一种异鸟嘌呤类型化合物及其制备方法及用途与流程

本发明涉及新型化合物及其用途，具体涉及一种异鸟嘌呤类型化合物(i)的制备方法及其抗病毒的用途，属于药物技术领域。

背景技术：

乙型肝炎病毒(hepatitisbvirus，hbv)已经成为全球性的危害。由其引发的慢性乙型肝炎(chronichepatitisb，chb)是肝脏疾病进展的关键因素，可导致肝硬化、肝癌及肝功能衰竭等多种并发症的发生，给人类生命和健康带来严重威胁。尽管乙肝疫苗接种已实施多年，但全球每年因乙肝相关疾病死亡的人数仍高达60多万。而我国是世界上hbv感染率最高的国家之一，hbv携带者占总人口比例高达10％，其中慢性乙肝患者约3000万例，每年约有30万人死于慢性乙肝相关疾病。乙肝的治疗已经成为我国亟代解决的社会公共卫生难题。

我国具有几千年利用天然药物治疗疾病的悠久历史，中草药资源丰富，中医中药理论博大精深。中药的物质基础为天然产物，具有结构丰富、活性独特、毒副性低、作用靶点多样等特点，是创新药物的重要来源。从中草药中寻找新的高效低毒的抗hbv单体药物是目前抗hbv药物研发的热点之一，实践表明许多天然药物治疗乙型肝炎不仅具有明确的疗效，而且毒副作用相对较小，这些实践为人类从天然药物中筛选新的抗hbv药物奠定了基础。

叶下珠属(phyllanthus)是大戟科(euphorbiaceae)植物，我国约有30余种，主产于长江以南各省，资源丰富。近现代文献资料表明，该属植物具有利水解毒、平肝清热的功效，在痢疾、肠炎、尿路感染和传染性肝炎的临床治疗中经常应用，效果显著。尤其是抗乙肝病毒活性，代表性植物叶下珠用于慢性肝炎的治疗，其胶囊和分散片剂型，以及以叶下珠为主药的复方药肝康、肝丹等已被广泛应用于临床。落萼叶下珠(phyllanthusflexuosus(sieb.etzucc.)muell.arg)是大戟科叶下珠属植物，叶下珠亲缘关系较近，味微涩，性平，具有清火解毒，除风止痒，涩肠止泻的功效。根可入药，治小儿疳积，幼叶可治蛇咬伤，全草煎水外用，治过敏性皮炎，居住于云南省的傣族，通常以落萼叶下珠的全草(傣药名：嘿杆巴)用来治疗腹痛腹泻，赤白下痢、疔疮痈疖脓肿、皮肤瘙痒，麻疹等疾病。

技术实现要素：

本发明是在对上述植物进行系统化学成分研究和药效学研究的基础上提出的，公开了一种新的具有抗乙型肝炎病毒(hbv)活性的异鸟类型嘌呤化合物，同时公开了一种异鸟嘌呤类型化合物的制备方法，以及该化合物在抗乙型病毒性肝炎(hbv)的用途。

本发明的技术方案是：

一种异鸟嘌呤类型化合物，结构符合下述通式(i)

其中：r1是氨基、脂肪氨基、环烷氨基、吡咯烷基或r2是h、

进一步的，上述异鸟嘌呤类型化合物为结构式ii,

经结构鉴定命名为1-甲基-3-异戊烯基异鸟嘌呤[1-methyl-3-(3-methylbut-2-en-1-yl)isoguanine]。

一种异鸟嘌呤类型化合物的制备方法，提取工艺为：

1)落萼叶下珠phyllanthusflexuosus药材粗粉，采用高浓度低级醇类提取；

2)提取液回收醇类溶剂后得浸膏，经乙醇溶解后，经大孔树脂、反复硅胶柱层析、ods等操作制得；

其中：所述低级醇类的浓度为70％到100％；所述提取方法可为回流、浸渍、渗流、超声、或微波提取的方法。

一种异鸟嘌呤类型化合物的用途，用于制备治疗乙型病毒性肝炎(hbv)的药物。

本发明技术方案与现有技术比较，其优点是：

本发明结构式ii是从大戟科落萼叶下珠植物中提取分离得到的新化合物，提供了异鸟嘌呤类型化合物制备抗乙型病毒性肝炎的应用。药理试验结果表明，化合物ii在体外对hbsag和hbeag的分泌都具有较显著的抑制作用，且明显强于对照组的拉米夫定(3tc)，而且在试验范围内对细胞没有毒害作用。

附图说明

图1为新化合物ii的分子结构式；

图2为新化合物ii的hr-esi-ms谱；

图3为新化合物ii的¹h-nmr谱；

图4为新化合物ii的¹³c-nmr谱；

图5为新化合物ii的hsqc谱；

图6为新化合物ii的hmbc谱；

图7为新化合物ii的x单晶衍射结构图。

具体实施方式

实施例1：化合物ii的提取分离及结构鉴定

落萼叶下珠的根(6.2kg)进行粉碎后，用5倍量80％乙醇回流提取3次，每次3h，合并滤液，减压浓缩得浸膏996g，乙醇溶解后过滤，过d101大孔树脂，分别用纯水、30％乙醇-水、70％乙醇-水、90％乙醇、100％乙醇洗脱得5个部位(a-e)，c部位进行硅胶柱色谱层析，依次用体积比为50:1到1:4的二氯甲烷-甲醇系统进行梯度洗脱，得到10个部位(c1-c10)。部位c5通过ods柱层析，依次用30％、50％、70％、90％、100％甲醇-水溶液洗脱得到9个部位(c5a-c5i)。组分c5d通过硅胶柱色谱用体积比为50:1到1:1的二氯甲烷-甲醇系统进行梯度洗脱，最后经ods柱层析，用质量浓度为30％到40％的甲醇梯度洗脱得到化合物ii(11.9mg)。经结构鉴定结构式ii命名为1-甲基-3-异戊烯基异鸟嘌呤[1-methyl-3-(3-methylbut-2-en-1-yl)isoguanine]。

1-甲基-3-异戊烯基异鸟嘌呤[1-methyl-3-(3-methylbut-2-en-1-yl)isoguanine]，白色针状结晶(甲醇)，分子式为c11h15n5o。化合物ii的分子结构式如图1所示；其hr-esi-ms谱如图2所示；其hsqc谱如图5所示；其hmbc谱如图6所示；其x单晶衍射结构图如图7所示。

化合物ii的¹h-和¹³c-nmr数据

白色针状结晶；微溶于甲醇，易溶于dmso，不溶于氯仿、二氯甲烷等有机溶剂。tlc检测，香草醛-浓硫酸显色，加热后呈紫色斑点；mp：267.5-271.9℃；84.2(c0.19,meoh)；irvmax(cm^–1)：3420，2939，1692，1612，1567，1412，1228，1127，1057，683，633；uv(meoh)λmax(logε)204(4.28)nm；hresims显示分子离子峰m/z：232.1204[m-h]^-(calcd.c11h14n5o,232.1198)，256.1182[m+na]⁺(calcd.c11h15n5ona,256.1174)；分子式为c11h15n5o；¹hnmr(methanol-d4,400mhz)：δη1.82(3h,s,h-13)，1.68(3h,s,h-14)，3.52(3h,s,n1-me)，5.30(1h,t,j＝6.8hz,h-11)，4.69(2h,d,j＝6.8hz,h-10)，7.56(1h,s,h-8)；¹³cnmr(methanol-d4,100mhz)：δc151.1(c-2)，152.4(c-4)，111.4(c-5)，150.5(c-6)，151.8(c-8)，44.1(c-10)，119.5(c-11)，138.5(c-12)，18.4(c-13)，26.0(c-14)，31.2(n1-me)。化合物ii的¹h-nmr谱参见附图3，化合物ii的¹³c-nmr谱参见附图4。

本发明异鸟嘌呤类型化合物，用于制备治疗乙型病毒性肝炎(hbv)的药物。

药理试验证明，1-甲基-3-异戊烯基异鸟嘌呤[1-methyl-3-(3-methylbut-2-en-1-yl)isoguanine]对hepg2.2.15细胞分泌hbsag和hbeag表达有明显抑制作用，表现出良好的抗乙型肝炎病毒(hbv)活性，且在试验范围内对细胞没有毒害作用。

下面是药理学试验：

对hepg2.2.15细胞分泌hbsag和hbeag表达抑制活性测定：

在含有10％胎牛血清，300mg/mlg418，100mg/l青链霉素及4mmol/l谷氨酰胺的dmem高糖配培养液培养hepg2.2.15细胞株，取对数生长期状态良好的细胞，用2.5g/l胰蛋白酶消化，加入新鲜培养基吹打成单细胞悬液。血球计数板进行计数，调整细胞浓度1×10⁸/l的细胞悬液，接种于96孔板，每孔100μl，置co2培养箱(37℃，5％co2，饱和湿度)条件下培养24h后，换用含药培养液，每种药物以2.5％二甲基亚砜溶解，以培养基配成母液；每个药物设4个质量浓度，每个质量浓度设3个复孔，以拉米夫定为阳性对照药；每板设不加药物的正常细胞和试剂空白作对照。每2日换同浓度药液1次，药物干预第6日时收集上清液置于-20℃保存待用。

取细胞上清液，采用酶联免疫法，用乙肝表面抗原及e抗原检测试剂盒使用elisa(酶联免疫吸附试验)法检测培养液上清中的hbsag和hbeag，在酶标仪上以450nm为检测波长，630nm为参考波长进行检测，读取各孔od值。药物对抗原的抑制百分率＝(细胞对照组平均a值–实验组平均a值)/(细胞对照组平均a值–空白组平均a值)×100，ic50为hbsag或hbeag抑制率为50％时的药物浓度。以上实验均重复三次。

对细胞的毒性测定：

细胞毒通过mtt法来测定，弃去上清液的细胞孔，每孔加入5g/lmtt工作液50μl，置co2培养箱(37℃，5％co2，饱和湿度)孵育4h后吸弃孔内溶液并加入dmso100μl/孔，平板摇床上振摇5min。酶标仪测定各孔的od值，测定波长490nm，检测药物对细胞毒性作用。按公式计算细胞抑制率及半数毒性剂量(cc50)。药物对细胞的破坏率＝(细胞对照组平均a值–实验组平均a值)/(细胞对照组平均a值–空白组平均a值)×100，tc50为实验孔存活细胞为对照孔50％时的药物浓度。结果见表1：

表1

从表1可以看出，新化合物1-methyl-3-(3-methylbut-2-en-1-yl)isoguanine(结构式ii)对hepg2.2.15细胞分泌hbsag和hbeag表达有明显抑制作用，表现出良好的抗乙型肝炎病毒(hbv)活性，且在试验范围内对细胞没有毒害作用。

本发明还包括通式i药学上可接受的盐，这些盐可以是无机酸盐(如盐酸盐、硫酸盐等)，也可以是有机酸(如醋酸盐、草酸盐、酒石酸盐等)。这些化合物i的药学可接受盐具有与化合物同样的药理功效。

本发明所述的化合物可以添加药学上可接受的载体制成常见的药用制剂，如片剂、胶囊、粉剂、糖浆、液剂、悬浮剂、针剂，可添加药剂学上常用的矫味剂、助溶剂、崩解剂、缓冲剂等药用辅料。

本发明所述的化合物在临床上的给药方式可以采用口服、注射等给药方式。

以上实施方式只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人了解本发明内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所做的等效变化或修饰等的改变，都应涵盖在本发明的保护范围内。