去离子水中，加入乙醇直到溶液变浑浊，然后将其置于-20℃冷却析出，过滤并干燥得到3.4g的nh2-nta。将nahco3(1g，11.9mmol)和硫代丁内酯(0.6g，5.9mmol)溶于10ml的去离子水中，然后加入nh2-nta(1g，3.8mmol)。反应混合液72℃搅拌过夜，然后冷至室温。加入大约1ml的乙酸将ph调到3左右，旋蒸并使其在乙醇中重新结晶，抽滤并用乙醇和戊烷分别洗三次，干燥产物得到1.26g的hs-nta。co-nta修饰的cdses@zns量子点的制备：cdo(282.5mg，2.2mmol)和oa(油胺，10ml)的混合液脱气并在氮气保护条件下加热至150℃，然后加入40ml的ode(1-18烯)并且加热至305℃。将se(42.6mg，0.54mmol)和s(1.9mg，0.06mmol)溶于0.6ml的top(三辛基膦)中，然后迅速注入反应混合液。反应混合液维持在305℃反应90s以促进cdses壳的生长，然后逐滴加入十二硫醇(0.59ml，3.4mmol)，反应混合液降至270℃。zn(oac)2(1.049g，5.72mmol)溶于oa(8ml)和ode(2ml)的混合液中，注入反应混合液，然后s(0.432g，13.5mmol)溶于top(7ml)中，快速注入反应混合液中，反应在270℃保持10min以促进完全成壳。得到的量子点溶于正己烷中并用无水乙醇洗三遍，得到cdses@zns量子点，重悬于20ml正己烷中保存。1ml的乙醇加入1ml(10μmol/ml)的cdses@zns量子点溶液中，离心，弃上清，并重悬于15ml的二氯甲烷。然后加入20mg/mlhs-nta甲醇溶液(1ml，ph＝13)，缓慢搅拌2min，加入9ml的pbs溶液，分出水相并用0.2μm的滤膜过滤，所得溶液为具有nta配体的cdses@zns量子点。在(500nmmol/ml)的具有nta配体的cdses@zns量子点的水溶液(1ml)中加入(20μl)的50mm的cocl2溶液，得到具有co-nta配体修饰的cdses@zns量子点。co-nta修饰的8nm金纳米颗粒合成：在ode(10ml)，oam(10ml)andhaucl4.3h2o(0.1g，0.254mmol)的混合液中加入30mg的粒径为6nm的金纳米颗粒(参照专利cn106698332a合成)，氮气保护条件下搅拌使其溶解。反应液加热至80℃，反应2h。反应液迅速冷至室温并加入60ml的丙酮沉淀得到产物，产物溶于20ml的正己烷中并用40ml的乙醇洗涤，得到粒径为8nm的金纳米颗粒，最后重悬于30ml的正己烷中保存备用。将1ml(3.3mg/ml)上述合成的8nm的金纳米颗粒(oam-cappedaunps)溶液加入2mg/mlhs-nta的pbs溶液(10ml)。反应混合液室温搅拌过夜，分出水相并用0.2μm的滤膜过滤，所得固体为含有nta配体的8nm的金纳米颗粒溶液。取1ml上述含nta配体的金纳米颗粒溶液加入20μl的50mm的cocl2溶液，得到具有co-nta配体修饰的金纳米颗粒。co-nta修饰的cds纳米棒的合成：先合成硫化镉种子：将0.100g氧化镉，0.603g磷酸正十八酯和3.299g三正辛基氧膦混合到一起，放于20ml双颈瓶中，将体系抽真空充氮气，反复三到五次，然后加热到300℃，持续30分钟使得氧化镉溶解。将溶液冷却到120℃，抽真空30分钟，充入氮气然后加热到320℃。当温度稳定之后，将硫溶液(将0.179g六甲基二硅硫烷溶于3g三正辛基膦中)快速注入到上述反应液中。纳米颗粒在250℃生长7.5分钟，然后将反应体系冷却然后快速注入甲苯终止反应。硫化镉种子用甲醇沉淀。然后用体积比为2∶1的甲苯甲醇混合液洗两次，沉淀溶解在三正辛基膦中。硫化镉种子在408nm处有吸收，在408nm处的摩尔吸光度(ε)为3.96x105cm-1m-1。硫化镉纳米棒的合成：混合0.086g氧化镉，3g三正辛基氧膦，0.290g磷酸正十八酯，0.080g己基磷酸于一个二十毫升双颈瓶中，然后在120℃抽真空。溶液在氮气保护的环境下加热到350℃并持续30分钟。然后加入1.5毫升三正辛基膦。当溶液温度稳定在350℃时，快速注入含有硫化镉种子的溶液(将0.124g硫和8×10-8mol硫化镉种子溶于1.5毫升三正辛基膦中)，反应8分钟之后，将反应液冷却，用体积比为1∶1∶1的丙酮、甲苯和甲醇的混合液沉淀。然后沉淀先用甲苯溶解，用辛胺清洗；然后加入甲醇使纳米晶沉淀，将沉淀出的纳米晶体用氯仿溶解，用壬酸清洗；最后用乙醇沉淀，得到硫化镉纳米棒。沉淀用甲苯溶解，避光保存在4℃冰箱。co-nta修饰硫化镉纳米棒的制备：1ml的乙醇加入1ml(10μmol/ml)的上述合成的(5mmol/l)cds纳米棒溶液中，离心，弃上清，并重悬于15ml的二氯甲烷。然后加入20mg/mlhs-nta甲醇溶液(1ml，ph＝13)，缓慢搅拌2min，加入9ml的pbs溶液，分出水相并用0.2μm的滤膜过滤，所得溶液为含有nta配体的cds纳米棒。取1ml上述含nta配体的cds纳米棒颗粒溶液加入20μl的50mm的cocl2溶液，得到具有co-nta配体修饰的cds纳米棒。spytag修饰的8nm金纳米颗粒(spytag-aunps)的制备：8nm金纳米颗粒的制备如上所述，在ode(10ml)，oam(10ml)andhaucl4.3h2o(0.1g，0.254mmol)的混合液中加入30mg的粒径为6nm的金纳米颗粒，氮气保护条件下搅拌使其溶解。反应液加热至80℃，反应2h。反应液迅速冷至室温并加入60ml的丙酮沉淀得到产物，产物溶于20ml的正己烷中并用40ml的乙醇洗涤，得到粒径为8nm的金纳米颗粒，最后重悬于30ml的正己烷中保存备用。取1mg合成的spytag短肽(氨基酸序列：ccgggsahivmvdaykptk，seqidno：11)加入10mlpbs溶解完全，加入300μl上述金纳米颗粒溶液，在室温下搅拌5小时，用0.2μm的滤膜过滤，所得溶液为含有spytag修饰的金纳米颗粒。co-nta修饰的cdses@zns量子点，金纳米颗粒，cds纳米棒在含6xhis标签的重组fuslc纳米纤维上的定向组装及表征：以实施例2制备的phis-mcherry-fuslc蛋白形成的纳米纤维为例，进行如下实验：对于co-nta修饰的cdses@zns量子点对纳米纤维的绑定，取1μlphis-mcherry-fuslc蛋白形成的纳米纤维溶液(40μm)加入49μlpbs缓冲液稀释50倍，加入5μlco-nta修饰的cdses@zns量子点(1mm)，轻轻吹打混合均匀，置于室温结合30分钟即可。对于co-nta修饰的金纳米颗粒对纳米纤维的绑定，取1μlphis-mcherry-fuslc蛋白形成的纳米纤维溶液(40μm)加入49μlpbs缓冲液稀释50倍，加入5μlco-nta修饰的金纳米颗粒溶液(1mm)，轻轻吹打混合均匀，置于室温结合30分钟即可。对于co-nta修饰的cds纳米棒对纳米纤维的绑定，取1μlphis-mcherry-fuslc蛋白形成的纳米纤维溶液(40μm)加入49μlpbs缓冲液稀释50倍，加入10μlco-nta修饰的纳米棒溶液(1mm)，轻轻吹打混合均匀，置于室温结合30分钟即可。co-nta修饰的cdses@zns量子点，金纳米颗粒，cds纳米棒在含6xhis标签的重组fuslc纳米纤维上的tem制样过程：取10μl结合后样品，滴于铜网(中镜科仪，bz10024a)上静置10min，用滤纸吸干。取10μl的含40mm咪唑的清洗液(清洗液配方：20mmtris-hciph7.5，500mmnaci，20mmbme，40mm咪唑)滴于铜网上清洗样品，去除co-nta的非特异性吸附，迅速用滤纸吸干，重复操作三次，再用10μl的去离子水洗一次，吸干。取10μl的(2.5mg/ml)醋酸铀溶液滴于铜网，染色30s，吸干，然后置于汞灯下烘烤30分钟，即可使用tem观察样品。图15a分别证明了co-nta修饰的cdses@zns量子点，金纳米颗粒，cds纳米棒在纳米纤维上面的定向组装。co-nta修饰的cdses@zns量子点，金纳米颗粒，cds纳米棒在含6xhis标签的重组fuslc纳米纤维上的afm制样过程：取40μl结合后的样品加清洗液至200μl，200μl溶液滴于平整的云母片静置30分钟，用300ml去离子水冲洗样品并用氮气吹干，利用afm接触模式扫样品表面形貌。图15a分别证明了co-nta修饰的cdses@zns量子点，金纳米颗粒，cds纳米棒在纳米纤维上面的定向组装。spytag修饰的金纳米颗粒在r-fuslc-spycatcher纳米纤维上的定向组装及表征以phis-egfp-fuslc-spycatcher与spytag-aunps的绑定为例，取1μl实施例2制备的phis-egfp-fuslc-spycatcher蛋白形成的纳米纤维溶液(40μm)加入49μlpbs缓冲液稀释50倍，加入50μlspytag修饰的金纳米颗粒(0.3mm)溶液，轻轻吹打混合均匀，置于室温结合2小时。tem表征：取10μl结合后样品，滴于铜网(中镜科仪，bz10024a)上静置10min，用滤纸吸干。取10μl的pbs缓冲液滴于铜网上清洗样品，迅速用滤纸吸干，重复操作三次，再用10μl的去离子水洗一次，吸干。取10μl的(2.5mg/ml)醋酸铀溶液滴于铜网，染色30s，吸干，然后置于汞灯下烘烤30分钟，即可使用tem观察样品，图15a显示金纳米颗粒均匀的绑定在纳米纤维上面。afm表征：取40μl结合后的样品加pbs缓冲液至200μl，200μl溶液滴于平整的云母片静置30分钟，用300ml去离子水冲洗样品并用氮气吹干，利用afm接触模式扫样品表面形貌。图15a显示金纳米颗粒均匀的绑定在纳米纤维上面。纳米颗粒在无规共聚物状复合纳米纤维上的定向组装及表征无规共聚物以实施例3所得的phis-egfp-fuslc-spycatcher蛋白与phis-mcherry-fuslc蛋白单体比例1∶1的纳米纤维为例，取1μl该纳米纤维溶液(40μm)加入49μlpbs缓冲液稀释50倍，加入50μlspytag修饰的金纳米颗粒溶液(0.3mm)以及5μlco-nta修饰的cds纳米棒(1mm)或cdses@zns量子点(1mm)，轻轻吹打混合均匀，置于室温结合2小时即可。tem表征：取10μl结合后样品，滴于铜网(中镜科仪，bz10024a)上静置10min，用滤纸吸干。取10μl的含40mm咪唑的清洗液滴于铜网上清洗样品，迅速用滤纸吸干，重复操作三次，再用10μl的去离子水洗一次，吸干。取10μl的(2.5mg/ml)醋酸铀溶液滴于铜网，染色30s，吸干，然后置于汞灯下烘烤30分钟，即可使用tem观察样品，图15b显示金纳米颗粒与cds纳米棒均匀的绑定在该无规共聚物状复合纳米纤维上面。纳米颗粒在嵌段纳米纤维上的定向组装及表征嵌段共聚物以实施例4中制得的phis-mcherry-fuslc纤维种子与phis-egfp-fus-spycatcher蛋白单体比例1∶3形成的纳米纤维为例，取1μl该纳米纤维溶液(40μm)加入49μlpbs缓冲液稀释50倍，加入50μlspytag修饰的金纳米颗粒溶液(0.3mm)以及5μlco-nta修饰的cds纳米棒(1mm)或cdses@zns量子点(1mm)，轻轻吹打混合均匀，置于室温结合2小时即可。tem表征：取10μl结合后样品，滴于铜网(中镜科仪，bz10024a)上静置10min，用滤纸吸干。取10μl的含40mm咪唑的清洗液滴于铜网上清洗样品，迅速用滤纸吸干，重复操作三次，再用10μl的去离子水洗一次，吸干。取10μl的(2.5mg/ml)醋酸铀溶液滴于铜网，染色30s，吸干，然后置于汞灯下烘烤30分钟，即可使用tem观察样品，图15c显示spytag修饰的金纳米颗粒部分的绑定在纳米纤维上面，这与嵌段纳米纤维的特征是吻合的。纳米颗粒在自分类纳米纤维上的定向组装及表征自分类纳米纤维以实施例5中制备的egfp-fuslc/csga自分类纳米纤维溶液(egfp-fus-spycatcher与csga-his蛋白单体比例10∶1)，取1μl该纳米纤维溶液加入49μlpbs缓冲液稀释50倍，加入50μlspytag修饰的金纳米颗粒(0.3mm)溶液以及5μlco-nta修饰的cds纳米棒(1mm)或cdses@zns量子点(1mm)，轻轻吹打混合均匀，置于室温结合2小时即可。tem表征：取10μl结合后样品，滴于铜网(中镜科仪，bz10024a)上静置10min，用滤纸吸干。取10μl的含40mm咪唑的清洗液滴于铜网上清洗样品，迅速用滤纸吸干，重复操作三次，再用10μl的去离子水洗一次，吸干。取10μl的(2.5mg/ml)醋酸铀溶液滴于铜网，染色30s，吸干，然后置于汞灯下烘烤30分钟，即可使用tem观察样品，图15d显示spytag修饰的金纳米颗粒绑定在较粗的fuslc纳米纤维上面，而co-nta修饰的cdses@zns量子点则有规律的分布在细小且卷曲的csga纤维上面，这与自分类纳米纤维的特征是基本吻合的。实施例7：基于不同聚合结构的纳米纤维的涂层及图案化防伪材料本实施例利用①实施例2得到的phis-mcherry-fuslc蛋白形成的纤维以及phis-cfp-fuslc蛋白形成的纤维1∶1简单混合，②按照实施例3中方法将phis-mcherry-fuslc蛋白以及phis-cfp-fuslc蛋白按比例1∶1无规共聚所得纤维，③按照实施例4中的方法将phis-mcherry-fuslc蛋白纤维溶液(2mg/ml)以及phis-cfp-fuslc蛋白单体(2mg/ml)双组份按体积比例1∶3混合所得嵌段纤维分别作为防伪材料进行如下实验。防伪材料的涂布与表征取2mg/ml防伪材料100微升滴在圆形玻璃片表面，在4000rpm转速下旋涂40s，重复以上步骤一次即可得到涂布了纳米纤维涂层的玻璃片。将玻璃片放在365nm紫外灯下可以看到三种防伪材料均表现出黄色的荧光(图16)。用正置荧光显微镜观察玻璃片上的纤维涂层，可以分别看到单组分纳米纤维对应的红色和绿色荧光纤维的简单混合，双组份无规共聚纳米纤维对应的黄色荧光纤维，双组份嵌段共聚纳米纤维对应的红色和绿色嵌段的荧光纤维。用400nm纳米波长的光激发玻璃片表面的涂层材料，都会激发出波长477nm的绿色荧光发射峰和610nm的红色荧光发射峰，而不是混合的用肉眼看到的黄色荧光发射峰。本方法以不同的防伪识别手段来鉴别。防伪材料的图案化及表征用20mm×20mm的红胶印章分别蘸取不同的防伪材料(2mg/ml)，压印在铝箔，玻璃片和聚对苯二甲酸乙二醇酯膜表面，在365nm紫外灯下观察可以看到携带信息的二维码，或用荧光显微镜观察并保存二维码，将其转化为灰度图片反向后即可通过图象输入设备或光电扫描设备自动识读处理信息(如图17)。用聚二甲基硅氧烷纳米印章分别蘸取不同的防伪材料，压印在玻璃片表面，在荧光显微镜下观察，可以分辨出其纳米级别的三角形阵列或圆形阵列。本手段以不同的尺度的防伪图案来识别。sequencelisting<110>上海科技大学<120>多功能复合超分子纳米纤维自组装体系及其应用<160>24<210>1<211>214<212>prt<213>人工序列fuslc<400>1metalaserasnasptyrthrglnglnalathrglnsertyrglyala151015tyrprothrglnproglyglnglytyrserglnglnserserglnpro202530tyrglyglnglnsertyrserglytyrserglnserthraspthrser354045glytyrglyglnsersertyrsersertyrglyglnserglnasnthr505560glytyrglythrglnserthrproglnglytyrglyserthrglygly65707580tyrglyserserglnserserglnsersertyrglyglnglnserser859095tyrproglytyrglyglnglnproalaproserserthrserglyser100105110tyrglyserserserglnsersersertyrglyglnproglnsergly115120125sertyrserglnglnprosertyrglyglyglnglnglnsertyrgly130135140glnglnglnsertyrasnproproglnglytyrglyglnglnasngln145150155160tyrasnserserserglyglyglyglyglyglyglyglyglyglyasn165170175tyrglyglnaspglnsersermetserserglyglyglyserglygly180185190glytyrglyasnglnaspglnserglyglyglyglyserglyglytyr195200205glyglnglnasparggly210<210>2<211>241<212>prt<213>人工序列egfp<400>2metvalserlysglyglugluleuphethrglyvalvalproileleu151015valgluleuaspglyaspvalasnglyhislyspheservalsergly202530gluglygluglyaspalathrtyrglylysleuthrleulyspheile354045cysthrthrglylysleuprovalprotrpprothrleuvalthrthr505560leuthrtyrglyvalglncyspheserargtyrproasphismetlys65707580glnhisaspphephelysseralametprogluglytyrvalglnglu859095argthrilephephelysaspaspglyasntyrlysthrargalaglu100105110vallysphegluglyaspthrleuvalasnargilegluleulysgly115120125ileaspphelysgluaspglyasnileleuglyhislysleuglutyr130135140asntyrasnserhisasnvaltyrilemetalaasplysglnlysasn145150155160glyilelysvalasnphelysilearghisasnilegluaspglyser165170175valglnleualaasphistyrglnglnasnthrproileglyaspgly180185190provalleuleuproaspasnhistyrleuserthrglnserlysleu195200205serlysaspproasnglulysargasphismetvalleuleugluphe210215220valthralaalaglyilethrleuglymetaspgluleutyrlysala225230235240gly<210>3<211>238<212>prt<213>人工序列mcherry<400>3metvalserlysglyglugluaspasnmetalaileilelysgluphe151015metargphelysvalhismetgluglyservalasnglyhisgluphe202530gluilegluglygluglygluglyargprotyrgluglythrglnthr354045alalysleulysvalthrlysglyglyproleuprophealatrpasp505560ileleuserproglnphemettyrglyserlysalatyrvallyshis65707580proalaaspileproasptyrleulysleuserpheprogluglyphe859095lystrpgluargvalmetasnphegluaspglyglyvalvalthrval100105110thrglnaspserserleuglnaspglyglupheiletyrlysvallys115120125leuargglythrasnpheproseraspglyprovalmetglnlyslys130135140thrmetglytrpglualasersergluargmettyrprogluaspgly145150155160alaleulysglygluilelysglnargleulysleulysaspglygly165170175histyraspalagluvallysthrthrtyrlysalalyslysproval180185190glnleuproglyalatyrasnvalasnilelysleuaspilethrser195200205hisasngluasptyrthrilevalgluglntyrgluargalaglugly210215220arghisserthrglyglymetaspgluleutyrlysalagly225230235<210>4<211>241<212>prt<213>人工序列cfp<400>4metvalserlysglyglugluleuphethrglyvalvalproileleu151015valgluleuaspglyaspvalasnglyhislyspheservalsergly202530gluglygluglyaspalathrtyrglylysleuthrleulyspheile354045cysthrthrglylysleuprovalprotrpprothrleuvalthrthr505560leuthrtrpglyvalglncysphealaargtyrproasphismetlys65707580glnhisaspphephelysseralametprogluglytyrvalglnglu859095argthrilephephelysaspaspglyasntyrlysthrargalaglu100105110vallysphegluglyaspthrleuvalasnargilegluleulysgly115120125ileaspphelysgluaspglyasnil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