高效利用葡萄糖的酿酒酵母基因工程菌及其构建方法与应用与流程

本发明涉及微生物、分子生物学领域，具体涉及一株高效利用葡萄糖的酿酒酵母菌株及其构建方法与应用。

背景技术：

面对矿物燃料储备的迅速消耗、全球变暖等问题，可持续可再生能源成了全球性的研究热点。生物乙醇是替代传统燃料的首选。酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)具有高乙醇耐受性、并且能在严格厌氧条件下发酵等优点，是工业化产乙醇的首选。

葡萄糖是生产生物乙醇的淀粉原料及糖类原料中含量最高的单糖。葡萄糖发酵过程中，酿酒酵母的生存能力、细胞比生长速率和糖吸收速率都直接和培养基条件相关。nagodawithana和steinkraus的研究发现在酿酒酵母的发酵过程中，除了乙醇，还有其他副产物会对代谢产生抑制作用，并导致产物的不纯。为了提高酿酒酵母乙醇生产过程中的发酵性能，学者们进行了各种尝试，发现微生物细胞的固定化发酵能够消除由高浓度的底物和产物产生的抑制作用，提高乙醇产量和产率。najafpour等人利用固定化细胞反应器成功提高了酿酒酵母发酵产乙醇的能力。和传统游离分批发酵相比，利用固定化细胞反应器进行的发酵乙醇产量提高了27％，而且发酵时间由24h缩短到7h。陈勇等人将纤维置于反应器内对细胞进行固定化，由固定化细胞发酵得到的乙醇产率比游离细胞高了41.93％，且固定化的酵母细胞稳定性增强，分批发酵能够稳定进行22批次。

作为一种高效的细胞工厂，酿酒酵母的代谢能够被设计成满足特定的需求，而且酿酒酵母已经完成了全基因组的测序，高通量的分析手段比如基因芯片、含有细胞信息的数据库以及健全的基因操作技术极大地提高了酿酒酵母代谢工程的精确度。然而，对代谢网络的设计往往会遇到出乎意料的结果，这是因为胞内组分间高度关联，会趋向抵消或者扩大人为引起的突变。辅因子在代谢网络中属于关联度最高的代谢物，因此虽然是对单个反应进行操作，但是对参与该反应的辅因子浓度的改变会对代谢产生广泛的影响。

在代谢网络中，辅因子能持续供应吉布斯自由能、氧化还原当量和官能团。它们被认为是代谢网络中最紧密的连接节点。腺苷-3-磷酸(atp)和还原型的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nadh)分别参与了酿酒酵母代谢网络中的188个和160个反应。这些辅因子在代谢网络的不同分支之间创建了一个紧密的联系，辅因子的不平衡可以引发一个不稳定的系统，这意味着改变局部反应的通量的影响可以扩散到代谢网络的其他部分，甚至产生全局响应。正因为辅因子对代谢网络有着这样重要的作用，因此辅因子调控具有成为调控生物催化强有力的手段的潜力。辅因子主要包括atp、氧化还原辅因子(nad(h),nadp(h))以及一些官能团载体。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供高效利用葡萄糖的的酿酒酵母基因工程菌，以提高酿酒酵母的发酵性能。

本发明还要解决的技术问题是提供上述酿酒酵母基因工程菌的构建方法。

本发明最后要解决的技术问题是提供上述酿酒酵母基因工程菌在发酵中的应用。

高效利用葡萄糖的酿酒酵母基因工程菌，该基因工程菌是分别在酿酒酵母菌中过表达噻唑合酶thi4或全局转录因子hap4。

噻唑合酶thi4催化腺苷二磷酸-5-(-乙烷基)-4-甲基噻唑-2-羧酸(adt)生成5-羟乙基-4-甲基噻唑(het)。

优选地，所述的酿酒酵母菌为s.cerevisiaeby4741(mata；ura3；his3；leu2；met15)。

优选地，所述的噻唑合酶thi4，其核苷酸序列如seqidno.：1所示。

优选地，所述的全局转录因子hap4，其核苷酸序列如seqidno.：2所示。

上述高效利用葡萄糖的酿酒酵母基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将噻唑合酶thi4的基因序列或全局转录因子hap4的基因序列分别克隆到表达质粒上，得到重组质粒；

(2)将步骤(1)得到的重组质粒转化酿酒酵母菌。

其中，步骤(1)中，所述表达质粒为pyx212。

其中，步骤(2)中，所述酿酒酵母菌为s.cerevisiaeby4741(mata；ura3；his3；leu2；met15)。

上述高效利用葡萄糖的酿酒酵母基因工程菌在发酵中的应用在本发明的保护范围之内。

上述高效利用葡萄糖的酿酒酵母基因工程菌在发酵产乙醇中的应用在本发明的保护范围之内。

利用该菌株进行发酵的培养条件如下：

发酵前，种子培养培养条件如下：培养温度为30～32℃，培养时间为20～24h，转速为200～240rpm；

发酵时，发酵培养条件如下：培养温度为30～32℃，培养时间为26～50h，转速为200～240rpm。

利用该菌株进行发酵的培养基配方如下：

种子培养基的配方如下：葡萄糖20～30g/l，酵母粉10～20g/l，蛋白胨20～30g/l，初始ph5.2～5.5，溶剂为水；

发酵培养基的配方如下：葡萄糖90～120g/l，酵母粉10～20g/l，蛋白胨20～30g/l，初始ph5.2～5.5，溶剂为水。

本领域的技术人员可以对上述培养条件或培养基配方进行调整。

具体的培养方法如下：用接种环或枪头从-80℃保藏的30％甘油管中的单菌落挑取适量接种于5mlypd液体培养基中，30℃，200rpm培养20～24h，此培养物为一级种子。

一级种子培养结束后，转接于装有100mlypd液体培养基的500ml锥形瓶中，接种量5～10％，30℃，200rpm培养20～24h，此培养物为二级种子。

二级种子培养结束后，进行发酵培养基的接种。转接于装有100ml液体发酵培养基的500ml锥形瓶中，接种量5～10％。30～32℃，200rpm条件下进行发酵。发酵条件为好氧培养，控制方法为发酵过程中在500ml锥形瓶瓶口包扎八层纱布。

培养基成分：

种子培养基的组分为：葡萄糖20～30g/l，酵母粉10～20g/l，蛋白胨20～30g/l，初始ph5.2～5.5。发酵培养基的组分为：葡萄糖90～120g/l，酵母粉10～20g/l，蛋白胨20～30g/l，初始ph5.2～5.5。

培养基灭菌条件：115℃，20min。

在酿酒酵母中过表达催化nadh氧化为nad⁺的nadh氧化酶除了起到改变酵母胞内的氧化还原状态的作用，还能够加快葡萄糖消耗、减少胞内ros积累、增加细胞耐高渗能力，这些改变都与压力响应有关，在转录水平上与之对应的参与氧化压力调节的硫胺的合成途径中的thi基因以及与饥饿响应相关的hap4基因的表达上调。

硫胺是酿酒酵母代谢中一个重要的辅因子，能够减轻氧化还原压力。5-羟乙基-4-甲基噻唑(het)是硫胺合成的前体，腺苷二磷酸-5-(-乙烷基)-4-甲基噻唑-2-羧酸(adt)是het的前体，该反应由噻唑合酶thi4催化，nad⁺是adt的碳水化合物前体。过表达nadh氧化酶能提高nad⁺的再生，adt的合成受到调节，继而影响硫胺的合成。

在发酵过程中，当酵母细胞耗尽发酵性碳源后，会经历一个双峰转换时期，将它的代谢转变为利用发酵液中的乙醇进行氧化分解代谢，也就是说nadh氧化酶过表达菌株会比对照菌株更早的经历双峰转换时期。过表达全局转录调控因子hap4能够引起在双峰转换时期发生的变化。nadh氧化酶过表达菌株中hap4的表达在对数生长期末期上调。hap4调控的基因涉及氧化磷酸化、锌代谢、糖转运和糖异生等。

有益效果：

与现有技术相比，本发明在单倍体酿酒酵母菌株by4741(mata；ura3；his3；leu2；met15)中以表达载体组成型高拷贝质粒pyx212分别过表达酿酒酵母内源的噻唑合酶thi4(由thi4编码)和全局转录调控因子hap4(由hap4编码)，得到高效利用葡萄糖的菌株。能够实现在发酵过程中提高葡萄糖消耗速率、菌体生长速率和乙醇产量。本发明分子操作简单，无需经过长期的进化过程，是提高酿酒酵母乙醇发酵性能的一种尝试。

附图说明

图1过表达thi4质粒载体图谱，所用表达质粒为组成型高拷贝质粒pyx212。

图2过表达hap4质粒载体图谱，所用表达质粒为组成型高拷贝质粒pyx212。

图3con，thi4与hap4以葡萄糖为碳源时葡萄糖消耗(a)、菌体生长(b)、乙醇产生(c)情况。

具体实施方式

本发明公开了两种菌株、其制备方法及应用，以及该菌株的发酵方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明以酿酒酵母by4741(mata；ura3；his3；leu2；met15)为出发菌株，以表达载体组成型高拷贝质粒pyx212分别过表达噻唑合酶thi4(图1)和全局转录调控因子hap4(图2)，得到菌株thi4与hap4。用该菌株做葡萄糖好氧培养发酵，发酵过程中用高效液相色谱hplc测定培养基中的葡萄糖、乙醇、甘油含量。

用接种环或枪头从-80℃保藏的30％甘油管中的单菌落挑取适量接种于5mlypd液体培养基中，30℃，200rpm培养20～24h，此培养物为一级种子。

一级种子培养结束后，转接于装有100ml液体种子培养基的500ml锥形瓶中，接种量5～10％，30℃，200rpm培养20～24h，此培养物为二级种子。

二级种子培养结束后，进行发酵培养基的接种。转接于装有100ml液体发酵培养基的500ml锥形瓶中，接种量5～10％。30～32℃，200rpm条件下进行发酵。发酵条件为好氧培养，控制方法为发酵过程中在500ml锥形瓶瓶口包扎八层纱布。

发酵过程中每4h进行取样分析，hplc条件：bensonbp-100pb⁺⁺色谱柱，柱温80℃，流动相为超纯水，流速0.4ml/min，每个样品运行30min。菌体生长采用分光光度计在波长600nm下测定吸光值。

本发明提供的菌株、其制备方法及应用，以及该菌株的发酵方法中所用原料及试剂均可由市场购得。其中，所用宿主菌株为酿酒酵母by4741(mata；ura3；his3；leu2；met15)。所用表达载体为组成型高拷贝质粒pyx212。

本专利所用的对照菌株，获得方式为：在by4741中表达空质粒pyx212，命名为“con”。

实施例1：

以酿酒酵母菌株by4741(mata；ura3；his3；leu2；met15)为出发菌株，以表达载体组成型高拷贝质粒pyx212过表达thi4，得到重组菌株thi4；以表达载体组成型高拷贝质粒pyx212过表达hap4，得到重组菌株hap4；含有空质粒的酿酒酵母菌株

by4741(mata；ura3；his3；leu2；met15)为对照菌con。

用上述三株菌做葡萄糖好氧发酵实验：

种子培养基为合成培养基ypd，发酵培养基为初糖浓度为100g/l的ypd培养基。用接种环或枪头从-80℃保藏的30％甘油管中的单菌落挑取适量接种于5mlypd液体培养基中，30℃，200rpm培养20～24h，此培养物为一级种子。

一级种子培养结束后，转接于装有100mlypd液体培养基的500ml锥形瓶中，接种量5～10％，30℃，200rpm培养20～24h，此培养物为二级种子。

二级种子培养结束后，进行发酵培养基的接种。转接于装有100ml液体发酵培养基的500ml锥形瓶中，接种量5～10％。30～32℃，200rpm条件下进行发酵。发酵条件为好氧培养，控制方法为发酵过程中在500ml锥形瓶瓶口包扎八层纱布。

发酵过程中进行取样分析，hplc条件：bensonbp-100pb⁺⁺色谱柱，柱温80℃，流动相为超纯水，流速0.4ml/min，每个样品运行30min。菌体生长采用分光光度计在波长600nm下测定吸光值。

实验结果图3所示，图3中酿酒酵母对照菌株con，thi4过表达菌株thi4，hap4过表达菌株hap4。

结果显示，thi4和hap4的发酵性能都优于con。发酵26h后，thi4和hap4菌株发酵液中的残糖已经低于0.5g/l，而此时con的发酵液中还剩38.24g/l葡萄糖。thi4菌株发酵30h后od600达到最大值27.9，hap4菌株发酵34h后od600达到最大值29.05，而con菌株发酵40h后od600仅为10.05。过表达thi4和hap4后改变了酿酒酵母菌株代谢通量的分布。thi4和hap4菌株发酵26h后乙醇产量达到最大值，分别为30.12和34.63g/l，con发酵40h后乙醇产量为28.78g/l。发酵40h后，thi4和hap4菌株甘油产量分别为1.35和1.40g/l，而con的甘油产量为8.87g/l。在con的代谢过程中，副产物甘油的产量很高，过表达thi4和hap4后，甘油支路活性大大降低，碳源流向菌体生长和乙醇产生。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

sequencelisting

<110>南京工业大学

<120>高效利用葡萄糖的酿酒酵母基因工程菌及其构建方法与应用

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