一种基于场效应管的聚合酶链式反应的装置及其使用方法与流程

本发明涉及聚合酶链式反应技术领域，具体涉及一种基于场效应管的高通量聚合酶链式反应的装置及其使用方法。

背景技术：

聚合酶链式反应(pcr)是一种用于放大扩增特定的dna片段的分子生物学技术，目前被广泛的用于各种生物类科研机构的生物体外dna快速复制，pcr的最大特点是能将极其微量的dna成几何级数的快速扩增。因此，pcr技术广泛应用于遗传、生化、免疫、医药等领域，不仅可以实现基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究，还可用于疾病的诊断或任何涉及到dna和rna的领域，展现出了强大的应用前景。

根据实验情况，聚合酶链式反应是利用dna在体外摄氏95°高温时变性成单链，低温(通常是60℃左右)时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至dna聚合酶最适宜反应温度(72℃左右)，dna聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。所以聚合酶链式反应是在模板dna、引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下，依赖于dna聚合酶的酶促合反应，将待扩增的dna片段与其两侧互补的寡核苷酸链引物经“高温变性——低温退火——引物延伸”三步反应的多次循环，使dna片段在数量上呈指数增加，从而在短时间内获得我们所需的大量的特定基因片段。而基于聚合酶制造的pcr仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。

然而，目前的pcr仪的温控仅能够实现全pcr孔板，材质以聚丙烯为主(较常使用的为96孔或384孔的pcr板)，或pcr孔管(pcr单管、pcr联管)共同升温或者降温至特定温度，对于单个孔板或孔管的温度是不具备温度控制能力的。同时传统的pcr仪仅能够设定循环温度和次数，无法确定聚合酶链式反应循环后产物总量，为了能够实时测定产物总量，一般需要在反应体系中加入荧光基因，并且使用实时荧光定量pcr来以荧光信号通过内参或者外参法对待测样品中的特定dna序列进行定量分析。由于在pcr扩增的指数时期，模板的ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。而具有实时荧光定量的pcr不仅增加了大量的操作步骤，同时相比起普通的pcr其设备价格也非常高昂。

技术实现要素：

本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是解决现有技术中pcr仪只能实现全pcr孔板共同升温或者降温，对于单个孔板或孔管的温度不具备温度控制能力，并且聚合酶链式反应循环后产物总量检测复杂麻烦等技术问题。

为了实现本发明这些目的和其它优点，本发明提供了一种基于场效应管实现高通量聚合酶链式反应的装置，在同一样品区域制备两种不同类型的场效应晶体管。其中之一利用调节背栅电压来实现原位加热达到聚合酶链式反应不同阶段所需的温度，另一种利用离子浓度的变化导致的场效应晶体管源极和漏极之间电流的变化来实时检测循环后产物的总量。从而实现高通量聚合酶链式反应及产物检测。同时对于不同类型的场效应晶体管可大规模阵列及图形化制备，从而达到高通量聚合酶链式反应。

本发明的基于场效应管的聚合酶链式反应的装置，其具体结构包括：基板、设置于基板上的多个样品孔、场效应管、印刷电路、转换接口及控制器；所述场效应管包括设置于每个样品孔底端中心位置的用于检测离子浓度的第一场效应管，以及底端边缘位置的至少两个用于加热的第二场效应管；所述第一场效应管和第二场效应管通过印刷电路连接到转换接口，转换接口与控制器连接，从而实现在控制器上对每个场效应管进行控制以及数据检测。

优选的是，所述第二场效应管有两个，对称设置于第一场效应管的两侧。

优选的是，所述第一场效应管和第二场效应管的结构相同，具体由衬底、绝缘层、源极、漏极和栅极构成；所述衬底下表面设置栅极，上表面设置绝缘层，绝缘层上设置源极和漏极。

优选的是，所述控制器为计算机。

优选的是，所述第一场效应管和第二场效应管的制备方法相同，包括如下步骤：

s1、选择目标衬底，目标衬底为cu、ni、pt及si材料中的一种；

s2、在所述目标衬底上表面生成一层薄膜绝缘层；

s3、利用光刻工艺扩散两个高掺杂的区域，并从中分别引出漏极和源极；

s4、在所述目标衬底的下表面沉积金属层形成栅极，即得到场效应管。

进一步优选的是，所述绝缘层为sio2涂层或石墨烯涂层。

一种基于场效应管的聚合酶链式反应的装置的使用方法，其包括如下步骤：

s1、将需要进行扩增的dna样品、设计引物、taqdna聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸按照一定比例配好加入到样品孔内，得到混合溶液；

s2、将场效应管通过转换接口以及数据线连接至控制器；

s3、通过电源控制，在所述第二场效应管的电极之间加电压源或电流源，通过调节背栅电压或电流大小使场效应管产生热量将混合溶液升温至90～96℃，使双链dna模板在热作用下氢键断裂，形成单链dna；

s4、减小背栅电压或电流，混合溶液降温至40～65℃，混合溶液温度降低，引物与dna模板结合，形成局部双链；

s5、再次增大背栅电压或电流，混合溶液升温至68～75℃，在taqdna聚合酶的作用下，以脱氧核糖核苷三磷酸为原料，从引物的5′端向3′端延伸；

s6、重复操作步骤s3～s5，共计15～25次，每一次循环经过变性、退火和延伸，dna含量即增加一倍，实现周期性的聚合酶链式反应；

其中，在s3～s6所有步骤中，离子浓度的变化会影响到第一场效应管的栅极电压，因而通过检测源极和漏极之间电流的变化来实时检测循环后产物的总量。

优选的是，所述第二场效应管加热温度范围为20～120℃。

优选的是，所述场效应管两端施加的电流范围为0～1a。

优选的是，所述步骤s5中，电阻升温至72℃。

本发明的有益之处在于：

(1)相比起传统pcr仪仅能够实现所有区域同一温度以及固定的升温降温模式，因而对于不同的样品无法设置最优化的条件。本发明的装置以针对每一个样品孔设置独立的升温降温曲线和温度，从而能够对不同的样品确定最适宜的扩增方案；还能够实时在线检测产物的总量。本发明的基于场效应管的聚合酶链式反应的装置结构简单，使用操作简单，可以实现基于不同尺寸的微反应区独立温度的控制，从而实现聚合酶链式反应。

(2)相比起传统pcr仪，一次仅能够实现96个样品的扩增，即便大容量的pcr仪也仅能够达到384个样品孔，而基于场效应管的聚合酶链式反应装置制备方法简单，与现有的mos工艺兼容，可以根据实验需要，设置大量的样品孔，大规模阵列及图形化制备，从而达到高通量的聚合酶链式反应。

附图说明

图1基于场效应管的聚合酶链式反应装置装配总图；

图2基于场效应管的聚合酶链式反应装置基板及场效应管截面图；

图3单个场效应管截面图；

图4实施例2中基于场效应管的产物总量测定方法与现有的荧光测定方法的对比图；

图5实施例3中基于场效应管的产物总量测定方法与现有的荧光测定方法的对比图。

图中标号：

基板1、样品孔2、场效应管3、第一场效应管31、第二场效应管32、印刷电路4、转换接口5、控制器6、衬底7、绝缘层8、源极9、漏极10、栅极11、电路线12、数据线13。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

如图1～3所示，本发明提供了一种基于场效应管的聚合酶链式反应的装置，其包括基板1、设置于基板1上的多个样品孔2、场效应管3、印刷电路4、转换接口5及控制器6。基板1上可以设置根据实验需要设置大量的样品孔2，大规模阵列及图形化制备，从而达到高通量的聚合酶链式反应。所述场效应管3包括设置于每个样品孔2底端中心位置的用于检测离子浓度的第一场效应管31，以及底端边缘位置的至少两个用于加热的第二场效应管32；所述第一场效应管31和第二场效应管32通过印刷电路4及电路线12接到转换接口5，转换接口5通过数据线13与控制器6连接，从而实现在控制器6上对每个场效应管进行控制以及数据检测。

上述方案中，所述第二场效应管32有两个，分别对称设置于第一场效应管31的两侧。所述第一场效应管31和第二场效应管32的结构相同，具体由衬底7、绝缘层8、源极9、漏极10和栅极11构成；所述衬底7下表面设置栅极11，上表面设置绝缘层8，绝缘层8上设置源极9和漏极10。第一场效应管31用于检测离子浓度，施加到其电极上的电压源或电流源较小。第二场效应管32用于加热，加在电极之间的电压源或电流源较大，场效应管发热对混合溶液加热升温。

优选的是，所述控制器6为计算机。

另一实施例中，所述第一场效应管31和第二场效应管32的制备方法相同，包括如下步骤：s1、选择目标衬底7，目标衬底为cu、ni、pt及si材料中的一种；s2、在所述目标衬底7上表面生成一层薄膜绝缘层8，所述绝缘层8优选sio2涂层或石墨烯涂层；s3、利用光刻工艺扩散两个高掺杂的区域，并从中分别引出源极9和漏极10；s4、在所述目标衬底的下表面沉积金属层形成栅极11，即得到单个的场效应管。

实施例2

一种基于场效应管的聚合酶链式反应的装置的使用方法，其包括如下步骤：

s1、将需要进行扩增的dna样品、设计引物、taqdna聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸按照一定比例配好加入到样品孔内，得到混合溶液，其中，所述场效应管的目标衬底为si材料制成，其表面的绝缘层为sio2涂层；

s2、将场效应管通过转换接口以及数据线连接至控制器；

s3、通过电源控制，在所述第二场效应管的电极之间加电压源或电流源，通过调节背栅电压或电流大小使场效应管产生热量将混合溶液升温至95℃，使双链dna模板在热作用下氢键断裂，形成单链dna；

s4、减小背栅电压或电流，场效应管降温，使混合溶液降温至45℃，引物与dna模板结合，形成局部双链；

s5、再次增大背栅电压或电流，场效应管升温，使混合溶液升温至70℃，在taqdna聚合酶的作用下、以脱氧核糖核苷三磷酸为原料，从引物的5′端向3′端延伸；

s6、重复操作步骤s3～s5，共计15次，每一次循环经过变性、退火和延伸，dna含量即增加一倍，实现周期性的聚合酶链式反应；

其中，在s3～s6所有步骤中，离子浓度的变化会影响到第一场效应管的栅极电压，因而通过检测源极和漏极之间电流的变化来实时检测循环后产物的总量。将本发明的基于场效应管的产物总量测定方法与现有的荧光测定方法进行对比，结果见图4。可以看出，本发明的测定产物总量的方法测定结果与现有的荧光测定法相似，误差小，准确性高。

实施例3

一种基于场效应管的聚合酶链式反应的装置的使用方法，其包括如下步骤：

s1、将需要进行扩增的dna样品、设计引物、taqdna聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸按照一定比例配好加入到样品孔内，得到混合溶液，其中，所述场效应管的目标衬底为cu材料制成，其表面的绝缘层为石墨烯涂层；

s2、将场效应管通过转换接口以及数据线连接至控制器；

s3、通过电源控制，在所述第二场效应管的电极之间加电压源或电流源，通过调节背栅电压或电流大小使场效应管产生热量将混合溶液升温至92℃，使双链dna模板在热作用下氢键断裂，形成单链dna；

s4、减小背栅电压或电流，场效应管降温，使混合溶液温度降至40℃，引物与dna模板结合，形成局部双链；

s5、再次增大背栅电压或电流，场效应管升温，使混合溶液升温至72℃，在taqdna聚合酶的作用下，以脱氧核糖核苷三磷酸为原料，从引物的5′端向3′端延伸；

s6、重复操作步骤s3～s5，共计20次，每一次循环经过变性、退火和延伸，dna含量即增加一倍，实现周期性的聚合酶链式反应；

其中，在s3～s6所有步骤中，离子浓度的变化会影响到第一场效应管的栅极电压，因而通过检测源极和漏极之间电流的变化来实时检测循环后产物的总量。将本发明的基于场效应管的产物总量测定方法与现有的荧光测定方法进行对比，结果见图5。可以看出，本发明的测定产物总量的方法测定结果与现有的荧光测定法相似，误差小，准确性高。

综上所述，本发明的反应装置及方法不仅可以针对每一个样品孔设置独立的升温降温曲线和温度，从而能够对不同的样品确定最适宜的扩增方案；还能够实时在线检测产物的总量；而且，通过与现有的mos工艺兼容，便于大规模阵列及图形化制备，从而达到高通量聚合酶链式反应。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。