一种耐辐射类芽孢杆菌KH9及其在生物抗蒸腾剂中的应用的制作方法

本发明属于微生物技术领域，涉及一种耐辐射类芽孢杆菌新菌种及其在生物抗蒸腾剂中的应用的技术领域。

技术背景

随着温室效应的加剧，干旱趋势将进一步延续。目前，世界上有1/3的土地处于干旱、半干旱状态，我国也有48.9％的耕地处于干旱、半干旱地区。干旱胁迫作为一种主要的非生物胁迫，严重制约着农业的可持续发展，将导致作物生长缓慢、产量降低、病虫害加重等现象，因此有必要发展高效抗旱节水措施。

近年来，化学节水技术越来越多地应用到农业抗旱中，抗蒸腾剂的使用就是其中比较有效的措施之一。抗蒸腾剂喷施于植物叶面后，能够降低植物的蒸腾速率、减少水分散失，并通过影响保护酶系统活性从而提高植物的抗旱性。但是研究表明使用现有的抗蒸腾剂会导致叶面气孔封闭进而光合作用减弱，净光合产物减少，进而作物生长减慢。因此需要开发一种新的抗蒸腾剂，克服上述缺点，使抗蒸腾剂在农业抗旱生产上的能更加有效地利用。

微生物的抗旱作用除通过调节自身代谢活动诱导植物产生抗性外，某些微生物产多糖物质，由于其特殊的高聚物结构，可以在叶表面形成以细胞胞外复合物(eps)为主要成分的生物薄膜来诱发气孔反应，降低植物蒸腾作用，提高水分利用效率，以抵御水分亏缺，起到保水保肥和改良土壤结构等功能。将微生物与抗蒸腾剂进行复配研发新型生物抗蒸腾剂，在保留其各自优势基础上，将能发挥出更高效、更可靠的效果，但目前关于两者复配对植物抗旱的协同作用的报道很少，因此需要进一步探究微生物的抗旱作用，为微生物抗旱提供具有降低植物蒸腾作用且性能稳定的抗性菌株，将在植物抗旱领域有潜在的应用开发前景。

技术实现要素：

针对现有技术中未见有关本发明中的耐辐射类芽孢杆菌新菌种及在生物抗蒸腾剂中的应用的相关报道，且现有的抗蒸腾剂会导致叶面气孔封闭减弱光合作用，从而使作物生长减慢的现状，本发明旨在为生物抗蒸腾剂中提供具有降低植物蒸腾作用且性能稳定的抗性菌株。本发明通过在土壤样品中分离筛选出一株耐辐射类芽孢杆菌新菌种，且具有产多糖能力较高从而显著的降低植物蒸腾作用。通过提供一种耐辐射类芽孢杆菌(paenibacillussp.)kh9cgmccno.12799，以及利用该菌与抗蒸腾剂复配的方法及在抗旱中的应用技术方案。

本发明采用的主要技术方案：

本发明土壤样品由新疆农业科学院微生物应用研究所采自新疆罗布泊周边干旱荒漠地区，将采集的土壤样品经5000kgy钴源进行辐照后，以pda培养基为分离培养基，大量筛选、优选出一批生长良好、黏稠不易挑起的耐辐射细菌菌株，进行16srrna基因序列的测定，从中筛选出一株产多糖能力较高的耐辐射类芽孢杆菌新菌种(paenibacillussp.)。

本发明具体提供一种耐辐射类芽孢杆菌(paenibacillussp.)kh9cgmccno.12799，通过提供确定的的筛选方法，在采集的土壤样品中分离筛选和培养，获得一批类芽孢杆菌微生物菌株，从中筛选出一株产多糖能力较高的类芽孢杆菌菌株kh9，经微生物学分类与鉴定，属于类芽孢杆菌(paenibacillussp.)菌株，暂命名为paenibacillussp.kh9。

具体的，本发明通过对采集土壤样品经5000kgy钴源进行辐照后，进行分离、筛选和培养，从中筛选出一株编号为kh9的菌株，经微生物学分类与鉴定，该菌株属于类芽孢杆菌(paenibacillussp.)菌株。该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)。地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。保藏日期2016年7月20日，菌种保藏号为cgmccno.12799。经微生物学鉴定为类芽孢杆菌(paenibacillussp.)kh9。该菌株最适生长条件为：温度30℃，培养基采用pda培养基(马铃薯200g/l、葡萄糖20g/l、琼脂15g/l、蒸馏水1l，ph自然)，培养时间3d；经3d培养后，在pda培养基表面，菌落呈圆形、边缘整齐、凸起、光滑、粉红色、不透明、黏稠不易挑起；该菌为革兰氏阳性菌、好氧、运动性、菌体杆状、周生鞭毛、有内生孢子形成。根据以上形态特征，参照《伯杰氏系统细菌学鉴定手册》第八版和《常用细菌系统鉴定手册》对kh9菌株进行形态学，生理生化鉴定，并结合分子生物学测序，初步鉴定该菌株为类芽孢杆菌(paenibacillussp.)的成员，但该菌种具有新菌种鲜明特征，从其分类学角度，暂命名为耐辐射单格孢属真菌paenibacillussp.kh9。

同时，本发明通过提取菌株kh9的总dna，采用采用细菌16srdnapcr扩增通用引物，进行pcr扩增，pcr产物经切胶纯化后测序。将所测16srrna基因序列与genbank数据库中的序列进行比对，结果表明：菌株kh9与模式菌株paenibacillusxylanexedensnrrlb-1090t(clg48537)最大同源为97.3％，与同属其它菌株同源性均小于97.0％，尚不能确定其确切分类，确定为一株新菌种，从其分类学角度暂命名为paenibacillussp.kh9。

进一步，本发明提供一种耐辐射类芽孢杆菌(paenibacillussp.)kh9cgmccno.12799与抗蒸腾剂复配及在抗旱中的应用。本发明使用的抗蒸腾剂是以骆驼刺碱性精油、黄腐酸为主要原料，通过化学洗选、提纯、活化工艺，生产的富含氨基酸、脯氨酸、脱落酸以及大中微量等元素的抗蒸腾剂，使用时复配kh9菌体。该菌种明显具有降低作物的蒸腾作用，增强光合作用，显著增加叶绿素含量，增强植物酶系生理活性，刺激植物根系生长。

通过实施本发明具体技术指标，实现本发明内容，可以达到以下有益效果：

(1)本发明提供的耐辐射类芽孢杆菌(paenibacillussp.)kh9cgmccno.12799，具有培养条件简单，繁殖快，遗传特性稳定，产多糖能力较高的优点。

(2)本发明提供的耐辐射类芽孢杆菌(paenibacillussp.)kh9cgmccno.12799与抗蒸腾剂复配在抗旱中应用时，在作物叶片形成生物薄膜，能有效降低作物的蒸腾作用，增强光合作用，叶绿素含量提高了4.50％，对作物具有更强的生长能力、渗透调节能力和活性氧防御能力，能降低作物受干旱胁迫的破坏程度。

附图说明

图1所示为耐辐射类芽孢杆菌(paenibacillussp.)kh9cgmccno.12799的菌落和菌体照片。

图2所示为所示为耐辐射类芽孢杆菌(paenibacillussp.)kh9cgmccno.12799系统发育树状图。

图3所示为基于耐辐射类芽孢杆菌(paenibacillussp.)kh9cgmccno.12799的生物抗蒸腾剂对干旱胁迫下小麦幼苗叶片相对含水量的影响。

图4所示为基于耐辐射类芽孢杆菌(paenibacillussp.)kh9cgmccno.12799的生物抗蒸腾剂对干旱胁迫下小麦幼苗叶片脯氨酸含量的影响。

图5所示为基于耐辐射类芽孢杆菌(paenibacillussp.)kh9cgmccno.12799的生物抗蒸腾剂对干旱胁迫下小麦幼苗叶片丙二醛含量的影响。

图6所示为基于耐辐射类芽孢杆菌(paenibacillussp.)kh9cgmccno.12799的生物抗蒸腾剂对干旱胁迫下小麦幼苗叶片超氧化物歧化酶(sod)活性的影响。

具体实施方式

下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。本发明中选用的所有原辅材料，以及选用的菌种培养方法都为本领域熟知选用的，本发明中涉及到的％都为重量百分比，除非特别指出除外。

实施例一：耐辐射类芽孢杆菌(paenibacillussp.)kh9cgmccno.12799的分离、筛选及鉴定

1、菌种的分离和筛选

本发明所使用的类芽孢杆菌(paenibacillussp.)kh9由新疆农业科学院微生物应用研究所从新疆罗布泊周边干旱荒漠地区大量采集土壤中取样，经5000kgy钴源进行辐照后分离，利用传统的平板培养法分离出土层中的产多糖的细菌，平板划线法纯化菌株，经过优化筛选出一批生长良好、产多糖能力强的细菌菌株，从中优选出一株编号为kh9的菌株。

分离步骤：

(1)土样稀释液的制备：将经5000kgy钴源辐照过的土样，按照固液比例1︰10溶于含无菌水的三角瓶中，玻璃棒搅拌后30℃恒温振荡(160r/min)培养30min，取出三角瓶置于水平桌面静置30min。取1ml上清液于装有含9ml灭菌水的试管中，充分混匀，按梯度稀释法逐级稀释至10^-4。

(2)分离纯化：取10^-2、10^-3、10^-4稀释液各1ml涂布于pda固体培养基上，立即用玻璃刮铲涂抹均匀。将平板倒置于30℃恒温培养箱培养5d。待菌落长出后，挑取菌落表面光滑、黏稠、不易提起的细菌单菌落，采用划线法继续分离纯化，直至获得纯培养。

2、菌株的培养条件

(1)编号为kh9的菌株的生长培养基为pda培养基：马铃薯200g/l、葡萄糖20g/l、琼脂15g/l、蒸馏水1l，ph自然，经30℃、96h培养。

(2)编号为kh9的菌株在20-40℃条件下均能生长，最适生长温度为30℃，培养时间为3-5d。

(3)编号为kh9的菌株最适生长ph7。

具体的，本发明通过对采集土壤样品经5000kgy钴源进行辐照后，进行分离、筛选和培养，从中筛选出一株编号为kh9的菌株，经微生物学分类与鉴定，该菌株属于类芽孢杆菌(paenibacillussp.)菌株。该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)。地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。保藏日期2016年7月20日，菌种保藏号为cgmccno.12799。经微生物学鉴定为类芽孢杆菌的新菌种，从其分类学角度暂定分类为类芽孢杆菌(paenibacillussp.)kh9。该菌株最适生长条件为：温度30℃，培养基采用pda培养基(马铃薯200g/l、葡萄糖20g/l、琼脂15g/l、蒸馏水1l，ph自然)，培养时间3d。

3、菌株kh9的生理生化鉴定

形态特征：将kh9菌株划线接种于pda平板上培养3d后，菌落呈圆形、边缘整齐、凸起、光滑、粉红色、不透明、黏稠不易挑起；该菌为革兰氏阳性菌、好氧、运动性、菌体杆状、周生鞭毛、有内生孢子形成，其菌落和菌体形态参见附图1。

生理生化特征：biologgn2板检测该菌可利用的碳源为：环糊精、糊精、甘露聚糖、吐温40、吐温80、醋酸、γ-羟基丁酸、α-酮戊二酸、丙酮酸、琥珀酰胺酸、琥珀酸、2-脱氧腺苷、肌苷和d-洛酮糖。

通过上述菌种耐辐射类芽孢杆菌(paenibacillussp.)kh9cgmccno.12799的菌体形态、培养特征观察及生理生化指标测定，即通过菌体形态观察、菌株培养特征观察、生长温度测定等试验，参照《伯杰氏系统细菌学鉴定手册》第八版和《常用细菌系统鉴定手册》的方法进行，编号为kh9的菌种与常见的类芽孢杆菌菌种相比，具有明显的生理生化特性差异，且产抗生素和多糖的能力更强，表明kh9菌株是一种典型的新菌种，从其分类学角度，该菌株归属类芽孢杆菌(paenibacillussp.)的成员，暂命名为耐辐射单格孢属真菌paenibacillussp.kh9。

实施例二：耐辐射类芽孢杆菌(paenibacillussp.)kh9cgmccno.12799分子水平鉴定

提取菌株kh9的总dna，采用采用细菌16srdnapcr扩增通用引物，进行pcr扩增，pcr产物经切胶纯化后测序。将实验菌株的所得序列与genbank数据库中的已知序列进行blast比较，确定与实验菌株亲缘关系最近的种属关系。并结合eztaxon(http://www.ezbiocloud.net/eztaxon)中序列比对并调取相关模式菌株序列，以进行系统发育树分析标准模式菌序列，利用mega5.0软件包采用邻接法(neighbor-joiningmethod)进行聚类分析和系统进化树构建。由系统进化树可示，菌株kh9与模式菌株paenibacillusxylanexedensnrrlb-1090t(clg48537)最大同源为97.3％，与同属其它菌株同源性均小于97.0％，系统进化树参见附图2，编号为kh9的菌种与其常见的类芽孢杆菌(paenibacillussp.)成员菌具有鲜明的区别，具有明显的分子水平差异性，确定为类芽孢杆菌的新菌种，从其分类学角度，该菌株归属类芽孢杆菌(paenibacillussp.)的成员，暂命名为paenibacillussp.kh9。

实施例三：耐辐射类芽孢杆菌(paenibacillussp.)kh9cgmccno.12799菌体的制备

将经活化的本发明菌株耐辐射类芽孢杆菌(paenibacillussp.)kh9cgmccno.12799接种于装有5mlpda液体培养基的种子试管中，于30℃培养，200rpm振荡培养36h后，按2％接种量接种于pda液体培养基中(装添量为500ml三角瓶装100mlpda液体培养基)，于30℃培养，200rpm摇瓶发酵3-4天，有效活菌数≥2亿/ml。

实施例四：基于耐辐射类芽孢杆菌(paenibacillussp.)kh9cgmccno.12799的生物抗蒸腾剂在抗旱中的应用

1.使用方法：

抗蒸腾剂包含的成分：液体黄腐植酸≥80g/l、氮磷钾≥40g/l、骆驼刺精油≥80g/l、氨基酸≥5g/l。

复配：使用前将抗蒸腾剂稀释500倍，菌液的喷施量为稀释后的抗蒸腾剂重量的20％。

2.盆栽试验

本发明采用盆栽方法，供试土壤为灰漠土。去除石子和草根后过筛，并添加尿素、重过磷酸钙和硫酸钾作为底肥(按照施氮量为200mg/kg，n:p2o5:k2o＝18:20:8计算)，充分拌匀。试验设3个灌水量水平，分别是：充分供水，生育期土壤含水量维持在田间持水量的75％；轻度水分胁迫，生育期土壤含水量维持在田间持水量的65％；重度水分胁迫，生育期土壤含水量维持在田间持水量的55％。每个灌水量水平下设3个处理分别为：ck：不添加抗蒸腾剂和菌剂、t1：50倍稀释抗蒸腾剂、t2：50倍稀释抗蒸腾剂+20％的微生物菌。

ck、t1、t2处理分别采用水，50倍稀释抗蒸腾剂、50倍稀释抗蒸腾剂+20％的菌剂拌小麦种子后闷30min，然后晾干后播种，充分供水。于3叶期时控制土壤水分含量，采用不同抗旱处理，均匀喷施于小麦叶片上。喷施后每两天补充所消耗掉的水分。

3.耐辐射类芽孢杆菌(paenibacillussp.)kh9cgmccno.12799生物抗蒸腾剂对不同水分胁迫下小麦叶片相对含水量的影响

在喷施5天后进行小麦叶片的相对含水量的测定，结果如附图3所示，含类芽孢杆菌新菌种的生物抗蒸腾剂在55％水分条件下叶片相对含水量高于单施抗蒸腾剂处理15.23％。由此可以看出含类芽孢杆菌新菌种的生物抗蒸腾剂可以增强植物叶片的相对含水量，减少叶片的蒸腾能力。

4.耐辐射类芽孢杆菌(paenibacillussp.)kh9cgmccno.12799生物抗蒸腾剂对不同水分胁迫下小麦幼苗生长的影响

在轻度水分胁迫(65％)和重度水分胁迫(55％)下，喷施含类芽孢杆菌生物抗蒸腾剂对小麦幼苗的生长和叶绿素含量有一定的促进作用，结果如表1所示：

表1：不同处理的生物抗蒸腾剂对小麦幼苗生长的影响

由表1可知，与单施抗蒸腾剂的处理相比，在65％水分条件下，复配kh9菌体的小麦幼苗生物量提高了11.86％、株高提高了2.35％、叶绿素含量提高了4.50％；在55％水分条件下，t1和t2处理生物量差异不显著。

5.耐辐射类芽孢杆菌(paenibacillussp.)kh9cgmccno.12799生物抗蒸腾剂对不同水分胁迫下小麦幼苗叶片脯氨酸(pro)和丙二醛(mda)的影响

从附图4可以看出，65％和55％两个水分条件下复配类芽孢杆菌新菌种的抗蒸腾剂处理小麦幼苗叶片脯氨酸(pro)含量较单施抗蒸腾剂的处理分别降低了11.08％和16.93％。

从附图5可以看出，与单施抗蒸腾剂的处理相比，含类芽孢杆菌新菌种的抗蒸腾剂处理在55％水分条件下小麦幼苗叶片丙二醛(mda)含量降低了10.48％，但65％水分条件下反而升高。

6.耐辐射类芽孢杆菌(paenibacillussp.)kh9cgmccno.12799生物抗蒸腾剂对不同水分胁迫下小麦幼苗叶片超氧化物歧化酶(sod)的影响

从附图6可以看出，与单施抗蒸腾剂的处理相比，含类芽孢杆菌新菌种的抗蒸腾剂处理在55％水分条件下sod酶的活性5.00％，但在65％水分条件下却升高。

综合以上实验可知，将本发明提供的耐辐射类芽孢杆菌(paenibacillussp.)kh9cgmccno.12799研制成生物抗蒸腾剂，在低水分条件下，相对于单施抗蒸腾剂能有效降低作物的蒸腾作用，增强光合作用，叶绿素含量提高了4.50％，同时对作物具有更强的生长能力、渗透调节能力和活性氧防御能力，能改善作物受干旱胁迫的破坏程度。

上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所延伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。

sequencelisting

<110>新疆农业科学院微生物应用研究所（中国新疆-亚美尼亚生物工程研究开发中心）

<120>一种耐辐射类芽孢杆菌kh9及其在生物抗蒸腾剂中的应用

<130>kh9

<160>1

<170>patentinversion3.3

<210>1

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<212>dna

<213>kh9

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