本发明涉及生物制药技术领域，具体涉及一种芦荟中芦荟多糖的提取方法。
背景技术：
芦荟提取物是医药、化工、食品方面的重要原料，芦荟多糖是芦荟提取物中主要功效成分之一。芦荟多糖能够提高人体的免疫功能和抗辐射作用，且对于抗癌症、抗艾滋病病毒，有一定的药理治疗作用。
但芦荟多糖含量较低，在分离、提取和纯化时困难很大。传统提取芦荟多糖的方法是热水浸提法、该法得率低、操作费时、能耗大。超声辅助法是新型的辅助提取技术，具有操作步骤简单、节省溶剂、处理时间短等优点。但是，提取的芦荟多糖纯度不高，且提取率提高不大。
技术实现要素：
本发明的发明目的是，针对上述问题，提供一种芦荟中芦荟多糖的提取和测定方法，该提取方法采用微波辅助法和超声辅助法协同作用，具有操作步骤简单、节省溶剂、产物收率高、处理时间短等优点；且采用分光光度法测定芦荟大黄素含量，简单快捷，结果误差小。
为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种芦荟中芦荟多糖的提取和测定方法，包括以下步骤，
s1、准备样品：采摘鲜嫩的芦荟叶，用清水把芦荟叶上的灰尘清洗干净，然后轻轻的用手术刀去掉叶上的刺，再用手术刀横切成3～5毫米的薄片平铺在托盘上，然后放入烘箱中，在50～55℃条件下烘10～12小时，最后把烘干的芦荟叶粉碎成粉末状制成芦荟粉，放在棕色试剂瓶里避光并贴上标签，备用。
s2、微波处理：称取步骤s1准备的芦荟粉，加入蒸馏水，得提取液，将所述提取液微波处理,所述微波处理设定功率为600～750w，控制微波时间以预处理液温度达到75～80℃时为止。
s3、超声波提取：将微波处理后的提取液超声波提取50～70min,提取温度为40～45℃，超声波功率为100w，然后离心过滤得滤液和残渣。
s4、超声波二次提取：将步骤s4中的滤液调节ph到3～3.5，并加入乙醇，超声波处理30～40min,提取温度为40～45℃，超声波功率为100w，然后离心取积淀，最后将所述积淀干燥得到芦荟多糖。
s5、芦荟多糖测定：用分光光度法测定芦荟多糖的含量。
作为一种优选的方案，步骤s1中，所述芦荟粉为40～60目。
作为一种优选的方案，步骤s2中，芦荟粉与蒸馏水的料液比为1:20。
作为一种优选的方案，步骤s3中，超声结束后用移液枪吸取提取液放进离心管中，再以每分钟2250转的转速，进行离心10分钟，然后离心过滤得滤液和残渣。
作为一种优选的方案，步骤s4中，超声结束后用移液枪吸取提取液放进离心管中，以每分钟4000转的转速，进行离心10分钟，然后离心过滤取积淀。
作为一种优选的方案，步骤s4中，加入的乙醇的量为滤液的4倍。
作为一种优选的方案，所述分光光度法测定芦荟大黄素的具体步骤为：
①显色液配制：先用量筒准确量取50毫升的浓h2so4，再把50毫升的浓h2so4徐徐加进10毫升水中冷却直到室温，再加入之前称量好的0.6克苯酚晶体，溶解后配成显色液；
②绘制标准曲线：精密称取干燥至质量恒定(105℃烘干2h)的c6h12o60.05克加蒸馏水至50毫升，得标准c6h12o6溶液浓度为每毫升1毫克。取标准c6h12o6溶液0、1、2、3、4、5、6毫升，再用25毫升容量瓶定容得到糖液；依照糖液：显色液＝1:5的比例加进去试管，振动混匀，放在沸水浴中保温30min，取出冷却直到室内温度，于490纳米波长下测定吸光度，从而绘制标准曲线，得芦荟多糖的回归方程为y＝6.0921x+0.0149，r2＝0.9988
③样品的测定：取干燥后的芦荟多糖放进烧杯中，加入少量蒸馏水溶解，再用蒸馏水定容到容量瓶中得到糖液，依照糖液：显色液＝1:5比例加进去试管，振动混匀，放在沸水浴中保温30min，取出冷却直到室内温度，摇匀得备用液；将所述备用液稀释3～5倍，成为最终待测液；蒸馏水作为空白管，在490纳米吸收波长下测量待测液吸光度，做3～5次平行试验。
④计算：按照制得的标准曲线的线性方程式，计算曲线中c6h12o6浓度，再乘以0.9得出曲线中多糖浓度。具体计算方式为，将e得到的吸光度带入公式(1)，,计算曲线中c6h12o6浓度，再乘以0.9(葡萄糖与多糖的转换系数)得出曲线中多糖浓度，然后将多糖浓度再代入公式(2)计算出多糖含量，从而得出芦荟多糖的纯度。公式(2)中的样品重为步骤e中取用干燥后芦荟多糖的重量。
曲线中芦荟多糖的含量(mg)＝曲线中芦荟多糖浓度(mg/ml)×10ml×稀释倍数公式(1)
芦荟多糖的纯度＝曲线中芦荟多糖的含量(mg)×10-3/样品重×100％公式(2)
由于采用上述技术方案，本发明具有以下有益效果：
1.本发明采用微波辅助法和超声辅助法协同作用，具有操作步骤简单、节省溶剂、产物收率高、处理时间短等优点。
2.本发明采超声波提取采用两级提取方式，提高产物收率。
3.本发明采用分光光度法测定芦荟多糖含量，简单快捷，结果误差小。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
一种芦荟中芦荟多糖的提取和测定方法，选取木立芦荟为研究对象，包括以下步骤，
s1、准备样品：采摘鲜嫩的芦荟叶，用清水把芦荟叶上的灰尘清洗干净，然后轻轻的用手术刀去掉叶上的刺，再用手术刀横切成5毫米的薄片平铺在托盘上，然后放入烘箱中，在55℃条件下烘12小时，最后把烘干的芦荟叶粉碎成粉末状制成芦荟粉，所述芦荟粉为60目，放在棕色试剂瓶里避光并贴上标签，备用。
s2、微波处理：称取步骤s1准备的芦荟粉，加入20ml蒸馏水，得提取液，将所述提取液微波处理,所述微波处理设定功率为700w，控制微波时间以预处理液温度达到80℃时为止。
s3、超声波提取：将微波处理后的提取液超声波提取60min,提取温度为45℃，超声波功率为100w，超声结束后用移液枪吸取提取液放进离心管中，再以每分钟2250转的转速，进行离心10分钟，然后离心过滤得滤液和残渣。
s4、超声波二次提取：将步骤s4中的滤液调节ph到3～3.5，并加入滤液4倍体积的无水乙醇，超声波处理30min,提取温度为45℃，超声波功率为100w，，超声结束后用移液枪吸取提取液放进离心管中，以每分钟4000转的转速，进行离心10分钟，然后离心过滤取积淀。最后将所述积淀干燥得到芦荟多糖。
s5、芦荟多糖测定：用分光光度法测定芦荟多糖的含量。具体步骤为：
①显色液配制：先用量筒准确量取50毫升的浓h2so4，再把50毫升的浓h2so4徐徐加进10毫升水中冷却直到室温，再加入之前称量好的0.6克苯酚晶体，溶解后配成显色液；
②绘制标准曲线：精密称取干燥至质量恒定(105℃烘干2h)的c6h12o60.05克加蒸馏水至50毫升，得标准c6h12o6溶液浓度为每毫升1毫克。取标准c6h12o6溶液0、1、2、3、4、5、6毫升，再用25毫升容量瓶定容得到糖液；依照糖液：显色液＝1:5的比例加进去试管，振动混匀，放在沸水浴中保温30min，取出冷却直到室内温度，于490纳米波长下测定吸光度，从而绘制标准曲线，得芦荟多糖的回归方程为y＝6.0921x+0.0149，r2＝0.9988
③样品的测定：吸精确称量0.035克干燥后的芦荟多糖放进烧杯中，加入少量蒸馏水溶解，再用蒸馏水定容到10毫升容量瓶中得到糖液，依照糖液：显色液＝1:5比例加进去试管，振动混匀，放在沸水浴中保温30min，取出冷却直到室内温度，摇匀备用；用10毫升量筒准确量取4毫升上述备用液至试管中，再加入8毫升蒸馏水，稀释3倍摇匀备用，成为最终待测液；蒸馏水作为空白管，在490纳米吸收波长下测量吸光度，做三次平行试验；
⑤计算：按照制得的标准曲线的回归方程，计算曲线中c6h12o6浓度，再乘以0.9(葡萄糖与多糖的转换系数)得出曲线中多糖浓度。
具体计算方式为，将e得到的吸光度带入回归方程，计算曲线中c6h12o6浓度，再乘以0.9(葡萄糖与多糖的转换系数)得出曲线中芦荟多糖浓度，然后将多糖浓度再代入公式(1)计算出芦荟多糖含量，再带入公式(2)从而得出芦荟多糖的纯度：
曲线中芦荟多糖的含量(mg)＝曲线中芦荟多糖浓度(mg/ml)×10ml×稀释倍数公式(1)
芦荟多糖的纯度＝曲线中芦荟多糖的含量(mg)×10-3/0.035g×100％公式(2)
根据测得的吸光度，代入线性方程式，及式(1)、式(2)，得如下表1：
表1芦荟多糖含量
由表1得出，芦荟的芦荟多糖平均含量为16.215mg、芦荟多糖的纯度为46.32％。在重复性实验中，测定的结果稳定，数值间相差不是很大，说明该文的提取方法重复性较好。
实施例2
一种芦荟中芦荟多糖的提取和测定方法，选取木立芦荟为研究对象，包括以下步骤，
s1、准备样品：采摘鲜嫩的芦荟叶，用清水把芦荟叶上的灰尘清洗干净，然后轻轻的用手术刀去掉叶上的刺，再用手术刀横切成4毫米的薄片平铺在托盘上，然后放入烘箱中，在50℃条件下烘11小时，最后把烘干的芦荟叶粉碎成粉末状制成芦荟粉，所述芦荟粉为40目，放在棕色试剂瓶里避光并贴上标签，备用。
s2、微波处理：称取步骤s1准备的芦荟粉，加入20ml蒸馏水，得提取液，将所述提取液微波处理,所述微波处理设定功率为600w，控制微波时间以将预处理液温度达到75℃时为止。
s3、超声波提取：将微波处理后的提取液超声波提取70min,提取温度为40℃，超声波功率为100w，超声结束后用移液枪吸取提取液放进离心管中，再以每分钟2250转的转速，进行离心10分钟，然后离心过滤得滤液和残渣。
s4、超声波二次提取：将步骤s4中的滤液调节ph到3～3.5，并加入滤液4倍体积的无水乙醇，超声波处理40min,提取温度为40℃，超声波功率为100w，，超声结束后用移液枪吸取提取液放进离心管中，以每分钟4000转的转速，进行离心10分钟，然后离心过滤取积淀。最后将所述积淀干燥得到芦荟多糖。
s5、芦荟多糖测定：用分光光度法测定芦荟多糖的含量。具体步骤为：
①显色液配制：先用量筒准确量取50毫升的浓h2so4，再把50毫升的浓h2so4徐徐加进10毫升水中冷却直到室温，再加入之前称量好的0.6克苯酚晶体，溶解后配成显色液；
②绘制标准曲线：精密称取干燥至质量恒定(105℃烘干2h)的c6h12o60.05克加蒸馏水至50毫升，得标准c6h12o6溶液浓度为每毫升1毫克。取标准c6h12o6溶液0、1、2、3、4、5、6毫升，再用25毫升容量瓶定容得到糖液；依照糖液：显色液＝1:5的比例加进去试管，振动混匀，放在沸水浴中保温30min，取出冷却直到室内温度，于490纳米波长下分别测定吸光度，从而绘制出标准曲线，得到芦荟多糖的回归方程为y＝6.0921x+0.0149，r2＝0.9988。
③样品的测定：吸精确称量0.05克干燥后的芦荟多糖放进烧杯中，加入少量蒸馏水溶解，再用蒸馏水定容到10毫升容量瓶中得到糖液，依照糖液：显色液＝1:5比例加进去试管，振动混匀，放在沸水浴中保温30min，取出冷却直到室内温度，摇匀备用；用10毫升量筒准确量取4毫升上述备用液至试管中，再加入8毫升蒸馏水，稀释3倍摇匀备用，成为最终待测液；蒸馏水作为空白管，在490纳米吸收波长下测量吸光度，做三次平行试验；
⑥计算：按照制得的标准曲线的回归方程，计算曲线中c6h12o6浓度，再乘以0.9(葡萄糖与多糖的转换系数)得出曲线中多糖浓度。
具体计算方式为，将e得到的吸光度带入回归方程，计算曲线中c6h12o6浓度，再乘以0.9(葡萄糖与多糖的转换系数)得出曲线中芦荟多糖浓度，然后将多糖浓度再代入公式(1)计算出芦荟多糖含量，再带入公式(2)从而得出芦荟多糖的纯度：
曲线中芦荟多糖的含量(mg)＝曲线中芦荟多糖浓度(mg/ml)×10ml×稀释倍数公式(1)
芦荟多糖的纯度＝曲线中芦荟多糖的含量(mg)×10-3/0.05g×100％公式(2)
根据测得的吸光度，代入线性方程式，及式(1)、式(2)，得如下表2：
表2芦荟多糖含量
由表2得出，芦荟的芦荟多糖平均含量为23.058mg、芦荟多糖的纯度为46.12％。在重复性实验中，测定的结果稳定，数值间相差不是很大，说明该文的提取方法重复性较好。本实验采用的方法可以为芦荟的开发利用研究提供一定的理论依据。
上述说明凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，盖专利范围。