一种用于抗性基因水平基因转移研究的实验装置及方法与流程

本发明适用于环境中抗生素抗性基因的传播污染研究，特别涉及抗性基因在环境中的接合转移在基因转移中的风险研究，是一种用于抗性基因水平基因转移研究的实验装置及方法。

背景技术：

2006年，pruden等人首次提出将抗生素抗性基因(antibioticresistancegenes，args)作为一类环境新兴污染物，其他污染物不同的是args具有遗传性，可在亲代与子代之间通过垂直转移的方式传递，也可以通过可移动的遗传元件水平转移给原本没有args的菌体。因此，会对环境造成长期并且不可逆转的影响。如果人畜感染了携带有args的致病菌，治疗时抗生素的作用就会大大降低，增加治愈的困难。研究表明用于医疗或者动物养殖的抗生素约有75％-95％以原药或者代谢物形式排出体，由于抗生素的频繁使用和排放，在环境中形成了一定水平的积累，并对抗生素抗性的形成了选择压力，进而促使args的传播和转化。通常在环境介质中，菌株依靠水平基因转移(horizontalgenetransfer,hgt)的方式来获得抗生素抗性。由于hgt可以在同种或不同种属的菌株间发生传递，因而大大加速了抗性基因的出现。转化、转导和接合被认为是基因水平转移的主要方式。其中接合转移依赖微生物间的直接接触，1950年bernardd.davis提出带有滤板的连通的玻璃管对缺陷型菌株的接合实验也证明了这一点，然而bernardd.davis的原始文献中对该实验也只有简单的提及，并没有明确说明实验的详细信息。

技术实现要素：

为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种用于抗性基因水平基因转移研究的实验装置及方法，装置主要设计为两个联通的三角培养瓶，易于摆放、操作及取样，两个三角培养瓶通过法兰连接，易于拆卸、取样、清洗和控制，法兰中间设有可更换的滤膜，滤膜孔径易于控制也可根据实验需要设置不同的孔径。本发明即达到操作简单实用又达到了控制接合转移细胞之间的直接接触的作用，并且制作简便，可灭菌重复使用。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种用于抗性基因水平基因转移研究的实验装置，至少包括两个可灭菌的三角培养瓶，其特征在于，所述三角培养瓶上设置有用于连接真空抽滤泵的细颈口和用于同其它三角培养瓶连接的连接口，在所述连接口处通过法兰连接，法兰中间设有能够阻止细胞之间的直接接触但是不妨碍相连接的三角培养瓶之间的其他物质交换的滤膜。

所述细颈口设置在所述连接口的上方，且所述细颈口与所述连接口分别位于三角培养瓶的相对两个方向上，所述细颈口开口斜向上，所述连接口为水平连接口。

所述三角培养瓶通过连接口两两连接，即，一个三角培养瓶仅与相邻的一个三角培养瓶通过连接口连接。

所述三角培养瓶通过细颈口连接真空抽滤泵，通过真空抽滤使得相连接的三角培养瓶之间发生物质交换。

所述滤膜两侧以砂芯筛板作为支持物，所述砂芯筛板以环形的硅胶垫片覆于连接管内，所述砂芯筛板和硅胶垫片用以支持和保护滤膜。

所述法兰分为内螺纹一侧与外螺纹一侧，分别置于相连接的三角培养瓶的连接口处，以聚乙烯环固定，所述滤膜、砂芯筛板以及硅胶垫片尺寸一致，以硅胶垫片、砂芯筛板、滤膜、砂芯筛板、硅胶垫片的顺序叠放后装入法兰外螺纹一侧，将外螺纹一侧与内螺纹一侧连接并密封，以随时更换滤膜，或根据实验需要选择不同孔径大小的滤膜。

所述三角培养瓶的容积为250ml；所述砂芯筛板孔径为10μm；所述连接口直径为3cm；所述滤膜孔径为0.22μm。

所述滤膜可为混合纤维素滤膜。

所述滤膜位于实验装置两管之间。

本发明还提供了用于抗性基因水平基因转移研究的实验方法，采用至少两个可灭菌的三角培养瓶，每个三角培养瓶上设置细颈口连接真空抽滤泵，将每个三角培养瓶与其它三角培养瓶通过连接口连接，并在连接管路上设置滤膜，通过真空抽滤使得相连接的三角培养瓶之间发生物质交换，通过滤膜阻止细胞之间的直接接触。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：可以阻止细胞直接接触但不影响包括病毒、质粒等其他大分子或小分子物质的交换，因此可以用于环境中抗生素抗性基因水平转移的研究。特别的接合转移需要细胞之间的直接接触，本发明可以排除质粒引起的转化作用和病毒引起的转导作用，为抗性基因接合转移的研究提供新的研究思路。

附图说明

图1为本发明的实验装置示意图。

图2为法兰内部结构示意图。

图中，1为三角培养瓶，2为连接真空抽滤泵的细颈口，3为两个三角培养瓶的连接口，4为法兰，5为硅胶垫片，6为砂芯筛板，7为滤膜。

图3为本发明实施例中各处理供受体激光共聚焦显微镜检测荧光信号表达结果。

其中，a代表大肠杆菌，b代表恶臭假单胞菌，c代表实验装置右侧培养瓶样品，d代表三角培养瓶混合培养物。

具体实施方式

下面结合附图和实施例详细说明本发明的实施方式。

实施例1

通过质粒在实验装置中扩散实验证明本发明不影响质粒、噬菌体等在两三角培养瓶之间的交流。

如图1所示，装置中，三角培养瓶1有两个，采用玻璃材质，三角培养瓶1的左上角开有细颈口2，右下角开有连接口3，硅胶垫片5为环形，滤膜7规格为0.22μm。

将两个三角培养瓶1、砂芯筛板6、硅胶垫片5及滤膜7高温灭菌，法兰4通过75％酒精消毒并通过紫外照射除菌，将实验装置连接备用。

如图2所示，连接方式为：

细颈口2连接真空抽滤泵，法兰4设置在两个三角培养瓶1的连接口3处，法兰4分为内螺纹一侧与外螺纹一侧，分别置于两个三角培养瓶1的连接口3处，以聚乙烯环固定，以硅胶垫片5、砂芯筛板6、滤膜7、砂芯筛板6、硅胶垫片5的顺序叠放后装入法兰外螺纹一侧，将外螺纹一侧与内螺纹一侧连接并密封。

以拷贝数为6.35×10⁹copies/μl的标准抗性质粒sul1为实验材料，用灭菌水稀释成6.35×10⁵copies/μl。将实验装置的左培养瓶内灌入150ml6.35×10⁹copies/μl质粒溶液，右培养瓶灌入150ml灭菌水，利用真空抽滤泵来回抽吸2个回合，分别在接种后的0，15，30，60min左右两个培养瓶中取样200μl，利用荧光定量pcr测定0，15，30，60min时的样品测定sul1的浓度。

表1质粒sul1定量(copies/μl)测试结果

实验结果说明，本发明中装置不妨碍除细胞之外的物质交换，因此左侧的质粒可以自由的进入右侧并在60min之后达到平衡。

实施例2

通过荧光蛋白标记的抗性菌在实验装置中的转移实验证明本发明可以阻止细胞之间的直接接触。

采用装置与实施例1一致。

以荧光标记的恶臭假单胞菌kt2400为供体菌以抗生素敏感的大肠杆菌atcc25922为受体菌，恶臭假单胞菌kt2400携带有标记了绿色荧光蛋白的广宿主质粒rp4，且该菌染色体则标记了红色荧光蛋白及laciq基因，可表达红色荧光但抑制质粒绿色荧光蛋白的表达，若发生了接合转移，质粒rp4将被转移到受体菌而发绿色荧光。将供受体分别于液体培养基内30℃，160r/min过夜培养。然后以1％的接种量接种于实验装置的左右两个培养瓶的培养基中(150ml)，并将两菌混合培养于250ml三角培养瓶中作为对照，分别在接种后的0，15，30，60min在u型实验装置及三角培养瓶中取样200μl，记uz，uy，mating。其中100μl用于涂布抗性平板，100μl用于激光共聚焦显微镜检测样品的荧光表达。

表2样品抗性计数结果

本发明所使用的供体菌可在抗性平板生长，而受体菌在抗性平板无生长。参照图3，通过奥林巴斯激光共聚焦显微镜fv3000检测样品的荧光表达，以受体菌atcc25932作为没有荧光的阴性对照(图3a)，以供体菌kt2440作为红色荧光阳性对照(图3b，以圆形标记)，选择荧光的激发广谱分别为488nm和561nm，取各实验处理60min时的样品100μl置于共聚焦小皿内，选择相同zoom值检测荧光表达。图3c实验装置右侧样品(图3c)，未见荧光表达，而混合培养的三角瓶(图3d)则检测到了绿色荧光的接合子(以方形标记)，进一步说明装置阻止了供体菌从左端进入右端，阻碍了细胞的直接接触，可用于抗生素抗性菌种抗性基因的水平转移。