本发明涉及一种n-氨基硫脲-o-季铵盐壳寡糖及制备方法和应用。
背景技术：
现代工业的急剧发展，造成水资源污染日益严重，甚至波及到了地下水的安全问题。同样，大量存在的腐蚀现象和微生物污染，严重影响工业设施、公共卫生设施和日用设施的使用安全。一些材料如金属腐蚀抑制剂、金属离子吸附剂和抑菌剂的使用，大多依赖于化学合成材料。传统材料的低效、高耗能以及化学合成过程中带来的污染、材料使用过程带来的新污染，使得开发并使用绿色环保的天然源产物的水处理剂、防腐剂和杀菌剂势在必行。可减少纯化学合成试剂和材料的使用，同样符合可持续发展的思路。
壳寡糖是壳聚糖主链断裂后的降解物，也称几丁寡糖，学名寡糖葡萄糖胺。是壳聚糖经物理、化学或酶降解而成的水溶性好、功能作用大、生物活性高、聚合度为的低分子量壳聚糖。壳寡糖是自然界中唯一含有正电荷的碱性氨基寡糖，绿色天然、无副作用，因而能够作为一类新的生理活性物质。
中国专利cn201510539571.7公开了一种硫脲乙酸接枝壳聚糖重金属吸附剂的制备方法，它是通过硫脲乙酸接枝壳聚糖进行改性，虽然使其吸附稳定性有所提高，但该种硫脲乙酸接枝壳聚糖缺乏有效的亲水基团，在水中的絮凝效果较差，因此吸附性不理想，这使其在应用中受到许多限制。
技术实现要素：
从现有技术对壳寡糖的改性在吸附即杀菌性能上的表现，本申请发明人发现其存在以下问题：壳寡糖吸附性能差、易被溶解腐蚀，无法在酸性或碱性水溶液中长期使用。
为了解决现有技术的不足，本发明的目的之一是提供一种n-氨基硫脲-o-季铵盐壳寡糖，其结构式如下：
其由壳寡糖经氨基及c6位的羟基经过改性获得，其中，所述壳寡糖的数均分子量为200～3000。
本发明的目的之二是提供一种n-氨基硫脲-o-季铵盐壳寡糖的制备方法，采用甲醛与壳寡糖上的氨基进行反应获得n-亚甲基壳寡糖，然后采用3-氯-2-羟丙基三甲基氯化铵与所述n-亚甲基壳寡糖中c6位上的羟基进行反应获得n-亚甲基-o-季铵盐壳寡糖，最后采用氨基硫脲与所述n-亚甲基-o-季铵盐壳寡糖的碳氮双键进行加成反应获得n-氨基硫脲-o-季铵盐壳寡糖。
本发明首先对采用甲醛对壳寡糖上的氨基进行反应，使氨基转变为n-亚甲基，防止在壳寡糖上c6位上的羟基进行季铵化改性同时对氨基进行季铵化反应，还能将氨基转化成其他基团，方便进行其他化合反应。其次，本发明采用氨基硫脲与碳氮双键进行加成反应，反应效率高，且反应过程中不产生其他杂质，无需进行分离。本方法制备的n-氨基硫脲-o-季铵盐壳寡糖，不仅解决了壳寡糖、壳聚糖衍生物吸附性差，易被溶解腐蚀的问题，而且在酸性、中性、碱性水溶液中均可使用。同时，提高了其抑菌性能，在金属离子的吸附和抑制细菌上有很好的效果。
本发明的目的之三是提供一种上述n-氨基硫脲-o-季铵盐壳寡糖或上述方法制备的n-氨基硫脲-o-季铵盐壳寡糖在抑制细菌或金属离子吸附中的应用。
本发明的目的之四是提供一种上述n-氨基硫脲-o-季铵盐壳寡糖或上述方法制备的n-氨基硫脲-o-季铵盐壳寡糖在废水处理中的应用。
本发明的有益效果为：
(1)本发明制备的n-氨基硫脲-o-季铵盐壳寡糖，解决了壳寡糖、壳聚糖衍生物吸附性差，易被溶解腐蚀的问题，在金属离子的吸附上有很好的效果。
(2)本发明制备的n-氨基硫脲-o-季铵盐壳寡糖，由于侧链上取代了季铵盐基团，大大提高了其抑菌性，可作为杀菌剂来使用。
(3)本发明制备的n-氨基硫脲-o-季铵盐壳寡糖，解决了壳聚糖衍生物只在酸性环境下溶解而应用受限的问题，具有良好的金属吸附络合能力和抑菌能力，可被用作抑菌剂和金属络合剂而应用于抗菌和重金属污染物处理领域。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
本发明中所述的有机溶剂为能够与水互溶的有机物，例如甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丙酮等。
本发明中所述的碱为溶于水后的ph值大于7的化合物，例如氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠等。
正如背景技术所介绍的，现有技术中存在壳寡糖吸附性能差、易被溶解腐蚀、无法在酸性或碱性水溶液中使用的不足，为了解决如上的技术问题，本申请提出了一种n-氨基硫脲-o-季铵盐壳寡糖。
本申请的一种典型实施方式，提供了一种n-氨基硫脲-o-季铵盐壳寡糖，其结构式如下：
其由壳寡糖经氨基及c6位的羟基经过改性获得，其中，所述壳寡糖的数均分子量为200～3000。
本申请的另一种典型实施方式，提供了一种n-氨基硫脲-o-季铵盐壳寡糖的制备方法，采用甲醛与壳寡糖上的氨基进行反应获得n-亚甲基壳寡糖，然后采用3-氯-2-羟丙基三甲基氯化铵与所述n-亚甲基壳寡糖中c6位上的羟基进行反应获得n-亚甲基-o-季铵盐壳寡糖，最后采用氨基硫脲与所述n-亚甲基-o-季铵盐壳寡糖的碳氮双键进行加成反应获得n-氨基硫脲-o-季铵盐壳寡糖。
本发明制备n-氨基硫脲-o-季铵盐壳寡糖，在羟基上的取代主要位于c6位置上，c3位置上的取代度只占羟基总取代度的5％，因此在后面的说明中只考虑c6位置羟基的取代。
本发明首先对采用甲醛对壳寡糖上的氨基进行反应，使氨基转变为n-亚甲基，防止在壳寡糖上c6位上的羟基进行季铵化改性同时对氨基进行季铵化反应，还能将氨基转化成其他基团，方便进行其他化合反应。其次，本发明采用氨基硫脲与碳氮双键进行加成反应，反应效率高，且反应过程中不产生其他杂质，无需进行分离。本方法制备的n-氨基硫脲-o-季铵盐壳寡糖，不仅解决了壳寡糖、壳聚糖衍生物吸附性差，易被溶解腐蚀的问题，而且在酸性、中性、碱性水溶液中均可使用。同时，提高了其抑菌性能，在金属离子的吸附和抑制细菌上有很好的效果。
优选的，步骤为：
(1)n-亚甲基壳寡糖的制备：将壳寡糖制备成壳寡糖水溶液，向所述壳寡糖水溶液中滴加甲醛水溶液，滴加完毕后室温搅拌一段时间可得n-亚甲基壳寡糖；
(2)n-亚甲基-o-季铵盐壳寡糖的制备：步骤(1)制备的n-亚甲基壳寡糖加入至有机溶剂中进行溶胀，再加入碱的水溶液继续溶胀，加热后，加入3-氯-2-羟丙基三甲基氯化铵，搅拌反应后可得n-亚甲基-o-季铵盐壳寡糖；
(3)n-氨基硫脲-o-季铵盐壳寡糖的合成：将步骤(2)制备的n-亚甲基-o-季铵盐壳寡糖加入至水中制成改性壳寡糖水溶液，向所述改性壳寡糖水溶液中加入氨基硫脲水溶液，室温搅拌一段时间后可得n-氨基硫脲-o-季铵盐壳寡糖。
本申请中所述的室温为制备过程中所处环境的温度，为15～35℃。
进一步优选的，所述壳寡糖的数均分子量为200～3000，脱乙酰度为80％～95％。更进一步优选的，所述壳寡糖的数均分子量为200～1000，脱乙酰度为90％～95％。该分子量下的壳寡糖水溶性更好，能够使壳寡糖中的氨基和c6位的羟基充分暴露，从而提高壳寡糖的改性效率。
进一步优选的，步骤(1)中甲醛的加入量为-cho与壳寡糖重复单元上-nh2的摩尔比为1.1:1～1.5:1。能够保证壳寡糖中的氨基完全改性。
为了保证氨基反应完全，进一步优选的，步骤(1)中室温搅拌的时间为4～5h。
为了获得纯净的n-亚甲基壳寡糖，本申请进一步优选了一种n-亚甲基壳寡糖的纯化方法，将步骤(1)室温搅拌后的混合物料采用乙醇进行沉淀，抽滤，乙醇洗涤多次后进行干燥。
更进一步优选的，所述干燥为真空干燥，干燥的温度为40℃。
为了使n-亚甲基壳寡糖溶胀的更充分，更好的将n-亚甲基壳寡糖中的c6位的羟基暴露出来，从而进行季铵化改性，本申请进一步优选的，步骤(2)中所述有机溶剂为异丙醇。为了进一步使n-亚甲基壳寡糖中的c6位的羟基完全暴露出来，本申请更进一步优选的，步骤(2)中所述碱是水溶液为质量分数为40％的naoh溶液。
为了加快季铵化改性的反应速率，本申请进一步优选的，步骤(2)中加热至80～85℃下。
为了使壳寡糖中的c6位的羟基改性完全，本申请进一步优选的，步骤(2)中述3-氯-2-羟丙基三甲基氯化铵与n-亚甲基壳寡糖上c6位-oh的摩尔比为1.1:1～2.5:1。
为了使壳寡糖中的c6位的羟基反应完全，本申请进一步优选的，步骤(2)中所述的搅拌反应时间为24～36h。
为了获得纯净的n-亚甲基-o-季铵盐壳寡糖，本申请进一步优选了一种n-亚甲基-o-季铵盐壳寡糖的纯化方法，将步骤(2)搅拌反应后的混合物料调节ph至中性，采用丙酮沉积，抽滤，再对滤饼进行洗涤、干燥。
为了对滤饼进行充分洗涤，更进一步优选的，对滤饼进行洗涤为依次用80wt.％乙醇、90wt.％乙醇和无水乙醇进行洗涤。
更进一步优选的，所述干燥为真空干燥，干燥的温度为40℃。
为了使-n＝ch2改性完全，本申请进一步优选的，步骤(3)中氨基硫脲与n-亚甲基-o-季铵盐壳寡糖上-n＝ch2的摩尔比为1:1～2:1。
为了保证-n＝ch2反应完全，本申请进一步优选的，步骤(3)中室温搅拌的时间为12～14h。
为了获得纯净的n-亚甲基壳寡糖，本申请进一步优选了一种n-氨基硫脲-o-季铵盐壳寡糖的纯化方法，将步骤(3)室温搅拌后的混合物料采用乙醇进行沉淀，抽滤，乙醇洗涤多次后进行干燥。
更进一步优选的，所述干燥为真空干燥，干燥的温度为40℃。
本申请还提供了一种上述n-氨基硫脲-o-季铵盐壳寡糖或上述方法制备的n-氨基硫脲-o-季铵盐壳寡糖在抑制细菌或金属离子吸附中的应用。
本申请还提供了一种上述n-氨基硫脲-o-季铵盐壳寡糖或上述方法制备的n-氨基硫脲-o-季铵盐壳寡糖在废水处理中的应用。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
实施例1
(1)n-亚甲基壳寡糖的制备
4g壳寡糖溶于50ml去离子水中，取浓度为15％的甲醛溶液9.3ml，逐滴加入到上述溶液中，搅拌4h。4倍体积乙醇沉降，抽滤，乙醇洗涤2次，40℃真空干燥至恒重。
(2)n-亚甲基o-季铵盐壳寡糖的制备
称取(1)中干燥后的产物2g在30ml异丙醇充分溶胀，加入10ml40％的naoh溶液，继续溶胀后,80℃下加入1.32g3-氯-2-羟丙基三甲基氯化铵，搅拌反应24h。调节ph至中性，4倍体积丙酮沉降，抽滤，依次用80wt.％、90wt.％和无水乙醇洗涤，40℃真空干燥至恒重。
(3)n-氨基硫脲-o-季铵盐壳寡糖的合成
称取(2)中干燥后的产物2g溶于30ml去离子水中，称取2.26g氨基硫脲溶于10ml去离子水后加入到上述溶液中，在室温下继续搅拌反应12h。4倍体积乙醇沉降，乙醇洗涤2次，抽滤，40℃真空干燥至恒重，即得n-氨基硫脲-o-季铵盐壳寡糖。记为样品i。
实施例2
(1)n-亚甲基壳寡糖的制备
4g壳寡糖溶于50ml去离子水中，取浓度为15％的甲醛溶液9.5ml，逐滴加入到上述溶液中，搅拌4h。4倍体积乙醇沉降，抽滤，乙醇洗涤2次，40℃真空干燥至恒重。
(2)n-亚甲基-o-季铵盐壳寡糖的制备
称取(1)中干燥后的产物2g在30ml异丙醇充分溶胀，加入10ml40％的naoh溶液，继续溶胀后,80℃下加入1.32g3-氯-2-羟丙基三甲基氯化铵，搅拌反应24h。调节ph至中性，4倍体积丙酮沉降，抽滤，依次用80wt.％、90wt.％和无水乙醇洗涤，40℃真空干燥至恒重。
(3)n-氨基硫脲-o-季铵盐壳寡糖的合成
称取(2)中干燥后的产物2g溶于30ml去离子水中，称取3.39g氨基硫脲溶于10ml去离子水后加入到上述溶液中，在室温下继续搅拌反应12h。4倍体积乙醇沉降，乙醇洗涤2次，抽滤，40℃真空干燥至恒重，即得n-氨基硫脲-o-季铵盐壳寡糖。记为样品ii。
实施例3
(1)n-亚甲基壳寡糖的制备
4g壳寡糖溶于50ml去离子水中，取浓度为15％的甲醛溶液10ml，逐滴加入到上述溶液中，搅拌4h。4倍体积乙醇沉降，抽滤，乙醇洗涤2次，40℃真空干燥至恒重。
(2)n-亚甲基o-季铵盐壳寡糖的制备
称取(1)中干燥后的产物2g在30ml异丙醇充分溶胀，加入10ml40％的naoh溶液，继续溶胀后,85℃下加入1.32g3-氯-2-羟丙基三甲基氯化铵，搅拌反应24h。调节ph至中性，4倍体积丙酮沉降，抽滤，依次用80wt.％、90wt.％和无水乙醇洗涤，40℃真空干燥至恒重。
(3)n-氨基硫脲-o-季铵盐壳寡糖的合成
称取(2)中干燥后的产物2g溶于30ml去离子水中，称取4.52g氨基硫脲溶于12ml去离子水后加入到上述溶液中，在室温下继续搅拌反应12h。4倍体积乙醇沉降，乙醇洗涤2次，抽滤，40℃真空干燥至恒重，即得n-氨基硫脲-o-季铵盐壳寡糖。记为样品iii。
实施例4
(1)n-亚甲基壳寡糖的制备
4g壳寡糖溶于50ml去离子水中，取浓度为15％的甲醛溶液9.5ml，逐滴加入到上述溶液中，搅拌4h。4倍体积乙醇沉降，抽滤，乙醇洗涤2次，40℃真空干燥至恒重。
(2)n-亚甲基o-季铵盐壳寡糖的制备
称取(1)中干燥后的产物2g在30ml异丙醇充分溶胀，加入10ml40％的naoh溶液，继续溶胀后,85℃下加入2.16g3-氯-2-羟丙基三甲基氯化铵，搅拌反应24h。调节ph至中性，4倍体积丙酮沉降，抽滤，依次用80wt.％、90wt.％和无水乙醇洗涤，40℃真空干燥至恒重。
(3)n-氨基硫脲-o-季铵盐壳寡糖的合成
称取(2)中干燥后的产物2g溶于30ml去离子水中，称取3.39g氨基硫脲溶于10ml去离子水后加入到上述溶液中，在室温下继续搅拌反应12h。4倍体积乙醇沉降，乙醇洗涤2次，抽滤，40℃真空干燥至恒重，即得n-氨基硫脲-o-季铵盐壳寡糖。记为样品iv。
实施例5
(1)n-亚甲基壳寡糖的制备
4g壳寡糖溶于50ml去离子水中，取浓度为15％的甲醛溶液10ml，逐滴加入到上述溶液中，搅拌4h。4倍体积乙醇沉降，抽滤，乙醇洗涤2次，40℃真空干燥至恒重。
(2)n-亚甲基o-季铵盐壳寡糖的制备
称取(1)中干燥后的产物2g在30ml异丙醇充分溶胀，加入10ml40％的naoh溶液，继续溶胀后，80℃下加入3.0g3-氯-2-羟丙基三甲基氯化铵，搅拌反应24h。调节ph至中性，4倍体积丙酮沉降，抽滤，依次用80wt.％、90wt.％和无水乙醇洗涤，40℃真空干燥至恒重。
(3)n-氨基硫脲-o-季铵盐壳寡糖的合成
称取(2)中干燥后的产物2g溶于30ml去离子水中，称取3.39g氨基硫脲溶于10ml去离子水加入到上述溶液中，在室温下继续搅拌反应12h。4倍体积乙醇沉降，乙醇洗涤2次，抽滤，40℃真空干燥至恒重，即得n-氨基硫脲-o-季铵盐壳寡糖。记为样品v。
各实施例制备样品的接枝基团的取代度如表1所示。
表1各样品接枝基团的取代度
重金属离子吸附测试
方法：金属离子混合溶液的配制，标准金属离子混合试剂原液进行稀释，其中含有镍(ii)(ni，2.0mg/l)、铜(ii)(cu，1.6mg/l)、镉(ii)(cd，0.8mg/l)、锌(ii)(zn，0.8mg/l)和铅(ii)(pd，8.0mg/l)。准确称取50mg的样品和50mg的壳寡糖(数均分子量为200～3000，脱乙酰度85％-90％)，加入到10ml含有混合金属离子的溶液中。用0.1mol/l浓度的hno3和naoh调节溶液的ph值到4、7和9三个范围。随后，将塑料离心管置于摇床上，在室温下(25℃±0.1℃)放置吸附约36小时。另做一组空白试验作对比。
吸附实验结束之后，将各个样品管中的吸附有金属离子的吸附剂，采用膜过滤法过滤。采用装有0.10μm滤膜的注射器进行推进过滤，将滤液收集起来。准确量取一定体积的吸附后溶液，进行检测。
表2.ph＝4时样品i、ii、iii对金属离子的吸附测试结果
表3.ph＝7时样品i、ii、iii对金属离子的吸附测试结果
表4.ph＝9时样品i、ii、iii对金属离子的吸附测试结果
经测试，n-氨基硫脲-o-季铵盐壳寡糖在水中与重金属离子接触后絮凝效果最好，因此改变氨基硫脲的取代度进行重金属吸附测试，观察测试效果。由表2～4的数据可知，在不同ph环境下，样品i、ii、iii对于重金属离子ni(ii)、cu(ii)、cd(ii)和pb(ii)的吸附能力不同，且对上述五种金属离子的吸附在ph＝7、ph＝9时吸附效果较好，这是由于在中性或碱性环境下重金属离子易形成沉淀，有一部分沉降，剩余部分被吸附，从而使其剩余量更少，其中随着氨基硫脲的取代度的增加其吸附效率越高，但对zn(ii)几乎没有吸附能力，其在中性和碱性环境下浓度减少是因为zn(ii)的氢氧化物自身沉淀作用的结果。细菌最小抑菌浓度的测定
用最小抑菌浓度法进行抗菌活性实验，调取受试菌种分别为：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、链球菌、嗜水气单胞菌、河弧菌。
用接种环轻轻划取一环菌种菌落至110ml营养肉汤(蛋白胨1g，氯化钠0.5g，牛肉膏0.3g，去离子水110ml，ph＝7.0±0.1)中，菌落于37℃恒温摇床上120r/min培养20～24h，配制无菌生理盐水将菌悬液稀释至3.0×106cfu/ml，以备抗菌测试。
方法：分别配制质量分数1％的壳聚糖(数均分子量为20万～50万，脱乙酰度85％-90％)超声分散于水中、1％的壳寡糖(数均分子量为200～3000，脱乙酰度85％-90％)的水溶液和样品ii、iv、v的水溶液，125℃高温灭菌30min后，用2倍稀释法溶于高温灭菌后的营养肉汤中，配制最终浓度为0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625、0.00313％溶液，取0.1ml浓度约3.0×106cfu/ml的菌悬液于0.9ml上述个浓度样品中，震荡均匀后取0.1ml涂平板，菌悬液于37℃培养72h，数菌落得最低抑菌浓度。
表5ph＝7时壳聚糖和样品ii、iv、v的最低抑菌浓度
由表5可知，在中性环境中，壳聚糖的抑菌活性很弱，原因主要有两点：一是在中性环境下壳聚糖的溶解度很低；二是在中性环境下壳聚糖c2位氨基的质子化水平低。而壳寡糖的水溶性很好，相比壳聚糖，其抑菌效果明显提高，但仍不理想。季铵盐化后的壳寡糖，一方面增强了溶解度，另一方面，随着样品ii、iv、v季铵化程度的不断提高，不同程度的季铵化使其本身就具有正电荷，易于与带负电的细菌外膜发生相互作用。这两方面作用使得n-氨基硫脲-o-季铵盐壳寡糖的抑菌活性有显著的增强。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。