本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种高产s-腺苷蛋氨酸的酿酒酵母菌株及其在发酵生产s-腺苷蛋氨酸中的应用。
背景技术：
s-腺苷蛋氨酸（s-adenosyl-methionine，简写为sam）,是生物体内广泛存在的重要代谢中间体，也是蛋氨酸(methionine，met)的活化形式，它于1952年由cantoni发现。在生物学上，s-腺苷蛋氨酸是重要的甲基供体，具有转甲基、转硫基和转氨丙基三方面的作用。在临床上,s-腺苷蛋氨酸在70年代末在欧洲作为治疗关节炎的抗炎止痛药,80年代中期在欧洲作为抗抑郁症的精神病药物,90年代在美国作为抗抑郁、保肝等的非处方药和营养保健品，近年来则用来治疗各种急、慢性肝病。s-腺苷蛋氨酸对于原发纤维性肌痛、偏头痛、阿尔茨海默、癫痫、老年性痴呆等以及增加不育男性的精子活力，治疗多发性硬化、帕金森氏病、亚急性脊髓变性、睡眠紊乱、心脏病、脑缺血以及hiv引起的神经性并发症等多种疾病。
s-腺苷蛋氨酸的制备方法始于20世纪50年代，主要的制备方法有化学合成法、酶促合成法和微生物发酵法。相比化学法成本高、产率不高、纯度低、稳定性差、污染环境；酶法催化效率很低、atp原料成本比较高、酶活限制等问题；微生物发酵法具有成本低廉、产物纯度高且活性强、稳定性好、环境污染小等特点，因此生物法制备s-腺苷蛋氨酸是近年来工业生产s-腺苷蛋氨酸的主要途径。目前生物法合成s-腺苷蛋氨酸的主要菌种包括：霉菌（molds）、细菌、假丝酵母（candidaalbicans）、清酒酵母(saccharomycessake)、糖酵母(saccharomyces)、毕赤酵母（pichiapastoris）、酿酒酵母（saccharomycescerevisiae）、乳酸克鲁维酵母（scheffersomycesstipitis）、马克斯克鲁维酵母（kluyveromycesmarxianus）、谷氨酸棒杆菌（corynebacteriumglutamicum）和大肠杆菌（escherichiacoli）等,其中酿酒酵母（saccharomycescerevisiae）生长繁殖快、代期短，生产不受季节、气候和地区的限制；与其他微生物相比，具有易于收集，代谢方式多样性，对环境的适应性较强和人们易于接受等特性，所以酿酒酵母（saccharomycescerevisiae）是目前研究发现的生产s-腺苷蛋氨酸的重要工业菌种之一。但是原始酿酒酵母菌株在发酵生产s-腺苷蛋氨酸的过程中，对温度以及ph的控制要求较严格，严重影响了s-腺苷蛋氨酸的产量，为s-腺苷蛋氨酸的生产条件控制增加了很大的负担。
目前，现有技术中，酿酒酵母生产s-腺苷蛋氨酸的主要研究有：高产sam菌株的理性化筛选育种、微生物发酵过程优化以及代谢工程改造3个方向。迄今为止，国内报道的s-腺苷蛋氨酸生产采用的菌株也是酿酒酵母菌株，在30ml发酵液/500ml摇瓶中产量最高为0.83g/l，它在7l发酵罐中培养的产量最高为17.1g/l，在发酵过程中不仅要对ph进行严格的调控：在发酵前期控制ph5.4为有利于菌体的生长、在发酵后期控制ph5.1为有利于s-腺苷蛋氨酸的稳定性，在发酵中期期在补加葡萄糖、氮源营养盐母液以及发酵后期额再次补加10g/l的三磷酸腺苷二钠溶液，它的发酵周期为66h。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一株高产s-腺苷蛋氨酸的酿酒酵母菌及其在发酵生产s-腺苷蛋氨酸中的应用。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
发明人通过低能离子束注入技术，对土壤中筛选出能够在l-蛋氨酸的诱导下得到产物s-腺苷蛋氨酸的酿酒酵母（saccharomycescerevisiae）进行诱变，经三轮筛选得到一株酿酒酵母，其好氧下可高产s-腺苷蛋氨酸。该菌株，其分类命名为酿酒酵母（saccharomycescerevisiae）ty-93620，目前该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称cgmcc），保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码100101，登记入册的编号是cgmccno.13760，保藏日期是2017年3月20日。
酿酒酵母（saccharomycescerevisiae）ty-93620菌株具有下述性质：
1、菌落形态学特征：在营养琼脂培养基上，30℃划线培养呈中度生长，菌苔线状，24h为乳白色,菌落为圆形,边缘整齐，48h后稍呈白色，随培养时间的延长颜色稍增白。表面湿润、光滑，有光泽，有黏性，菌落不透明。
2、生理与生化特征：
a.培养温度：20～40℃，最适温度为30℃；
b.在ph3.0～7.5范围内生长；
c.色素产生情况：不产生色素；
3、营养特征：
酿酒酵母菌株可在合成培养基上生长，培养基成分简单且价格低廉。该培养基碳源一般为葡萄糖或酸化处理后的糖蜜，氮源可选用玉米浆干粉、麦芽汁浸粉、酵母膏、(nh4)2hpo4以及(nh4)2so4等，培养基中还包括钾盐、钠盐、镁盐、磷酸盐和柠檬酸盐等常用的无机盐类，根据不同的氮源而定，以硫酸铵或玉米浆干粉为唯一氮源时需全添加，在以玉米浆干粉、麦芽汁浸粉时可以少量或不加入无机盐。
利用上述高产s-腺苷蛋氨酸的酿酒酵母菌生产s-腺苷蛋氨酸的方法，将酿酒酵母（saccharomycescerevisiae）ty-93620的菌株活化后，在20～45℃下好氧发酵48～96h；
其中，好氧发酵培养基为完全培养基：碳源20～100g/l，氮源20～60g/l，无机盐10～30g/l，其余为水，ph3.0～7.5。
其中，所述的碳源为葡萄糖、蔗糖、甘蔗糖蜜中的至少一种。
其中，所述的氮源为玉米浆干粉、麦芽汁浸粉、酵母膏或者(nh4)2so4中的至少一种。
其中，所述的无机盐为钾盐、锰盐、铁盐、镁盐、锌盐、铜盐、钴盐、钙盐、硫酸盐、磷酸盐或柠檬酸盐的任意一种或几种的组合。
最优选的生产方式为：将酿酒酵母（saccharomycescerevisiae）ty-93620的菌株活化后，在30℃下好氧发酵在30℃下好氧发酵84～96h，装液量为30ml发酵液/500ml三角瓶，转速为200rpm。
其中，所述的好氧发酵培养基为：葡萄糖37.5g/l，玉米浆45g/l，麦芽浸粉15g/l，k2hpo4•3h2o1.6g/l，kh2po41.25g/l，mgso4•7h2o3.75g/l，初始ph5.0。
或者优选为：将酿酒酵母ty-93620的菌株活化后，在30℃下好氧发酵48～72h，转速为800rpm；
其中，所述的好氧发酵培养基为：葡萄糖60g/l，玉米浆10g/l，麦芽浸粉5g/l，酵母粉15g/l，酸化处理后的糖蜜40g/l，k2hpo4•3h2o1.6g/l，kh2po41.25g/l，mgso4•7h2o3.75g/l，feso4•7h2o10mg/l，(nh4)2hpo45g/l，初始ph5.0。
有益效果：本发明与现有技术相比，具有如下优势：
（1）与化学法及酶法催化相比，低成本，低能耗，无污染，使用粗原料等非化石资源作为原料，无需使用atp作为催化诱导剂，产量高，稳定性强，过程清晰简单易操控。
（2）与原始菌相比，发酵产物种类少，纯度高，稳定性好，产量明显增高；且培养条件简单易控，耐高温、低ph耐受性强。
附图说明
图1本发明菌株cgmccno.13760好氧发酵终点的高效液相色谱腺苷蛋氨酸检测图谱;其中，标号1的峰为s-腺苷蛋氨酸的响应峰。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1
发明人通过低能离子束注入技术，对土壤中筛选得到的能够在l-蛋氨酸的诱导下得到产物s-腺苷蛋氨酸的酿酒酵母（saccharomycescerevisiae）；在30℃条件下，将筛选得到的酿酒酵母接种到ypd培养液中培养4h，离心去上清，加入适量的生理盐水制成酿酒酵母菌悬液均匀涂布于无菌平皿上；用低能离子束对菌悬液进行脉冲注入；把经诱变处理后的菌悬液稀释后，涂布于ypd固体培养基中培养；选取生长良好的单菌株接种于液体发酵培养基中培养，经三轮筛选选取遗传性状稳定的能够高产s-腺苷蛋氨酸的酿酒酵母菌株，即得到高产s-腺苷蛋氨酸的酿酒酵母菌株。
实施例2
平板培养基：蛋白胨20g/l，酵母膏10g/l，葡萄糖20g/l，琼脂20g/l，ph自然。
好氧发酵培养基：葡萄糖37.5g/l，玉米浆45g/l，麦芽浸粉15g/l，k2hpo4•3h2o1.6g/l，kh2po41.25g/l，mgso4•7h2o3.75g/l，初始ph5.0。500ml三角瓶装液量30ml，121℃灭菌15分钟。
分别将初始菌株及cgmccno.13760菌首先于30℃平板活化菌种，24h后接两环生长良好的菌体入30ml发酵培养基，30℃，200rpm培养12h，然后按照3%(v/v)接种量转接入装液量为30ml发酵液/500ml三角瓶，30℃培养，转速为200rpm。待菌体生长至对数生长中期后（即发酵48h），向发酵液中投加d/l一蛋氨酸0.1g。发酵30h后cgmccno.13760的发酵液中含有2.95g/ls-腺苷蛋氨酸。较初始菌株相比，s-腺苷蛋氨酸产量提高了7.25倍。
实施例3
平板培养基：同实施例1；
好氧发酵培养基：葡萄糖60g/l，玉米浆10g/l，麦芽浸粉5g/l，酵母粉15g/l，酸化处理后的糖蜜40g/l，k2hpo4•3h2o1.6g/l，kh2po41.25g/l，mgso4•7h2o3.75g/l，feso4•7h2o10mg/l，(nh4)2hpo45g/l，初始ph5.0。7l发酵罐装液量3l，121℃灭菌15分钟。
分别将初始菌株及cgmccno.13760菌首先于30℃平板活化菌种，24h后接两环生长良好的菌体入30ml发酵培养基，30℃，200rpm培养12h，然后按照10%(v/v)接种量转接入3l发酵培养基，通空气2v/vm，转速800rpm，30℃培养。发酵至16h后，开始补加葡萄糖，将葡萄糖的浓度控制为10-15g/l。待菌体生长至对数生长中期后（即发酵36h），向发酵液中投加d/l一蛋氨酸10g。发酵48h后cgmccno.13760的发酵液中含有25.66g/ls-腺苷蛋氨酸。较初始菌株相比，s-腺苷蛋氨酸产量提高了35倍。
实施例4
平板培养基：同实施例1；
好氧发酵培养基：葡萄糖60g/l，酸化处理后的糖蜜40g/l，k2hpo4•3h2o1.6g/l，kh2po41.25g/l，mgso4•7h2o3.75g/l，feso4•7h2o10mg/l，(nh4)2hpo45g/l，初始ph5.0。7l发酵罐装液量3l，121℃灭菌15分钟。
所述糖蜜的酸化处理方法为：糖蜜按照质量比稀释10倍，用浓硫酸调节ph为2.0，100℃条件下保温30min，到达时间后自然冷却，冷却后过滤备用。
分别将初始菌株及cgmccno.13760菌首先于45℃平板活化菌种，24h后接两环生长良好的菌体入30ml发酵培养基，45℃，200rpm培养16h，然后按照10%(v/v)接种量转接入3l发酵培养基，通空气2v/vm，转速800rpm，45℃培养。发酵至16h后，开始补加葡萄糖，将葡萄糖的浓度控制为10-15g/l。待菌体生长至对数生长中期后（即发酵42h），向发酵液中投加d/l一蛋氨酸10g。发酵54h后cgmccno.13760的发酵液中含有18.96g/ls-腺苷蛋氨酸。较初始菌株相比，s-腺苷蛋氨酸产量提高了25.9倍。
实施例5
平板培养基：同实施例1；
好氧发酵培养基：蔗糖40g/l，玉米浆干粉10g/l，初始ph5.0。7l发酵罐装液量3l，121℃灭菌15分钟。
分别将初始菌株及cgmccno.13760菌首先于30℃平板活化菌种，24h后接两环生长良好的菌体入30ml发酵培养基，30℃，200rpm培养12h，然后按照10%(v/v)接种量转接入3l发酵培养基，通空气2v/vm，转速800rpm，30℃培养。发酵至16h后，开始补加葡萄糖，将葡萄糖的浓度控制为10-15g/l。待菌体生长至对数生长中期后（即发酵36h），向发酵液中投加d/l一蛋氨酸10g。发酵48h后cgmccno.13760的发酵液中含有19.63g/ls-腺苷蛋氨酸。较初始菌株相比，s-腺苷蛋氨酸产量提高了26.8倍。
其中，s-腺苷蛋氨酸的检测方法：取体积比为1:9的发酵液与1.5mol/l高氯酸混合溶液，向其中加入10g直径为3mm的玻璃珠，采用漩涡振荡混匀器转振荡破碎30s，取1ml得到的液体采用台式离心机10000r/min离心1min，采用0.22μm的水系滤头进行过滤；最后采用c18在流动相为0.01mol/l的甲酸铵溶液（用甲酸调ph至3.0），检测温度为30℃，检测波长254nm，流速为1ml/min的条件下进行检测。