专利名称：一种酿酒酵母高密度发酵培养基和酿酒酵母高密度发酵方法
技术领域：
本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及酿酒酵母发酵技术，尤其涉及一种酿酒酵母高密度发酵培养基，以及利用该培养基进行酿酒酵母高密度发酵的方法。
背景技术：
酵母是一类单细胞低等真核生物，它既具有类似原核生物易培养、繁殖快、便于遗传操作等生长特性，又具有典型真核生物的分子和细胞生物学特性。酿酒酵母是人类利用最早的微生物，现已广泛应用于食品、饲料、医药、酿造工业等领域，而且以酿酒酵母为宿主系统表达或构建文库等基因工程技术得到了飞速的发展。在饲料行业，酵母菌既不干扰抗生素的作用，又可以增加饲料的稳定性，其本身就具有十分丰富的营养价值。而且酵母菌作为消化剂，还可通过刺激消化效率，有利于动物的消化吸收，加速动物的生长发育及生产性能的发挥；同时增强了厌氧菌的生长繁殖，能提高动物的搞病防病能力，是配制畜、鱼、虾及珍贵毛皮动物饲料的理想蛋白质原料。用酵母菌部分替代鱼粉及豆粕，可有效降低成本，使饲料厂和养殖户获得更佳经济效益。因此，酵母菌作为益生菌在饲料中具有广阔的应用前景。高细胞密度发酵就是要在单位时间、单位反应器体积内，在不影响胞内产物得率的基础上，尽可能多的积累细胞量。高细胞密度发酵中的培养基应充分满足微生物的营养要求，并为细胞的生长繁殖提供适宜的环境条件。鉴于酵母优良特性及其广泛使用，所以对酵母进行高密度发酵，尤其对酿酒酵母进行高密度发酵是十分有价值的。对高密度发酵技术来说，培养基的设计是发酵过程能否成功的关键因素之一。其中，培养基中碳氮比对微生物生长繁殖和产物的合成的影响极为显著。酵母高密度发酵所使用的培养基需要适当的碳源和氮源的比例，碳氮比偏小会导致菌体生长旺盛，造成菌体提前衰老自溶；碳氮比过大，菌体繁殖数量少，造成细菌代谢不平衡，影响产物的积累。高密度发酵工艺的另一个重要改善方法是延长菌株对数生长期，国内外对酵母高密度发酵策略已有了较多的报道，几乎所有高生物量的获得都离不开补料的添加。在酵母发酵期间进行补料的合理添加，可以保证菌体的持续生长繁殖，延缓细胞衰老死亡速度，提高菌体密度，是酵母高密度发酵成功的关键。
发明内容
本发明的目的在于提供一种比现有技术更加能有效发酵酿酒酵母获得高生物量的酿酒酵母高密度发酵培养基。本发明的另一个目的在于提供一种采用上述酿酒酵母高密度发酵培养基，并在酿酒酵母发酵期间合理添加补料，从而能比现有技术获得更高生物量的酿酒酵母高密度发酵方法。一种酿酒酵母高密度发酵培养基，该酿酒酵母高密度发酵培养基为液体培养基， 其配方包含蔗糖75. 80 77. 12 g/L、酵母浸膏33. 31 34. 25 g/L、酸水解干酪素15. 86 16.15 g/L、硫酸铵0.55 g/L、硫酸镁1.03 g/L、磷酸二氢钾2.62 g/L和甘氨酸2.03 g/ L0一种酿酒酵母高密度发酵方法，该发酵方法包括如下步骤 步骤1.种子液体的制备
将保存的酿酒酵母甘油菌种划线于麦芽汁培养基平板上，放置观 30°c培养箱中培养至长出单菌落；在上述单菌落中挑取饱满的单菌落划线接种于麦芽汁培养基平板上，放置观 30°C培养箱中培养1 2天，再取饱满的菌种接入液体麦芽汁培养基中，28 30°C， 200 250 r/min摇瓶培养过夜，得到所需种子液。步骤2.
将步骤1制备所得种子液以8 10%的接种量接入酿酒酵母高密度发酵培养基中开始发酵培养，发酵培养采用观 30°C，200 250 r/min摇瓶培养；自发酵培养1 开始补糖， 采用预先配制的浓度为150 g/mL的蔗糖溶液，每隔1 补糖一次，每次补入1. 30 1. 60 mL ；发酵培养60 72 h后终止发酵。上述步骤1中，种子液体培养是本领域技术人员的常用操作，其中用到的麦芽汁培养基平板和液体麦芽汁培养基也均为本领域技术人员在种子活化时的常用培养基，均采用标准配方配制。上述步骤1中，为了取得很好的种子活化效果，所以发明人对常规甘油-80°C保存的酵母菌种进行两次平板活化，两次平板活化后再进行液体麦芽汁培养基中摇瓶培养过夜，从而得到所需种子液；因为经过了两次平板活化，所以能够确保甘油的完全去除，菌种完全恢复，有利于后期实验。上述步骤2中，8 10%的接种量是指种子液的体积占酿酒酵母高密度发酵培养基体积的8 10%。上述步骤2中，酿酒酵母高密度发酵培养基为液体培养基，其配方包含蔗糖 75. 80 77. 12 g/L、酵母浸膏33. 31 34. 25 g/L、酸水解干酪素15. 86 16. 15 g/L、硫酸铵0.55 g/L、硫酸镁1.03 g/L、磷酸二氢钾2.62 g/L和甘氨酸2.03 g/L。上述发酵结束后，检测酿酒酵母的生物量干重达50 g/L以上，说明该发酵方法可有效获得高生物量的酿酒酵母。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果
1.本发明的重点是对后期发酵培养基配方及其相应工艺进行了研究改进，发酵时所用的酿酒酵母高密度发酵培养基，其培养基配方的组分及其用量是本发明人通过大量实验方案设计和数据分析后优选而得的，培养基中碳氮比得搭配对酿酒酵母的生长繁殖和产物合成非常有利；
2.本发明的酿酒酵母高密度发酵培养方法，采用分批补料策略，分批补料的参数优化搭配发酵培养基的配方优化，从而保证了高密度、高产率和高浓度培养酿酒酵母的实现；
3.本发明的酿酒酵母高密度发酵培养方法，其发酵所得酿酒酵母的菌体浓度在50g/ L以上，明显优于现有发酵工艺，并且本发明的发酵方法在实现高密度、高产率和高浓度培养的同时，也相应地缩小生物反应器的容积，减少了废水处理设备和费用，并且无需浓缩， 降低了生物量的分离费用，将会给饲料酵母工业带来了巨大的经济效益和环境效益。
图1为实施例1中酿酒酵母GIM2. 126菌体在进行高密度发酵培养时的生长曲线其中，1为发酵过程中有补糖操作时的酿酒酵母GIM2. 126菌体生长曲线，2为对比试验 (未补糖)中酿酒酵母GIM2. 126菌体生长曲线，3为本发明人在进行实施例1补糖最佳时间研究时所测定的未补糖时发酵培养基中的残糖情况；
图2为实施例2中酿酒酵母GIM2. 113菌体在进行高密度发酵培养时的生长曲线图； 其中，1为发酵过程中有补糖操作时的酿酒酵母GIM2. 113菌体生长曲线，2为对比试验 (未补糖)中酿酒酵母GIM2. 113菌体生长曲线，3为本发明人在进行实施例2补糖最佳时间研究时所测定的未补糖时发酵培养基中的残糖情况；
图3为实施例3中酿酒酵母GIM2. 44菌体在进行高密度发酵培养时的生长曲线图； 其中，1为发酵过程中有补糖操作时的酿酒酵母GIM2. 44菌体生长曲线，2为对比试验 (未补糖)中酿酒酵母GIM2. 44菌体生长曲线，3为本发明人在进行实施例2补糖最佳时间研究时所测定的未补糖时发酵培养基中的残糖情况。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明做进一步地描述，但具体实施例并不对本发明做任何限定。实施例1酿酒酵母GIM2. 126的高密度发酵
本实施例的酿酒酵母购于广州菌种保藏中心，其菌种编号为GIM2. 126。在对上述酿酒酵母进行高密度发酵前，本发明人先对该酿酒酵母进行了一些基础研究
1.针对酿酒酵母GIM2.126，为了获得高生物量，本发明人对其生长曲线进行了研究， 研究发现4 16 h为该酿酒酵母的对数生长期的前期和中期，因此本发明人确定在发酵培养1 后对其进行补糖；
2.在考察碳氮源的添加量及配比对GIM2.1 生物量的影响的基础上，得到蔗糖、酵母浸膏和酸水解干酪素的较佳配比，并以最终的细胞生物量为响应值按中心组合原理设计响应面分析试验，进一步优化得到蔗糖、酵母浸膏和酸水解干酪素的最佳配比，最终确定本实施例酿酒酵母GIM2. 126的酿酒酵母高密度发酵培养基，该酿酒酵母高密度发酵培养基为液体培养基，其配方包含蔗糖75. 80 8/1、酵母浸膏33.31 g/L、酸水解干酪素15. 86 g/L、硫酸铵0.55 g/L、硫酸镁1.03 g/L、磷酸二氢钾2.62 g/L和甘氨酸2.03 g/L。对酿酒酵母GIM2. 126进行高密度发酵，该发酵方法包括如下步骤 步骤1.种子液体的制备
将保存的酿酒酵母GIM2. 126甘油菌种划线于麦芽汁培养基平板上，放置培养箱中培养2天，直至长出单菌落；再挑取饱满的单菌落划线接种于麦芽汁培养基平板上，放置培养箱中培养2天后再将菌种接入IOmL液体麦芽汁培养基中，28°C，250 r/min摇瓶培养过夜，得到所需种子液。步骤2.
在无菌操作室中，在火焰的保护下将步骤1制备所得种子液以10%的接种量接入酿酒酵母高密度发酵培养基中培养，发酵培养采用^°C，250 r/min摇瓶培养；
自发酵培养16h开始补糖，采用预先配制的浓度为150 g/mL的蔗糖溶液，每隔1 补糖一次，每次补入1. 30mL，使蔗糖浓度维持在初始浓度的70 80 % ；
发酵培养60 h终止发酵，检测酿酒酵母GIM2. 126的生物量干重，结果显示酿酒酵母 GIM2. 126的生物量干重达50 g/L以上，如图1所示。本实施例还做了对比实验，该对比试验也是采用步骤1所得种子液进行步骤2的操作，但是在步骤2中不进行补糖操作，发酵培养60 h终止发酵，检测酿酒酵母GIM2. 126 的生物量干重，结果如图1所示。从图1可以看出，发酵培养16 h后开始第一次补糖，补糖之后酿酒酵母GIM2. 126 的生长速率逐渐增加并超过对比实验(未补糖)中酿酒酵母的生长速率；在48小时进行第三次补加蔗糖后，酿酒酵母细胞仍保持较高的生长速度；60 h后，生物量达到了 52. 36 g/L, 相比与对比试验(对比实验中酿酒酵母GIM2. 126的生物量干重为38. 08g/L)，其生物量提高了 37. 5%ο实施例2酿酒酵母GIM2. 113的高密度发酵
本实施例的酿酒酵母购于广州菌种保藏中心，其菌种编号为GIM2. 113。在对上述酿酒酵母进行高密度发酵前，本发明人先对该酿酒酵母进行了一些基础研究
1.针对酿酒酵母GIM2.113，为了获得高生物量，本发明人对其生长曲线进行了研究， 研究发现4 16 h为该酿酒酵母的对数生长期的前期和中期，因此本发明人确定在发酵培养1 后对其进行补糖；
2.在考察碳氮源的添加量及配比对GIM2.113生物量的影响的基础上，得到蔗糖、酵母浸膏和酸水解干酪素的较佳配比，并以最终的细胞生物量为响应值按中心组合原理设计响应面分析试验，进一步优化得到蔗糖、酵母浸膏和酸水解干酪素的最佳配比，最终确定本实施例酿酒酵母GIM2. 113的酿酒酵母高密度发酵培养基，该酿酒酵母高密度发酵培养基为液体培养基，其配方包含蔗糖76. 54 g/L、酵母浸膏33. 78 g/L、酸水解干酪素16. 05 g/L、硫酸铵0.55 g/L、硫酸镁1.03 g/L、磷酸二氢钾2.62 g/L和甘氨酸2.03 g/L。对酿酒酵母GIM2. 113进行高密度发酵，该发酵方法包括如下步骤 步骤1.种子液体的制备
将保存的酿酒酵母GIM2. 113甘油菌种划线于麦芽汁培养基平板上，放置30°C培养基中培养1天，直至长出单菌落；再挑取饱满的单菌落划线接种于麦芽汁培养基平板上，放置 30°C培养基中培养1天后再将菌种接入15mL液体麦芽汁培养基中，30°C，250 r/min摇瓶培养过夜，得到所需种子液。步骤2.
在无菌操作室中，在火焰的保护下将步骤1制备所得种子液以10%的接种量接入酿酒酵母高密度发酵培养基中开始发酵培养，发酵培养采用30°C，250 r/min摇瓶培养；
自发酵培养16h开始补糖，补糖采用预先配制的浓度为150 g/mL的蔗糖溶液，每隔1 补糖一次，每次补入1. 50mL，使蔗糖浓度维持在初始浓度的70 80 % ；
发酵培养60 h终止发酵，检测酿酒酵母GIM2. 113的生物量干重，结果显示酿酒酵母 GIM2. 113的生物量干重达50 g/L以上，如图2所示。本实施例还做了对比实验，该对比试验也是采用步骤1所得种子液进行步骤2的操作，但是在步骤2中不进行补糖操作，发酵培养60 h终止发酵，检测酿酒酵母GIM2. 113 的生物量干重，结果如图2所示。从图2可以看出，发酵培养16 h后开始第一次补糖，补糖之后酿酒酵母GIM2. 113 的生长速率逐渐增加并超过对比实验(未补糖)中酿酒酵母的生长速率；在48小时进行第三次补加蔗糖后，酿酒酵母细胞仍保持较高的生长速度；60 h后，生物量达到了 52. 14 g/L, 相比与对比试验(对比实验中酿酒酵母GIM2. 113的生物量干重为37. 98g/L)，其生物量提高了 37. 28%ο实施例3 酿酒酵母GIM2. 44的高密度发酵
本实施例的酿酒酵母购于广州菌种保藏中心，其菌种编号为GIM2. 44。在对上述酿酒酵母进行高密度发酵前，本发明人先对该酿酒酵母进行了一些基础研究
1.针对酿酒酵母GIM2.44，为了获得高生物量，本发明人对其生长曲线进行了研究，研究发现4 16 h为该酿酒酵母的对数生长期的前期和中期，因此本发明人确定在发酵培养 16h后对其进行补糖；
2.在考察碳氮源的添加量及配比对GIM2.44生物量的影响的基础上，得到蔗糖、酵母浸膏和酸水解干酪素的较佳配比，并以最终的细胞生物量为响应值按中心组合原理设计响应面分析试验，进一步优化得到蔗糖、酵母浸膏和酸水解干酪素的最佳配比，最终确定本实施例酿酒酵母GIM2. 44的酿酒酵母高密度发酵培养基，该酿酒酵母高密度发酵培养基为液体培养基，其配方包含蔗糖77. 12 g/L、酵母浸膏34. 25 g/L、酸水解干酪素16. 15 g/L、硫酸铵0.55 g/L、硫酸镁1.03 g/L、磷酸二氢钾2.62 g/L和甘氨酸2.03 g/L。对酿酒酵母GIM2. 44进行高密度发酵，该发酵方法包括如下步骤 步骤1.种子液体的制备
将保存的酿酒酵母GIM2. 44甘油菌种划线于麦芽汁培养基平板上，放置30°C培养基中培养1天，直至长出单菌落；再挑取饱满的单菌落划线接种于麦芽汁培养基平板上，放置 30°C培养基中培养1天后再将菌种接入15mL液体麦芽汁培养基中，30°C，200 r/min摇瓶培养过夜，得到所需种子液。步骤2.
在无菌操作室中，在火焰的保护下将步骤1制备所得种子液以10%的接种量接入酿酒酵母高密度发酵培养基中开始发酵培养，发酵培养采用30°C，200 r/min摇瓶培养；
自发酵培养16h开始补糖，补糖采用预先配制的浓度为150 g/mL的蔗糖溶液，每隔1 补糖一次，每次补入1. 50mL，使蔗糖浓度维持在初始浓度的70 80 % ；
发酵培养60 h终止发酵，检测酿酒酵母GIM2. 44的生物量干重，结果显示酿酒酵母 GIM2. 44的生物量干重达50 g/L以上，如图3所示。本实施例还做了对比实验，该对比试验也是采用步骤1所得种子液进行步骤2的操作，但是在步骤2中不进行补糖操作，发酵培养60 h终止发酵，检测酿酒酵母GIM2. 44的生物量干重，结果如图3所示。从图3可以看出，发酵培养16 h后开始第一次补糖，补糖之后酿酒酵母GIM2. 44 的生长速率逐渐增加并超过对比实验(未补糖)中酿酒酵母的生长速率；在48小时进行第三次补加蔗糖后，酿酒酵母细胞仍保持较高的生长速度；60 h后，生物量达到了 51. 49 g/L， 相比与对比试验(对比实验中酿酒酵母GIM2. 44的生物量干重为38. 12g/L)，其生物量提高了 ；35%。实施例4本发明发酵方法与现有发酵方法的对比
本实施例是取实施例3中步骤1所得种子液，采用现有发酵工艺对该种子液进行发酵培养，接种量为10%，发酵培养所用的培养基也是现有发酵工艺常用的液体发酵培养基，其配方为包含葡萄糖4%、蛋白胨洲和酵母1%，所述百分比为质量百分比，发酵培养条件为 30°C,150r/min摇瓶培养，发酵培养过程中不进行补料，发酵培养时间为60 h停止发酵，测定酿酒酵母GIM2. 44的生物量干重，结果为23. 0 g/L。对比实施例3和实施例4可以看出，实施例3获得了酿酒酵母GIM2. 44的高生物量，实现了高密度、高产率和高浓度培养，由此说明本发明的酿酒酵母高密度发酵培养基和发酵过程中的补料操作搭配，确实能够比现有技术获得更高生物量。
权利要求
1.一种酿酒酵母高密度发酵培养基，其特征在于该酿酒酵母高密度发酵培养基为液体培养基，其配方包含蔗糖75. 80 77. 12 g/L，酵母浸膏33. 31 34. 25 g/L，酸水解干酪素 15. 86 16. 15 g/L，硫酸铵0. 55 g/L，硫酸镁1.03 g/L，磷酸二氢钾2.62 g/L和甘氨酸 2. 03 g/L ο
2.一种采用权利要求1所述酿酒酵母高密度发酵培养基的酿酒酵母高密度发酵方法， 其特征在于该发酵方法包括如下步骤步骤1.种子液体的制备将保存的酿酒酵母甘油菌种划线于麦芽汁培养基平板上，放置观 30°C培养箱中培养至长出单菌落；在上述单菌落中挑取饱满的单菌落划线接种于麦芽汁培养基平板上，于观 30°C培养箱中培养1 2天，再挑取饱满的菌种接入液体麦芽汁培养基中，观 30°C，200 250 r/min摇瓶培养过夜，得到种子液；步骤2.将步骤1制备所得种子液以8 10%的接种量接入权利要求1所述酿酒酵母高密度发酵培养基中开始发酵培养，发酵培养采用观 30°C，200 250 r/min摇瓶培养；自发酵培养16h开始补糖，补糖采用预先配制的浓度为150 g/mL的蔗糖溶液，每隔1 补糖一次，每次补入1. 30 1. 60 mL ；发酵培养60 72 h后终止发酵。
3.根据权利要求2所述一种酿酒酵母高密度发酵方法，其特征在于所述酿酒酵母甘油菌种是酿酒酵母GIM2. 126甘油菌种、酿酒酵母GIM2. 113甘油菌种或酿酒酵母GIM2. 44 甘油菌种，所述酿酒酵母GIM2. 1 甘油菌种、酿酒酵母GIM2. 113甘油菌种或酿酒酵母 GIM2. 44甘油菌种，均来自广州菌种保藏中心。
全文摘要
本发明公开一种酿酒酵母高密度发酵培养基和酿酒酵母高密度发酵方法，该酿酒酵母高密度发酵培养基的配方包含蔗糖75.80～77.12g/L，酵母浸膏33.31～34.25g/L，酸水解干酪素15.86～16.15g/L，硫酸铵0.55g/L，硫酸镁1.03g/L，磷酸二氢钾2.62g/L和甘氨酸2.03g/L。本发明的酿酒酵母高密度发酵培养基中碳氮比的搭配对酿酒酵母的生长繁殖和产物合成非常有利，采用该培养基并结合分批补料策略，发酵所得酿酒酵母的菌体浓度在50g/L以上，明显优于现有发酵工艺，实现了高密度、高产率和高浓度培养，同时也相应地缩小生物反应器的容积，减少了废水处理设备和费用，无需浓缩，降低了生物量的分离费用，将会给饲料酵母工业带来了巨大的经济效益和环境效益。
文档编号C12N1/18GK102311927SQ20111023937
公开日2012年1月11日 申请日期2011年8月19日 优先权日2011年8月19日
发明者余以刚, 刘冬梅, 吴晖, 唐语谦, 李庆全, 李晓凤, 汪芳, 袁琨 申请人:华南理工大学